Visualisation de la réplication de l'ADN dans le système DT40 modèle vertébré utilisant la technique de fibre d'ADN

L’objectif global de cette procédure est de visualiser la réplication de l’ADN au niveau de la molécule unique. Commencez par incorporer des analogues nucléotidiques halogénés dans l’ADN nouvellement synthétisé. Dans les cellules vivantes, repérez les cellules avec de l’ADN marqué au microscope.

La lame dépose ensuite les cellules et étire l’ADN sur la lame de microscope. L’immuno-coloration ultérieure des fibres d’ADN et l’analyse des images de microscopie fluorescente peuvent éclairer la dynamique globale de la fourche de réplication pour permettre une analyse quantitative des paramètres qui influencent le programme de réplication global. Au cours des dernières années, différentes versions de la fibre d’ADN Fluor ont été développées pour visualiser le mouvement de la fourche de réplication individuelle au sein des cellules vivantes.

Cette expérience in vivo dans des cellules DT 40 que vous êtes sur le point d’assister peut être réalisée en une journée et ne nécessite que de l’équipement de laboratoire général et un microscope fluorescent démontrant la procédure sera le Dr Rebecca Schwab, postdoctorante pour mon laboratoire. Afin de marquer les cellules DT 40 in vivo, il faut commencer par une culture à croissance exponentielle. Ajouter l’étiquette IDU à une concentration finale de 25 micromolaires et mélanger la suspension cellulaire.

Bien incuber les cellules pendant 20 minutes à 38 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, ajoutez l’étiquette CLDU à une concentration finale de 250 micromolaires. Mélangez et incubez la suspension cellulaire.

Lavez maintenant les cellules DT 40 avec du PBS reus glacé. Suspendez les pastilles de cellules dans du PBS froid et conservez les cellules marquées sur de la glace. Placez deux microlitres de suspension cellulaire sur une extrémité de la lame de verre, séchez à l’air libre jusqu’à ce que le volume de la goutte soit considérablement réduit, mais pas complètement sec.

Maintenant, ajoutez sept microlitres de solution de lyse des fibres sur la suspension cellulaire et mélangez doucement les solutions en remuant avec une pointe de pipette et incubez pendant deux minutes. Ensuite, inclinez les lames à 15 degrés pour permettre aux fibres de s’étendre le long de la glissière. Une fois que la solution de fibre a atteint le bas de la lame, placez-la horizontalement pour la faire sécher à l’air.

À ce stade, une fine ligne opaque doit être visible le long de la lame. Marquez le début des fibres étirées avec un crayon. Immergez d’abord les lames dans trois à un du méthanol à de l’acide acétique pendant 10 minutes.

Lavez les lames dans de l’eau distillée, puis plongez-les dans de l’acide chlorhydrique 2,5 molaires pendant 80 minutes. Lavez les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes. Recueillir l’excédent de PBS sur une serviette en papier.

Orientez ensuite les diapositives horizontalement. Maintenant, pipetez 5 % BSA dans du PBS sur chaque lame et placez une lamelle de couverture pendant 20 minutes. Déplacez doucement la glissière de couverture vers le bas de la glissière en verre.

Retirez l’excédent de BSA avec une serviette en papier. Ensuite, pipetez 50 microlitres de la solution d’anticorps primaires anti BRDU. Sur chaque diapositive.

Couvrez un jeu avec une lamelle et incubez dans une chambre humidifiée pendant deux heures. Après avoir retiré les lamelles, lavez les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes. Appliquez 50 microlitres de la solution d’anticorps secondaire, positionnez les lamelles et protégez également les lames de la lumière.

Ensuite, incubez pendant une heure. Retirez les lamelles et lavez les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes. Enfin, ajoutez une goutte de support de montage de bouclier vectoriel sur chaque lame.

Appuyez doucement sur une lamelle et retirez l’excès de liquide autour de celle-ci. À l’aide d’une serviette en papier, scellez les lamelles avec du vernis à ongles transparent et séchez-les à l’air. Stockez les diapositives à moins 20 degrés Celsius.

Placez une goutte d’huile d’immersion sur une lame près de la marque de crayon et commencez à localiser les fibres. Éloignez-vous du faisceau principal pour trouver des zones où les fibres sont clairement séparées les unes des autres. Dans une expérience typique, sélectionnez des images en utilisant un seul canal de couleur afin d’éviter le biais.

Prenez ensuite environ 10 photos de chaque échantillon. Déplacez-vous le long de la diapositive pour prendre les différentes photos, car une zone d’une diapositive peut ne pas fournir de longueurs de fibre représentatives ou de structures de réplication. Importez des images dans un programme d’analyse d’images.

Mesurez la longueur des 100 faisceaux de fibres et/ou comptez 150 à 200 structures de réplication différentes. La technique du double marquage des fibres permet de distinguer les différentes structures de réplication. L’ADN nouvellement répliqué peut être visualisé sous forme de lignées d’analogues nucléotidiques marqués par des anticorps.

Ici, une fourche allongée continue est représentée par des signaux rouges et verts adjacents. Les nouveaux événements d’initiation peuvent être divisés en origines qui se sont déclenchées pendant que les cellules étaient incubées avec le premier marqueur et en origines qui se sont déclenchées pendant l’incubation avec le deuxième marqueur. Le premier se compose de signaux verts voisins, de signaux rouges-verts et le second d’une ligne verte. Seulement.

Les événements de résiliation se manifestent par un rouge vert adjacent. Des signaux rouges sont entrecoupés. Les origines sont constituées d’origines consécutives et de signaux de terminaison.

Selon la conception expérimentale, les fourches bloquées ou repliées peuvent être définies soit comme un signal rouge uniquement, soit comme une ligne rouge, suivie d’un court trajet vert. Dans cette expérience, les cellules DT 40 de type sauvage ont une vitesse de fourche moyenne de 0,4 micron par minute. Avec 63 % de fourches en cours, 10 % d’origines, 16 % de fourches bloquées, 8 % de terminaisons et 3 % de fibres intercalées.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser et d’analyser la dynamique de la fourche de réplication dans les cellules DT 40. Cela vous fournira un outil essentiel pour enquêter sur les défauts de réplication de l’ADN.