Name: Visualisation de la réplication de lADN dans le système DT40 modèle vertébré utilisant la technique de fibre dADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Découvrez la visualisation de la réplication de l'ADN au niveau moléculaire dans les cellules DT40, un modèle vertébré. Cette technique d'immunomarquage des fibres d'ADN permet d'analyser quantitativement la dynamique des fourches de réplication et les paramètres de synthèse.

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Nous remercions le Dr T. Helleday et le Dr E. Petermann de l&#39;aide pour la technique des fibres ainsi que des membres du laboratoire de discussion utile. WN est soutenu par une bourse de recherche internationale senior de l&#39;Association for Cancer Research International et par le Comité d&#39;État polonais pour la recherche scientifique subvention (165 935 N301).

La méthode décrite ici a été utilisé dans la publication suivante: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 culture cellulaire Matériaux: sérum fœtal bovin (FBS), du sérum de poulet, de pénicilline / streptomycine, 2-mercaptoéthanol, RPMI <ol><li> Préparer milieu de culture cellulaire: ajouter 7% de FBS, le poulet 3% de sérum, 1x pénicilline / streptomycine et 10 pM de 2-mercaptoéthanol à un milieu RPMI. </li><li> DT40 cellules sont cultivées dans des flacons stériles de culture de cellules à 38 ° C et 5% de CO 2 dans un incubateur humidifié. Fractionner les cellules chaque jour à une densité de 5 x 10 5 cellules / ml 6. </li></ol> 2. Marquage in vivo Matériaux: UDI, CldU <ol><li> Préparer des solutions étalons d'analogues de nucléotides: dissoudre UDI à 5 mm et CldU à 2,5 mM dans le milieu. Chauffer les deux solutions brièvement à 60 ° C et jusqu'à ce que le vortex analogue nucléotidiqueUES sont complètement dissous. </li><li> Ajouter UDI à une concentration finale de 25 pM à la croissance exponentielle des cellules DT40 et mélanger la suspension cellulaire ainsi. Incuber les cellules pendant 20 minutes à 38 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Après incubation avec la première étiquette, ajouter CldU à une concentration finale de 250 uM et de traiter les cellules comme décrit dans l'étape précédente. </li><li> Laver les cellules avec de la glace du PBS froid et les remettre en suspension à une concentration de 7,5 x 10 5 cellules / ml dans du PBS froid. Gardez les cellules marquées sur la glace. </li></ol> La procédure d'étiquetage décrites n'est qu'une suggestion et peut être modifié pour répondre aux questions spécifiques. S'il vous plaît se référer à la section de discussion pour plus d'informations sur le design expérimental. 3. Lyse des cellules et l'ADN propagation Matériaux: lames de verre, fibre de solution de lyse <ol><li> Préparer la solution de lyse des fibres: 50 mM d'EDTA et 0,5% de SDS dans 200 mM Tris-HCI, pH 7,5 </li><li spot ul de la suspension cellulaire une extr lame verre. s l pendant minutes ou jusqu ce que le volume goutte est consid r mais non secs.><li> Pipet 7 solution de lyse ul sur le dessus de la suspension cellulaire et remuer doucement avec la pipette pour mélanger les solutions. Incuber pendant 2 minutes pour la lyse cellulaire de procéder. </li><li> Tilt diapositives à 15 ° pour permettre aux fibres de se propager le long de la glissière. </li><li> Une fois la solution fibre a atteint le fond de la diapositive, le placer horizontalement sécher à l'air. Après séchage, une fine ligne opaque devrait être visible le long de la glissière. A ce point, le début de l'fibres étirées doivent être marqués avec un crayon comme après coloration de la ligne ne sera pas visible plus longtemps. Cette marque sera plus tard aider à localiser les fibres sous le microscope. </li></ol> 4. Immunofluorescence Matériaux: Le méthanol, l'acide acétique, l'acide chlorhydrique, BSA 5% dans le PBS, cuvette, anti-BrdU (souris) d'anticorps,anti-BrdU (rat) anticorps, mouton anti-souris Cy3 d'anticorps de chèvre anti-rat Alexa Fluor 488 anticorps, moyennes Vectashield montage, lamelles, vernis à ongles <ol><li> Immerger les lames dans du méthanol / acide acétique (3:1) dans une cuvette et incuber pendant 10 minutes. </li><li> Laver les lames de H 2 O distillée, puis plonger dans HCl 2,5 M pendant 80 minutes. </li><li> Laver les lames trois fois dans du PBS pendant 5 minutes. </li><li> Retirer les lames de la cuvette et de recueillir l'excès de PBS avec une serviette en papier. Placer les lames horizontalement et BSA pipette de 5% sur le dessus de chaque diapositive. Couvrir les lames délicatement avec une lamelle de répandre la BSA uniformément sur la lame et incuber pendant 20 minutes. </li><li> Diluer l'anticorps primaire dans BSA 5% aux concentrations suivantes: 1h25 anti-BrdU (souris) et 1:400 anti-BrdU (rat). </li><li> Déplacer la lamelle doucement la lame de verre pour l'enlever. Ne forcez pas si la lamelle colle à la lame. La lame peut être réhydratés dans du PBS jusqu'à ce que la lamelle se détache uneD peut être retiré avec facilité. Recueillir BSA excédent avec un papier absorbant et placer les diapositives à l'horizontale. Pipeter 50 pl de la solution d'anticorps primaire sur chaque diapositive. Couvrir à nouveau avec une lamelle de répandre la solution d'anticorps uniformément sur la lame et incuber dans une chambre humide pendant 2 heures. </li><li> Après avoir enlevé les lamelles, laver les lames trois fois dans du PBS pendant 5 minutes </li><li> Diluer l'anticorps secondaire BSA 5% aux concentrations suivantes: 1:500 mouton anti-souris Cy3 et 1:400 chèvre anti-rat Alexa Fluor 488. </li><li> Appliquer 50 pl de la solution d'anticorps secondaire comme décrit pour les anticorps primaires. Protéger les diapositives de la lumière et incuber pendant 1 heure. </li><li> Après avoir enlevé les lamelles, laver les lames trois fois dans du PBS pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter une goutte de milieu de montage sur Vectashield chaque diapositive et appliquer une lamelle. Appuyez doucement sur la lamelle et enlever l'excès de liquide autour de lui avec une serviette en papier. Sceller avec des lamelles transparentes ongles polish et les laisser sécher. Stocker les diapositives à -20 ° C. </li></ol> 5. L'acquisition des images Matériaux: la fluorescence microscope, caméra Déposer une goutte d'huile d'immersion sur une lame près de la marque au crayon et commencer localiser les fibres. Typiquement, il ya un faisceau de fibres principaux, mais ces fibres sont trop enchevêtrés et ne peut pas être analysé plus tard. S'éloigner du faisceau principal de trouver des zones où les fibres sont clairement séparées les unes des autres (fig. 2). Nous souhaitons sélectionner des images en utilisant uniquement un canal de couleur afin d'éviter les biais. Ensuite, nous faudrait environ 10 photos de chaque ligne de temps là, la concentration ou de la cellule. Toutefois, le nombre de photos dépend du nombre de fibres peuvent être comptés sur chaque image. Déplacer le long de la glissière de prendre les différentes images, comme un domaine d'une diapositive peut ne pas fournir des longueurs de fibre représentant ou des structures de réplication. 6. L'analyse des données Matériaux: programme d'analyse d'image, par exemple ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) Importer des images dans un programme d'analyse d'image. Mesurer la longueur des faisceaux de fibres et / ou compter les structures de réplication différentes (Fig 3). Ne compter que les fibres qui sont clairement visibles et qui ne s'étendent pas sur le bord de l'image. Nous généralement de mesurer la longueur d'environ 100 fibres et compter 150 à 200 structures de réplication et de nous répéter les expériences individuelles d'au moins trois fois. 7. Les résultats représentatifs: L'ADN nouvellement répliqué peuvent être visualisées sous forme de lignes d'anticorps marqués analogues nucléotidiques. Dans nos expériences une fourche en cours est représentée comme adjacentes signaux rouge et vert (Fig. 3). Le protocole de double marquage nous permet également de définir quatre grandes catégories de structures de réplication: 1) des événements d'initiation de nouvelles peuvent être divId ED sur les origines qui ont tiré alors que les cellules ont été incubées avec la première étiquette et origines qui ont tiré pendant l'incubation avec la deuxième étiquette. Les premiers consistent en voisines vert-rouge-vert et les seconds signaux d'une ligne verte uniquement. 2) événements de résiliation manifester comme attenante rouge-vert-rouge signaux. 3) entrecoupées origines sont des sites dans le génome avec des origines très rapprochées. Ces sites comprennent des origines consécutifs et signaux de terminaison. 4) en fonction de la conception expérimentale, au point mort / fourches effondrée peut être défini comme un signal rouge à seulement 7 ou une ligne rouge suivie d'une courte voies vertes 8,9. En utilisant les conditions décrites ici, les cellules de type sauvage DT40 ont une vitesse moyenne de la fourchette de 0,4 um / min. Nous pouvons détecter environ 63% fourches en cours, des origines à 10%, 16% fourches bloquées (rouge voies seulement), les résiliations de 8% et 3% de fibres entremêlées. Ure 1 "/&gt; . Figure 1 (A) Le côté gauche de la caricature illustre la première étape de la procédure de marquage de l'ADN: l'ajout d'UDI à la croissance exponentielle des cellules DT40 conduit l'analogue nucléotidique pour être facilement intégrés dans les principaux nouvellement synthétisées et le retard des brins d'ADN. Ceci peut être visualisé en utilisant un anticorps spécifique, et apparaîtra comme une ligne rouge lorsqu'on les examine sous le microscope. Par la suite, la même procédure est répétée avec CldU comme indiqué sur le côté droit de la figure. Après incubation avec l'analogue de nucléotides seconde, une fourche active sera visible comme une attenante rouge-vert voies. La longueur de la fibre moyenne est proportionnelle au temps d'incubation de la analogues nucléotidiques. (B) l'ADN de cellules lysées DT40 est étirée par gravité sur une lame de microscope et les analogues de nucléotides incorporés sont visualisés par l'utilisation d'anticorps spécifiques et la microscopie à fluorescence. igure 2 "/&gt; Figure 2. Une image représentative de fluorescence montre des fibres à partir des cellules de type sauvage DT40 suite étiquetés avec UDI et CldU pendant 20 minutes chacun. La plupart des fibres sont bien séparés les uns des autres et peuvent donc facilement être analysés. La barre blanche représente 10 um. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> . Figure 3 La technique de fibre double étiquetage permet de distinguer entre les structures de réplication différentes; 1 - fourches répliquant activement, 2 - de nouveaux sites de réplication de l'ADN (tirs de nouvelles origines), 3 - terminaisons fourche (deux fourchettes convergentes), 4 - fibres entremêlées (sites d'origines rapprochées) et 5 - fourches bloquées (rouge signal seulement).

<ol><li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li>
<li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li>
<li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner%27s+syndrome+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li>
<li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure%3A+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li>
<li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li>
<li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+cell+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li>
<li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint%3A+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Cycle%22%5BJournal%5D)">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li>
<li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous décrivons une méthode qui permet une analyse quantitative des paramètres qui influencent la synthèse de l&#39;ADN lors de la phase S à un niveau molécule unique. Au cours des dix dernières années, différentes versions de la technique de l&#39;ADN fluorographie en fibre ont été développés pour visualiser le mouvement des fourches de réplication individuels au sein des cellules vivantes. Le paramètre critique dans toutes ces techniques est la procédure utilisée pour obtenir le meilleur étirement de l&#39;ADN sur les surfaces en verre offrant fibres d&#39;ADN bien séparées. Une étape cruciale pour parvenir à cela est le temps d&#39;incubation de la suspension cellulaire sur la lame du microscope ainsi que le temps de lyse. Ces paramètres dépendent de la température et le débit dans un laboratoire particulier et doit être déterminé de manière empirique. La partie pratique d&#39;une expérience de fibre d&#39;ADN est en général accompli en une journée. Toutefois, l&#39;acquisition d&#39;image et l&#39;analyse subséquentes est plus beaucoup de temps et exige la pratique. Le protocole de marquage peut être adApted pour répondre à différents problèmes d&#39;ordre scientifique: en utilisant un agent qui inhibe la réplication lors de la deuxième impulsion d&#39;étiquetage des moniteurs allongement de fourche / décrochage en réponse au stress réplicatif. Dans ce scénario, le premier label n&#39;a pas besoin d&#39;être lavés comme le deuxième nucléotide est ajouté en excès. Alternativement, les médicaments qui empêchent la réplication peut être utilisé en combinaison ou juste après l&#39;addition de la première étiquette. Cela nécessite d&#39;abord l&#39;étiquette et la drogue pour être enlevés avant l&#39;analogue de nucléotides secondes est appliquée. Cette procédure permet de déterminer l&#39;importance des différents facteurs sur la stabilité réparation de l&#39;ADN de fourche réplicative / récupération dans des conditions de stress réplicatif (fourche à savoir caler et / ou l&#39;effondrement). Il convient de noter, une analyse plus détaillée des particularités du programme réplication de l&#39;ADN pourrait être effectuée avec l&#39;utilisation d&#39;une combinaison des approches alternatives peignage moléculaire et la fluorescence par hybridation in situ. Ceci, cependant, est techniquement plus difficile et exige dépenseséquipements excessive. La capacité à analyser qualitativement et quantitativement détails de réplication de l&#39;ADN fournit un outil essentiel pour étudier les défauts de réplication de l&#39;ADN lui-même ainsi que les voies qui suppriment l&#39;instabilité génomique associée avec des fourches de réplication. Sans aucun doute, ce test sera une aide supplémentaire pour faire la lumière sur les mécanismes de réplication à médiation réparation de l&#39;ADN qui permettent aux cellules normales pour répondre / s&#39;adapter aux changements environnementaux ainsi que la manière dont les cellules cancéreuses utilisent ces mécanismes de résister à la toxicité des médicaments ciblant les fourches de réplication.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Fetal or sérum bovin (FBS) </td><td> AAP </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de poulet </td><td> Sigma </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> AAP </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-iodo-2&#39;-désoxyuridine (UDI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-chloro-2&#39;-désoxy-uridine (CldU) </td><td> Sigma </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> Lames SuperFrost </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> Couverture glisse No1 </td><td> Suppplies laboratoire scientifique </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield milieu de montage </td><td> H-1000 Vecteur de laboratoire </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;anticorps anti-BrdU (souris) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;anticorps anti-BrdU (rat) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> mouton anti-souris Cy3 </td><td> Sigma </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> chèvre anti-rat Alexa Fluor 488 anticorps </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation de la réplication de l&#39;adn dans le système dt40 modèle vertébré utilisant la technique de fibre d&#39;adn

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintien de la stabilité fourche de réplication est d&#39;une importance capitale pour la division des cellules afin de préserver la viabilité et à prévenir la maladie. Les processus impliqués non seulement assurer la duplication du génome fidèles dans le visage de dommages à l&#39;ADN endogènes et exogènes, mais aussi de prévenir l&#39;instabilité génomique, un facteur reconnu de causalité dans le développement des tumeurs. Ici, nous décrivons un microscope à base simple et rentable de fluorescence méthode pour visualiser la réplication de l&#39;ADN dans le aviaire à cellules B en ligne DT40. Cette lignée cellulaire est un outil puissant pour étudier la fonction des protéines in vivo par génétique inverse dans les cellules de vertébrés 1. Fluorographie fibre de l&#39;ADN dans des cellules dépourvues de DT40 un gène spécifique permet d&#39;élucider la fonction des gènes dans ce produit réplication de l&#39;ADN et la stabilité du génome. Les méthodes traditionnelles pour analyser la dynamique des fourches de réplication dans les cellules des vertébrés reposent sur la mesure du taux global de synthèse d&#39;ADN dans une population de cellules marquées par impulsions. Ceci est une approche quantitative et ne permet pas pour l&#39;analyse qualitative des paramètres qui influencent la synthèse d&#39;ADN. En revanche, le taux de mouvement des fourches active peut être suivie directement en utilisant la technique des fibres d&#39;ADN 2-4. Dans cette approche, l&#39;ADN naissante est étiqueté in vivo par incorporation de nucléotides halogénés (figure 1A). Par la suite, les fibres individuelles sont étirées sur une lame de microscope, et les voies étiqueté réplication de l&#39;ADN sont colorées avec des anticorps spécifiques et visualisé par microscopie à fluorescence (figure 1B). Initiation de la réplication ainsi que la directionnalité fourche est déterminée par l&#39;utilisation successive de deux analogues différemment modifiés. Par ailleurs, l&#39;approche à double étiquetage permet une analyse quantitative des paramètres qui influencent la synthèse de l&#39;ADN lors de la phase S, les structures de la réplication à savoir comme les fourches en cours et calé, la densité origine de réplication ainsi que résiliations fourchette. Enfin, la procédure expérimentale peut être d&#39;accomplired dans la journée, et ne requiert que du matériel de laboratoire général et d&#39;un microscope à fluorescence.

DT40, un système de modèle génétique des vertébrés, fournit un outil puissant pour analyser la fonction des protéines. Nous décrivons ici une méthode simple qui permet l&#39;analyse qualitative des paramètres qui influencent la synthèse d&#39;ADN lors de la phase S dans les cellules DT40 à l&#39;échelle de la molécule unique.

Visualisation de la réplication de l&#39;ADN dans le système DT40 modèle vertébré utilisant la technique de fibre d&#39;ADN

Le maintien de la stabilité des fourches de réplication est d'une importance capitale pour les cellules en division afin de préserver la viabilité et de prévenir les pathologies. Les processus impliqués ne...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser la réplication de l'ADN au niveau de la molécule unique. Commencez par incorporer des analogues de nucléotides halogénés dans l'ADN nouvellement synthétisé. Chez les cellules vivantes, repérez les cellules contenant de l'ADN marqué sur un microscope.Faites glisser ensuite les cellules afin d'étirer l'ADN sur la lame de microscope. Une immunomarquage ultérieur des fibres d'ADN et l'analyse d'images de microscopie fluorescente peuvent révéler les dynamiques globales des fourches de réplication, permettant une analyse quantitative des paramètres influençant le programme global de réplication. Au cours des dernières années, différentes versions des techniques de marquage par fluorescence des fibres d'ADN ont été développées pour visualiser le déplacement des fourches de réplication individuelles au sein de cellules vivantes.Cette expérience in vivo réalisée sur des cellules DT 40 que vous êtes sur le point de voir peut être menée en une journée et ne nécessite que du matériel de laboratoire courant ainsi qu'un microscope à fluorescence. La procédure sera démontrée par le Dr Rebecca Schwab, postdoctorante dans mon laboratoire. Afin de marquer les cellules DT 40 in vivo, commencez avec une culture en croissance exponentielle. Ajoutez le marqueur IDU à une concentration finale de 25 micromolaire et mélangez la suspension cellulaire.Incuber correctement les cellules pendant 20 minutes à 38 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, ajouter le marqueur CLDU à une concentration finale de 250 micromolaire. Mélanger et incuber la suspension cellulaire.Procédez maintenant au lavage des cellules DT 40 avec du PBS glacé réutilisé. Suspendez les culots cellulaires dans du PBS froid et maintenez les cellules étiquetées sur de la glace. Déposez deux microlitres de la suspension cellulaire sur une extrémité de la lame en verre et laissez sécher à l’air jusqu’à ce que le volume de la goutte soit fortement réduit, mais pas complètement sec.À présent, ajoutez sept microlitres de solution de lyse des fibres au-dessus de la suspension cellulaire, puis mélangez délicatement les solutions en agitant avec la pointe d'une pipette et incubez pendant deux minutes. Ensuite, inclinez les lames à 15 degrés afin de permettre aux fibres de s'étaler le long de la lame. Une fois que la solution de fibres a atteint le bas de la lame, placez-la à l'horizontale pour laisser sécher à l'air libre.À ce stade, une ligne mince et opaque doit être visible le long de la lame. Marquer le début des fibres étirées au crayon. Plonger d'abord les lames dans un mélange de trois parts de méthanol pour une part d'acide acétique pendant 10 minutes.Lavez les lames dans de l’eau distillée, puis immergez-les dans de l’acide chlorhydrique 2,5 M pendant 80 minutes. Lavez les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes en tamponnant. Absorbez l’excès de PBS avec un papier absorbant.Ensuite, orientez les lames horizontalement. Ajoutez ensuite au pipet 5 % de BSA dans du PBS sur chaque lame, puis placez une lamelle et incubez pendant 20 minutes. Déplacez doucement la lamelle le long de la lame en verre.Éliminer l'excès de BSA avec un papier absorbant. Ensuite, pipeter 50 microlitres de la solution d'anticorps primaire anti-BRDU sur chaque lame.Couvrez une lame avec un coverslip et incubez-la dans une chambre humidifiée pendant deux heures. Après avoir retiré les coverslips, lavez les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes. Appliquez 50 microlitres de la solution d'anticorps secondaire, placez les coverslips, et protégez également les lames de la lumière.Incuber ensuite pendant une heure. Retirer les lamelles et laver les lames trois fois dans le PBS pendant cinq minutes. Enfin, ajouter une goutte de milieu de montage Vector Shield sur chaque lame.Appuyez doucement sur une lame couvre-objet et retirez le liquide excédentaire autour. À l’aide d’un essuie-tout, scellez les lames couvre-objet avec du vernis à ongles transparent et laissez sécher à l’air. Conservez les lames à moins 20 degrés Celsius.Déposez une goutte d'huile à immersion sur une lame, près de la marque au crayon, et commencez à localiser les fibres. Éloignez-vous du faisceau principal pour trouver des zones où les fibres sont clairement séparées les unes des autres. Dans une expérience typique, sélectionnez les images en utilisant un seul canal de couleur afin d'éviter tout biais.Ensuite, prendre environ 10 photos de chaque échantillon. Se déplacer le long de la lame pour prendre les différentes photos, car une seule zone de la lame pourrait ne pas fournir des longueurs de fibres ou des structures de réplication représentatives. Importer les photos dans un logiciel d'analyse d'image.Mesurer les longueurs de 100 tractus fibreux et/ou compter de 150 à 200 structures de réplication différentes. La technique de marquage double des fibres permet de distinguer entre différentes structures de réplication. L'ADN nouvellement répliqué peut être visualisé sous forme de lignes d'analogues de nucléotides marqués par des anticorps.Ici, un fourgon de réplication en cours d'élongation est représenté par des signaux rouges et verts adjacents. Les nouveaux événements d'initiation peuvent être divisés en origines ayant été activées pendant que les cellules étaient incubées avec la première étiquette, et en origines activées durant l'incubation avec la seconde étiquette. Les premières consistent en des signaux verts, rouges et verts voisins, tandis que les secondes correspondent à une ligne verte uniquement.Les événements de terminaison se manifestent sous forme de rouge et vert accolés. Des signaux rouges sont disséminés. Les origines consistent en des signaux d'origine et de terminaison consécutifs.En fonction du plan expérimental, les fourches arrêtées ou effondrées peuvent être définies soit comme un signal rouge uniquement, soit comme une ligne rouge suivie d'un court tractus vert. Dans cette expérience, les cellules de type sauvage DT 40 présentent une vitesse moyenne de progression des fourches de 0,4 micron par minute. Avec 63 % de fourches en cours, 10 % d'origines, 16 % de fourches arrêtées, 8 % de terminaisons et 3 % de fibres dispersées.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment visualiser et analyser la dynamique des fourches de réplication dans les cellules DT 40. Cela vous fournira un outil essentiel pour étudier les défauts de la réplication de l'ADN.

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Visualisation des intermédiaires de réplication induite par les UV dans les E. coli En utilisant deux dimensions agarose gel Analyse

Procédé pour l'analyse quantitative de la réplication du chromosome de synchronisation est décrit. La méthode utilise l'incorporation de BrdU en combinaison avec...

Timing chromosome Réplication Combiné avec fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Nous décrivons ici un système utilisant un bloc protéique in vivo réversible spécifique au site pour bloquer et effondrer les fourches de réplication chez Escherichia coli. L’établissement du bloc de réplication est évalué par microscopie à fluorescence et l’électrophorèse sur gel d’agarose neutre-neutre est utilisée pour visualiser les intermédiaires de réplication.

Induire un blocage du site de réplication spécifique dans<i&gt; E. coli</i&gt; Utilisation d&#39;un système fluorescent répresseur opérateur

Ce protocole présente une technique de cartographie à haute résolution des sites de réplication dans la chromatine structurellement préservée in situ qui utilise une combinaison de marquage pré-intégration EdU-streptavidin-Nanogold et ChromEMT.

Imagerie des domaines réplicatifs dans la chromatine ultrastructurellement préservée par tomographie électronique

La méthodologie aide à l’analyse de la variation de la dynamique de réplication de l’ADN en présence de nanoparticules. Différentes méthodologies peuvent être adoptées en fonction du niveau de cytotoxicité du matériau d’intérêt. En outre, une description de l’analyse de l’image est fournie pour aider à l’analyse des fibres d’ADN.

Démonstration du test de fibre d’ADN pour étudier les dommages à l’ADN et la dynamique de réparation induits par les nanoparticules

Ce protocole démontre la réalisation d’un test sur une seule molécule pour la visualisation en direct du déroulement de l’ADN par l’hélicase CMG. Il décrit (1) la préparation d’un substrat d’ADN, (2) la purification de l’hélicase CMG de Drosophila melanogaster marquée par fluorescence, (3) la préparation d’une cellule d’écoulement microfluidique pour la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) et (4) le test de déroulement de l’ADN à molécule unique.

Visualisation en temps réel d’une molécule unique du déroulement de l’ADN par CMG Helicase

Ici, nous décrivons la procédure d’analyse de la progression de la réplication à travers des répétitions pathogènes et sujettes à la structure à l’aide de l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle.

Analyse électrophorétique de la réplication à travers des répétitions d’ADN à structure variable dans l’épisome humain basé sur SV40

Ce protocole décrit un test de réplication de l’ADN à molécule unique basé sur la microscopie à fluorescence, permettant de visualiser en temps réel les interactions entre les ADN polymérases et les obstacles tels que les structures G-quadruplex.

Visualisation par fluorescence d’une seule molécule de la dynamique de l’ADN polymérase au niveau des G-quadruplexes

Découvrez la visualisation de la réplication de l'ADN au niveau moléculaire dans les cellules DT40, un modèle vertébré. Cette technique d'immunomarquage des fibres d'ADN permet d'analyser quantitativement la dynamique des fourches de réplication et les paramètres de synthèse.

Visualisation de la réplication de l'ADN dans le système DT40 modèle vertébré utilisant la technique de fibre d'ADN

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