Étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux pour la microscopie d’illumination structurée time-lapse

Le protocole permet l’étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriques dans les cellules vivantes et l’étude quantitative de leur mouvement à haute résolution. L’incubation avec le colorant fluorescent ne fait que contourner le besoin de protéines fluorescentes par rapport à l’expression, en évitant les artefacts et les limitations connexes et en permettant à notre protocole d’être appliqué aux cellules non transfectibles. Pour obtenir une coloration nucléoïde préférentielle, il faut utiliser SYBR Gold et rien d’autre dans les conditions que nous avons optimisées.

Sinon, l’ADN cellulaire total peut être souillé. Un jour avant la procédure d’étiquetage, la culture quatre fois 10 à la cinquième cellules HeLa en deux millilitres de milieu dans une boîte de Petri de 35 millimètres. Le lendemain matin, lavez les cellules en deux millilitres de PBS avant d’ajouter un millilitre de milieu de culture libre de phénol et un millilitre de la solution d’étiquetage 2X appropriée.

Après 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, aspirez soigneusement le colorant contenant du surnatant de chaque boîte petri de 35 millimètres et lavez les cellules avec deux millilitres de PBS. Puis nourrir les cellules avec du phénol frais rouge milieu de culture cellulaire libre et retourner la culture à l’incubateur de culture cellulaire protégé de la lumière jusqu’à l’imagerie vivante. Pour l’imagerie cellulaire en direct, au moins une heure avant la séance d’imagerie, placez l’incubateur supérieur sur scène sur l’étape du microscope à éclairage structuré à super résolution et réglez la température à 37 degrés Celsius et la concentration de dioxyde de carbone à 5 %, allumez tous les composants du microscope, y compris les lasers, et choisissez un objectif d’immersion à haute teneur en chiffres, tel que recommandé pour la microscopie d’éclairage structuré super résolution par le fabricant du microscope.

Lorsque les lasers se sont réchauffés, installez la boîte petri de 35 millimètres sur le stade du microscope et utilisez les oculaires pour localiser une zone d’intérêt avec des cellules fixées au fond du plat. Pour acquérir des images de microscopie d’éclairage structuré super résolution, utilisez un électron haut de gamme arrière multipliant la charge couplé caméra dispositif. Dans le logiciel d’acquisition d’images, définissez un gain de multiplication des électrons élevé tel que recommandé pour la caméra.

Avant d’acquérir la série time lapse pour le suivi nucléoïde, acquérir une image de microscopie d’éclairage structuré à deux couleurs super résolution du même champ de vision dans un canal pour la coloration mitochondriale et une autre pour l’or SYBR. Réglez le canal de couleur d’image mitochondrial à l’excitation et à l’émission appropriées pour la tache mitochondriale utilisée et réglez le filtre d’émission approprié d’excitation et de bang Pass pour le colorant d’or SYBR. Réglez la puissance laser la plus faible possible pour les deux canaux.

Si le microscope n’acquiert des canaux que séquentiellement, éteignez le canal pour la détection des taches mitochondriques. détrballer la boîte Z-stack dans le logiciel pour éteindre l’acquisition z-stack pour définir l’acquisition d’un seul plan focal et définir le temps d’exposition caméra le plus court possible. Définissez trois rotations de la grille et acquérez des images bidimensionnelles des cellules étiquetées à plusieurs valeurs d’énergie laser et plusieurs temps d’exposition pour optimiser la puissance laser dans le temps d’exposition de la caméra.

Sélectionnez les temps d’exposition à la puissance laser et à la caméra qui produisent des images de microscopie d’éclairage structurées avec des taches lumineuses dans les mitochondries avec peu ou pas d’artefacts et commencez l’acquisition de la série time lapse en utilisant les paramètres optimisés. Pour l’analyse des images time lapse, ouvrez les images de microscopie d’éclairage structuré converties et un logiciel d’analyse d’image approprié qui dispose d’un module de suivi des taches et cliquez ajouter de nouveaux spots pour démarrer l’assistant de création de spots. Sous l’onglet créer, cliquez sur les taches de piste au fil du temps et passez à la deuxième étape de l’assistant.

Réglez le diamètre x-y estimé à 0,1 à 0,15 micromètre. Cliquez sur la soustraction d’arrière-plan et passez à la troisième étape de l’assistant. Faites glisser la ligne verticale dans l’histogramme pour ajuster le seuil du filtre de qualité jusqu’à ce que la majorité des nucléotides soient détectés car les taches dans les artefacts ne sont pas détectées dans chaque image.

Passez aux quatrième et cinquième étapes de l’assistant et sélectionnez l’algorithme de mouvement autorégressif. Réglez la distance maximale à 0,5 micromètre et la taille maximale de l’écart à zéro. Lorsque les paramètres affinés permettent au logiciel de détecter toutes les taches et de construire correctement les pistes, cliquez sur le bouton flèche maintenant pour confirmer la création des pistes et cliquez sur l’icône statistiques pour extraire les statistiques pistes.

Sélectionnez ensuite les paramètres de statistiques nécessaires et cliquez sur Enregistrer pour exporter les valeurs sous forme de fichiers CSV à points pour la quantification et la visualisation. L’étiquetage avec des concentrations élevées d’or SYBR ou picoGreen entraîne une coloration abondante des noyaux et une coloration punctate dans le cytoplasme. À des concentrations plus faibles, un faible signal d’or SYBR apparaît dans les noyaux dans un modèle de taches lumineuses est observée dans le cytoplasme.

L’étiquetage PicoGreen à faibles concentrations donne surtout des taches nucléaires. La coloration simultanée avec de faibles concentrations d’or SYBR dans un colorant mitochondrial très rouge révèle que presque toute la coloration d’or SYBR se produit dans les mitochondries tandis que l’étiquetage à des concentrations élevées entraîne une coloration significative des noyaux et du cytoplasme. L’imagerie time-lapse révèle qu’après 45 minutes, la coloration nucléoïde est proche de la saturation.

La fixation provoque une légère redistribution du colorant vers le noyau, tandis que la permeablisation des cellules fixes élimine le modèle de coloration pointillée des mitochondries et améliore la coloration nucléaire. Si l’or SYBR est ajouté aux cellules après fixation et permeablization, alors le colorant est distribué uniformément à travers le cytoplasme et le noyau ayant pour résultat la perte de la spécificité de coloration. La formation image 3D de cellules vivantes par microscope structuré d’illumination de super résolution indique le nucléoïde mitochondrique comme taches lumineuses dans les mitochondries.

Le suivi des positions du nucléoïde à une résolution au-delà de la limite de diffraction démontre que la majorité des nucléoïdes présentent des mouvements aléatoires de courte distance qui sont probablement confinés au réseau mitochondrial. Il est important de noter que ce protocole n’est pas compatible avec la fixation de l’échantillon. Cependant, notre protocole devrait être compatible avec un large éventail d’analyses basées sur l’imagerie cellulaire vivante pour l’étude de la morphologie, de la dynamique et des activités des molécules et des organites.

Notre étude illustre les avantages du reciblage des dyes non organiques pour les techniques cellulaires. Il peut inspirer l’exploration d’autres colorants fluorescents pour leur application dans les études cellulaires.