Visualisation de la réplication de l'ADN dans le système DT40 modèle vertébré utilisant la technique de fibre d'ADN

L'objectif général de cette procédure est de visualiser la réplication de l'ADN au niveau de la molécule unique. Commencez par incorporer des analogues de nucléotides halogénés dans l'ADN nouvellement synthétisé. Chez les cellules vivantes, repérez les cellules contenant de l'ADN marqué sur un microscope.

Faites glisser ensuite les cellules afin d'étirer l'ADN sur la lame de microscope. Une immunomarquage ultérieur des fibres d'ADN et l'analyse d'images de microscopie fluorescente peuvent révéler les dynamiques globales des fourches de réplication, permettant une analyse quantitative des paramètres influençant le programme global de réplication. Au cours des dernières années, différentes versions des techniques de marquage par fluorescence des fibres d'ADN ont été développées pour visualiser le déplacement des fourches de réplication individuelles au sein de cellules vivantes.

Cette expérience in vivo réalisée sur des cellules DT 40 que vous êtes sur le point de voir peut être menée en une journée et ne nécessite que du matériel de laboratoire courant ainsi qu'un microscope à fluorescence. La procédure sera démontrée par le Dr Rebecca Schwab, postdoctorante dans mon laboratoire. Afin de marquer les cellules DT 40 in vivo, commencez avec une culture en croissance exponentielle. Ajoutez le marqueur IDU à une concentration finale de 25 micromolaire et mélangez la suspension cellulaire.

Incuber correctement les cellules pendant 20 minutes à 38 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, ajouter le marqueur CLDU à une concentration finale de 250 micromolaire. Mélanger et incuber la suspension cellulaire.

Procédez maintenant au lavage des cellules DT 40 avec du PBS glacé réutilisé. Suspendez les culots cellulaires dans du PBS froid et maintenez les cellules étiquetées sur de la glace. Déposez deux microlitres de la suspension cellulaire sur une extrémité de la lame en verre et laissez sécher à l’air jusqu’à ce que le volume de la goutte soit fortement réduit, mais pas complètement sec.

À présent, ajoutez sept microlitres de solution de lyse des fibres au-dessus de la suspension cellulaire, puis mélangez délicatement les solutions en agitant avec la pointe d'une pipette et incubez pendant deux minutes. Ensuite, inclinez les lames à 15 degrés afin de permettre aux fibres de s'étaler le long de la lame. Une fois que la solution de fibres a atteint le bas de la lame, placez-la à l'horizontale pour laisser sécher à l'air libre.

À ce stade, une ligne mince et opaque doit être visible le long de la lame. Marquer le début des fibres étirées au crayon. Plonger d'abord les lames dans un mélange de trois parts de méthanol pour une part d'acide acétique pendant 10 minutes.

Lavez les lames dans de l’eau distillée, puis immergez-les dans de l’acide chlorhydrique 2,5 M pendant 80 minutes. Lavez les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes en tamponnant. Absorbez l’excès de PBS avec un papier absorbant.

Ensuite, orientez les lames horizontalement. Ajoutez ensuite au pipet 5 % de BSA dans du PBS sur chaque lame, puis placez une lamelle et incubez pendant 20 minutes. Déplacez doucement la lamelle le long de la lame en verre.

Éliminer l'excès de BSA avec un papier absorbant. Ensuite, pipeter 50 microlitres de la solution d'anticorps primaire anti-BRDU sur chaque lame.

Couvrez une lame avec un coverslip et incubez-la dans une chambre humidifiée pendant deux heures. Après avoir retiré les coverslips, lavez les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes. Appliquez 50 microlitres de la solution d'anticorps secondaire, placez les coverslips, et protégez également les lames de la lumière.

Incuber ensuite pendant une heure. Retirer les lamelles et laver les lames trois fois dans le PBS pendant cinq minutes. Enfin, ajouter une goutte de milieu de montage Vector Shield sur chaque lame.

Appuyez doucement sur une lame couvre-objet et retirez le liquide excédentaire autour. À l’aide d’un essuie-tout, scellez les lames couvre-objet avec du vernis à ongles transparent et laissez sécher à l’air. Conservez les lames à moins 20 degrés Celsius.

Déposez une goutte d'huile à immersion sur une lame, près de la marque au crayon, et commencez à localiser les fibres. Éloignez-vous du faisceau principal pour trouver des zones où les fibres sont clairement séparées les unes des autres. Dans une expérience typique, sélectionnez les images en utilisant un seul canal de couleur afin d'éviter tout biais.

Ensuite, prendre environ 10 photos de chaque échantillon. Se déplacer le long de la lame pour prendre les différentes photos, car une seule zone de la lame pourrait ne pas fournir des longueurs de fibres ou des structures de réplication représentatives. Importer les photos dans un logiciel d'analyse d'image.

Mesurer les longueurs de 100 tractus fibreux et/ou compter de 150 à 200 structures de réplication différentes. La technique de marquage double des fibres permet de distinguer entre différentes structures de réplication. L'ADN nouvellement répliqué peut être visualisé sous forme de lignes d'analogues de nucléotides marqués par des anticorps.

Ici, un fourgon de réplication en cours d'élongation est représenté par des signaux rouges et verts adjacents. Les nouveaux événements d'initiation peuvent être divisés en origines ayant été activées pendant que les cellules étaient incubées avec la première étiquette, et en origines activées durant l'incubation avec la seconde étiquette. Les premières consistent en des signaux verts, rouges et verts voisins, tandis que les secondes correspondent à une ligne verte uniquement.

Les événements de terminaison se manifestent sous forme de rouge et vert accolés. Des signaux rouges sont disséminés. Les origines consistent en des signaux d'origine et de terminaison consécutifs.

En fonction du plan expérimental, les fourches arrêtées ou effondrées peuvent être définies soit comme un signal rouge uniquement, soit comme une ligne rouge suivie d'un court tractus vert. Dans cette expérience, les cellules de type sauvage DT 40 présentent une vitesse moyenne de progression des fourches de 0,4 micron par minute. Avec 63 % de fourches en cours, 10 % d'origines, 16 % de fourches arrêtées, 8 % de terminaisons et 3 % de fibres dispersées.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment visualiser et analyser la dynamique des fourches de réplication dans les cellules DT 40. Cela vous fournira un outil essentiel pour étudier les défauts de la réplication de l'ADN.