Name: Dosage β-amyloïde toxicité utilisant un transgéniques C. elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Découvrez un dosage de toxicité du peptide bêta-amyloïde utilisant un modèle transgénique de Caenorhabditis elegans avec expression musculaire inducible par température. Cette méthode permet un criblage rapide et économique de modificateurs pharmacologiques ou génétiques.

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Nous tenons à remercier les membres actuels et anciens du laboratoire Lien qui a aidé à développer les protocoles décrits ici, en particulier Gin Fonte, qui a développé la procédure initiale. Ce travail a été soutenu par des prix du NIH (AG12423) et l&#39;Association Alzheimer (prix Zenith) au CDL

1) Préparation de nématodes médias Croissance plaques pour le dosage de la paralysie. Paralysie des dosages sont effectués sur la norme de croissance des médias nématode (NGM) plaques utilisées en routine pour C. elegans de propagation et de la génétique (Stiernagle, 2006). <ol><li> Autoclave la solution contenant NaCl NGM, Agar et peptone dans un erlenmeyer et ajouter la quantité appropriée de stériles CaCl 2, l'uracile, cholestérol, 1M MgSO 4 et 1M KPO 4. Aliquote de 10 ml de liquide dans chaque NGM 60 mm x 15 mm boîte de Pétri. Autoriser NGM à solidifier la nuit à température ambiante. </li><li> Si les tests pour les effets de composés / extraits, partie aliquote de l'extrait sur chaque assiette et l'utilisation d'un épandeur à répartir uniformément l'extrait sur la surface de la plaque. Laissez sécher une nuit d'extrait à température ambiante. Les volumes de plus de 1 mL, il faudra plus de temps à sécher. </li><li> Spot chaque assiette avec 250 pi de E. OP5O coli souche cultivée dans les médias LB nuit pour une densité optique de 0,4-0,6. Permettent aux bactéries de sécher une nuit à température ambiante. </li></ol> Les variables pertinentes L'âge des plaques a un effet significatif sur le dosage de la paralysie, car les anciennes plaques ont tendance à sécher. Utiliser des plaques versé dans la semaine du dosage paralysie. Pour des résultats optimaux, verser les plaques 3-4 jours avant l'initiation des populations de vers synchrone [voir (2) ci-dessous]. Pour toute expérience, utilisez uniquement des plaques versé à partir du même lot. Modifier la taille de la pelouse (ie repéré vs propagation) et / ou le type de bactéries va également modifier le comportement des vers. Paralysie des dosages peuvent être effectués en utilisant d'autres E. coli comme source de nourriture (par exemple, la souche HT115 utilisées dans l'alimentation des expériences ARNi), mais cela peut changer la cinétique de la paralysie, ce qui nécessite des contrôles internes appropriés. 2) Préparation des populations de vers à l'âge synchrones Strain CL4176 (SMG-1 (cc546 ts) I; dvIs27 [myo-3 / Aßi minigène + rol-6 du gène marqueur (su1006)] X est le plus couramment utilisé pour le dosage de Aß induite par la paralysie Cette souche et d'autres modèles transgéniques sont disponibles. aux chercheurs universitaires pour une somme modique à partir du Centre de Caenorhabditis Génétique (http://www.cbs.umn.edu/CGC/). <ol><li> Afin de maximiser la synchronie âge de la population test, il est préférable de commencer avec une génération synchronisée parentale. Une semaine avant l'ouverture de la paralysie de dosage de la population d'essai, utiliser un sélecteur de ver de platine pour le transfert de 20 à 30 adultes gravides sur plusieurs plaques de 10 cm NGM répandit avec OP50 pour un oeuf 2 heures était à 16 ° C (la température permissive pour CL4176 ). Retirez les adultes gravides et de permettre la progéniture de grandir pendant 7 jours, date à laquelle ils seront "deuxième journée" adultes gravides. </li><li> (Jour 1) La deuxième journée des adultes gravides sont utilisées pour préparer les populations critère de l'âge synchrone. Pour chaque condition expérimentale de l'objet est de générer des plaques en triple contenant de 50 à 75 ans-synchrone vers. Utilisation d'un sélecteur de ver de platine, le transfert 10-12 du 2 jours adultes gravides sur 60 mm (10 ml de volume) plaques NGM tacheté de OP50. Autoriser les vers à pondre des oeufs à 16 ° C pendant 2 heures, puis enlever les adultes et de permettre aux oeufs d'éclore et grandir à 16 ° C. À ce stade, il est préférable d'avoir quelqu'un qui ne sera pas marquer les plaques pour les coder, de sorte que le meilleur buteur sera aveugle aux conditions expérimentales. </li></ol> Les variables pertinentes Le stade de développement embryonnaire lorsque les œufs sont pondus (~ le stade de 26 cellules pour des vers de type sauvage dans des conditions optimales) est une fonction de l'âge adulte et la nutrition. Si les adultes gravides utilisé pour la préparation de la population de test sont plus âgés ou morts de faim, les oeufs ultérieurement seront portées, en réduisant la synchronie âge de la population et de la reproductibilité de la cinétique de la paralysie. Il est essentiel que les mono-axéniques (c'est à dire, seulement OP50 bactéries) les cultures sont utilisés (les contaminants microbiens peuvent gravement affecter ce test), et la reproductibilité est plus élevé si les plaques triple ont le même nombre de vers. 3) induction Transgene et Assay Paralysie <ol><li> (Jour 3) plaques monter les rapports jusqu'à 25 ° C 48 heures après la fin de l'œuf synchrones laïque; les vers doivent être au troisième stade larvaire (L3). Les plaques doivent être disposées sans empiler dans un incubateur à 25 ° C pour permettre toutes les plaques d'atteindre 25 ° C dans le même temps. </li><li> (Jour 4) Commencez notation de la paralysie de vers (souche CL4176) à 18-20 heures après le début du changement de vitesse. À ce stade, tous les vers de la population devraient avoir atteint les larves de quatrième (L4) scène. Continuer score à deux heures par incréments jusqu'à ce que tous les vers sur chacune des plaques sont paralysés. Pour des raisons inconnues, la paralysie est même pas sur toute la longueur du corps: la tête de la région est la dernière partie du ver de cesser de bouger. Ainsi, wORMULAIRES qui ont récemment lancé une paralysie ne peut pas traduire à travers la plaque, mais peut se déplacer de leur tête, ouvrant ainsi les bactéries autour de leurs antérieure et en laissant un «halo» de bactéries effacés. Ces vers immanquablement devenir complètement paralysé, et donc des vers avec des halos sont classés comme paralysé. Certains vers n'aurez pas de halos, mais ne sera également pas montrer le mouvement spontané; ils sont testés par les aiguillonner avec le sélecteur de ver. Si un ver poussés ne peuvent pas subir une propagation complet du corps vague après insistance, il est aussi marqué que paralysé. Pour la notation efficace, il est plus facile de déplacer les vers paralysée à un secteur sans tache de la plaque de sorte qu'ils ne seront pas involontaire réécrite de la période de cotation suivant. (Cela permet aussi mal classé des vers afin de démontrer le mouvement, permettant une correction notation). </li><li> Pour générer une courbe de la paralysie, à chaque point de la fraction de vers sur chaque assiette qui n'ont pas été paralysée est convertie en un pourcentage, et la moyenne "paralysés" pourcentage est fonction du temps de l'initiation monter les rapports. (La justification de comploter dans ce sens est que la courbe obtenue est formellement analogue à une courbe de survie, et peuvent donc être analysés en utilisant la norme statistiques de survie non paramétriques.) </li></ol> Les variables pertinentes La montée des rapports de vers myo-3/Aβ transgéniques doit se produire avant qu'elles n'atteignent le stade de la mi L4 pour la paralysie d'être initié, comme le myo-3 promoteur est régulée par le développement, et a considérablement réduit son expression dans L4 en retard ou des vers adultes. De même, l'expression de ce transgène est bloqué si les vers deviennent affamés, il est donc essentiel que les vers sont bien nourris tout au long de l'expérience. Nous n'avons jamais observé un ver paralysés de récupérer dans n'importe quelles conditions, et après 12 à 16 h de monter les rapports, toutes CL4176 vers se paralyser, même si elles sont downshifted à 16 ° C. Dans la souche CL4176, régulation à la hausse suffisante de l'expression du transgène pour provoquer la paralysie peut survenir à des températures plus basses (ie, 20-25 ° C) même si le calendrier de paralysie sera modifié. Le taux de paralysie dépend de la souche spécifique transgéniques utilisées (nous avons construit des souches myo-3/Aβ avec les deux taux plus rapide et plus lent que CL4176), donc avec des souches de la fenêtre de notation alternatifs peuvent avoir besoin d'être ajustée. Résultats Représentant 4) Montre la figure 1 est un tracé d'une courbe de la paralysie pour CL4176, à la fois non traitées et exposées à 6,27 mM de caféine (concentration finale dans la plaque NGM). Ce traitement conduit à un retard statistiquement très significative de la paralysie d'environ 4 heures, que nous interprétons comme une indication de la suppression de la toxicité Aßi dans ce modèle. Montre la figure 2 est une expérience indépendante dosant les effets de cafestol, un autre composé qui se trouve dans le café. Cette parcelle est typique pour des traitements qui n'ont pas d'impact toxicité Aß. Notez que dans les deux expériences environ la moitié des populations traitées CL4176 sont paralysés à 24 heures, et la paralysie est complète en 28 h. Ces délais sont typiques de la paralysie de contrôle CL4176 populations. Des écarts significatifs à partir de ce moment sont révélateurs de modifier les conditions environnementales ou la suppression spontanée des copies du transgène. (CL4176 contient un tableau de chromosomes intégrée transgéniques avec plusieurs copies du transgène myo-3/Aβ. Bien que ce tableau transgénique est normalement très stable, toute propagation de la souche à des températures&gt; 16 ° C sélectionnera pour les vers rares qui ont subi une suppression spontanée des transgènes, résultant en des variantes qui aura réduit l'expression Aßi et les résultats de paralysie plus lent.) <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Courbe de paralysie pour la souche CL4176 les vers non traités ou exposés à la caféine 6,27 mM (Sigma). Les délais indiqués sont de l'initiation du changement de vitesse de la température. Les barres d'erreur = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Les barres d'erreur courbe de la paralysie pour CL4176 vers exposés à 0,48 mM cafestol (Sigma). = SEM

<ol><li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer%27s+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li>
<li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li>
<li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid+beta-peptide+%281-42%29+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li>
<li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li>
<li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li>
<li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li>
<li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li>
</ol>

Le protocole que nous avons décrits peuvent être utilisés efficacement pour doser les effets des composés sur la toxicité Aß. Publié exemples incluent les effets des constituants d&#39;extrait de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) et la réserpine (Arya et al. 2009). Les composés qui ont été protection contre la toxicité Aßi dans d&#39;autres systèmes ont également été montré pour avoir un effet protecteur dans ce modèle (par exemple, la mémantine, nos résultats non publiés). Une justification importante pour l&#39;établissement de ce modèle est que les outils bien développés génétiques et moléculaires disponibles en C. elegans peut être utilisée pour étudier les mécanismes de toxicité Aß. Ainsi, les mutations des effets spécifiques sur la toxicité Aßi peut être dosée (par exemple, l&#39;effet de réduire insulin-like de signalisation par l&#39;introduction d&#39;un daf-2 avec perte de fonction de mutation, Florez-McClure et al. 2007), et ce modèle peut également être utilisé pour examiner les effets de la sur-expression des transgènes (Fonte et al. 2008). Nous avons récemment fait un large usage de ce modèle pour étudier les effets sur la toxicité de simples substitutions d&#39;acides aminés dans les Aß (données non publiées). Le modèle transgénique décrite ici l&#39;effet des dosages d&#39;expression Aßi aiguë sur la fonction des cellules musculaires. Au moment de la paralysie des cellules musculaires et de leurs sarcomères sont intacts; le phénotype paralysie n&#39;est pas le résultat de la mort des cellules musculaires. Cependant, après la paralysie (~ 48 heures après la montée des rapports initiaux) il ya une rupture de l&#39;intégrité musculaire et la mort éventuelle des vers. Nous n&#39;avons pas enquêté sur cet effet en aval d&#39;expression Aßi ou utilisé comme un marqueur de toxicité. Le modèle expression inductible Aßi décrite ici n&#39;est pas appropriée pour enquêter sur les traitements qui modulent β-amyloïde la formation en soi. Bien que les vers transgéniques avec la forme Aßi expression constitutive des dépôts amyloïdes facilement détectables (Fay et al 1998;.. Link et al 2001), les vers transgéniques à expression inductible Aßi ont rarement des dépôts amyloïdes et le phénotype de paralysie apparaît indépendante des dépôts amyloïdes (Drake et coll. 2003). Nos résultats sont cohérents avec l&#39;idée que la toxicité aiguë de l&#39;expression des résultats induits Aßi de l&#39;accumulation de Aß oligomériques solubles, pas de dépôts amyloïdes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Quantity/2L </td><td> Société / Catalogue # </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 6g </td><td> Sigma-Aldrich / S9888 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> 40g </td><td> Sigma-Aldrich / A7002 </td><td></td></tr><tr><td> Peptone </td><td> 5g </td><td> Sigma-Aldrich / P0556 </td><td></td></tr><tr><td> ddH 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 2mL </td><td></td><td> 147.02mg/mL dans le trou DDH 2 O </td></tr><tr><td> Uracile </td><td> 2mL </td><td></td><td> 2mg/mL dans le trou DDH 2 O </td></tr><tr><td> Cholestérol </td><td> 2mL </td><td></td><td> 5mg/mL dans de l&#39;éthanol (ne pas autoclave) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 2mL </td><td></td><td> 246.5mg/mL dans le trou DDH 2 O </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50mL </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4. ML, 48 mg K2HPO4/mL dans le trou DDH 2 O, le pH </td></tr><tr><td> Erlenmeyer </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

dosage β-amyloïde toxicité utilisant un transgéniques c. elegans</emmodèle>

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

L&#39;accumulation du peptide β-amyloïde (Aß) est généralement considéré comme central pour l&#39;induction de la maladie d&#39;Alzheimer, mais le mécanisme pertinent (s) de toxicité sont encore mal connus. Aßi est également déposée par voie intramusculaire dans myosites à inclusions, une myopathie sévère humaine. Le elegans intensément étudié ver nématode Caenorhabditis transgénique peut être modifié pour exprimer Aßi humaine. Selon le tissu ou le calendrier d&#39;expression Aßi, vers transgéniques peuvent avoir des phénotypes facilement mesurables qui servent comme une lecture de la toxicité Aß. Par exemple, des vers transgéniques à expression pan-neuronal Aßi avoir des défauts est l&#39;apprentissage associatif (Dosanjh et al 2009.), Tandis que les vers transgéniques avec des muscles spécifiques à l&#39;expression constitutive montrent une progressive, dépendant de l&#39;âge phénotype paralysie (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Un particulièrement utile C. elegans modèle emploie une mutation thermosensible dans le système de surveillance à l&#39;ingénieur d&#39;expression d&#39;ARNm musculaire inductible par la température d&#39;un transgène Aßi, résultant en un phénotype de paralysie reproductibles lors de changement de vitesse de la température (Link et al. 2003). Les traitements qui Aßi contrer la toxicité de ce modèle [par exemple, l&#39;expression d&#39;un transgène de protection (Hassan et al. 2009) ou l&#39;exposition à des extraits de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] reproductible modifier le taux de paralysie induite par monter les rapports de température de ces transgéniques des vers. Nous décrivons ici notre protocole pour mesurer le taux de paralysie dans ce transgéniques C. modèle elegans, avec une attention particulière aux variables expérimentales qui peuvent influencer cette mesure.

Le ver nématode intensément étudié<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Peut être transgénique conçue pour exprimer la β-amyloïde humaine peptide (Aß). Expression induite de Aß dans le<em&gt; C. elegans</emMusculaire&gt; conduit à une rapide, une paralysie phénotype reproductible qui peut être utilisé pour surveiller les traitements qui modulent la toxicité Aß.

Dosage β-amyloïde toxicité utilisant un transgéniques C. elegans</emModèle>

L'accumulation du peptide bêta-amyloïde (Aβ) est généralement considérée comme étant au cœur de l'induction de la maladie d'Alzheimer, mais les...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer la toxicité du peptide bêta-amyloïde dans un système modèle InVivo. La reproductibilité et la simplicité relative de ce test permettent un criblage rapide de médicaments, de conditions environnementales ou de modifications génétiques sur la toxicité du peptide bêta-amyloïde. Un facteur clé dans le développement de ce test est la génération de vers transgéniques de cl egan's avec une expression inductible par la température, spécifique aux muscles, du peptide bêta-amyloïde.Cette expression sensible à la température est obtenue en construisant un transgène contenant une région non traduite trois prime anormalement longue, rendant l'ARNm du transgène cible du système de surveillance de l'ARNm. L'expression de ce transgène est donc faible chez les vers de type sauvage possédant un système de surveillance de l'ARNm fonctionnel, en raison de la dégradation de l'ARNm du transgène. Si ce transgène est introduit dans un fond génétique porteur d'une mutation dans un composant essentiel du système de surveillance de l'ARNm, l'expression du transgène sera nettement plus élevée. Si le fond génétique contient une mutation sensible à la température dans le système de surveillance de l'ARNm, alors la propagation de cette souche transgénique à la température non permise bloquera la dégradation de l'ARNm du transgène et entraînera une forte expression du transgène. Chez les vers transgéniques utilisant ce système pour réguler l'expression du peptide bêta-amyloïde dans les muscles pariétaux, une augmentation de la température de 16 degrés Celsius à 25 degrés Celsius provoque une accumulation importante du peptide bêta-amyloïde, un dysfonctionnement des cellules musculaires et la paralysie des vers. Mesure du temps.Il faut une population de ces vers trenchgéniques pour devenir paralysés après une augmentation de température. Le test d'augmentation de température constitue un dosage sensible de la toxicité du bêta-amyloïde. Ceci est réalisé en préparant des boîtes fraîches de milieu de croissance pour nématodes destinées au dosage de la paralysie, ce qui permet de minimiser les variables environnementales pouvant influencer les taux de paralysie.En second lieu, des populations âgées et synchronisées de vers transgéniques sont initiées, ce qui minimise les effets du stade de développement sur l'expression du transgène. Ensuite, des vers synchronisés au troisième stade larvaire sont transférés d'une température de 16 degrés Celsius à 25 degrés Celsius, ce qui augmente la stabilité de l'ARNm du transgène et conduit à l'accumulation du peptide bêta-amyloïde. La mesure du temps entre le transfert thermique et la paralysie de chaque ver permet d'évaluer la vitesse de dysfonction musculaire, permettant ainsi de tester les effets toxiques de l'accumulation du peptide bêta-amyloïde. Des résultats sont ainsi obtenus, montrant l'effet de traitements spécifiques sur la toxicité du peptide bêta-amyloïde exprimé de façon endogène.Ainsi, le principal avantage de notre technique, par rapport à l'utilisation de modèles de souris transgéniques pour évaluer l'activité d'un médicament, est que nous pouvons réaliser notre méthode beaucoup plus rapidement et à moindre coût. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. L'évaluation des vers L4 dans un test de paralysie est très difficile à apprendre.Ainsi, lorsque vous évaluez un ver paralysé de stade L4, vous devez observer le mouvement isolé en halo de la région céphalique du ver. Dès que cette partie bouge alors que tout le corps du ver est paralysé, vous comptez ce ver comme étant paralysé. Les essais de paralysie sont réalisés sur des boîtes contenant le milieu standard de croissance des nématodes, ou NGM, couramment utilisé pour la propagation et l'analyse génétique de C. elegans.Pour préparer les plaques, stériliser par autoclavage la solution de NGM contenant du chlorure de sodium, de l'agar et du peptide dans un flacon Erlenmeyer, puis ajouter les volumes appropriés des solutions stériles suivantes, indiquées dans le protocole écrit joint. Répartir 10 millilitres de NGM liquide dans chaque boîte de Pétri de 60 millimètres sur 15 millimètres. Laisser la NGM durcir toute la nuit à température ambiante.Si l'on teste les effets de composés ou d'extraits, aliquoter l'extrait sur chaque plaque et utiliser un répandeur pour le répartir uniformément sur la surface de la plaque. Laisser les plaques sécher toute la nuit à température ambiante. Les volumes supérieurs à un millilitre nécessiteront davantage de temps pour sécher.Déposer ensuite 250 microlitres de la souche d’E. coli OP50 cultivée pendant une nuit dans du milieu LB jusqu’à une densité optique comprise entre 0,4 et 0,6 sur chaque plaque, puis laisser les bactéries sécher une nuit à température ambiante. L’âge de la plaque influence de manière significative le taux de paralysie, et les plaques plus anciennes ont tendance à se dessécher. Les plaques doivent être préparées moins d’une semaine avant le test de paralysie.Idéalement, vous devez utiliser des boîtes dont la couche de gélose a été coulée trois à quatre jours avant. Toutes les boîtes destinées à la ponte synchrone utilisées dans une expérience doivent provenir du même lot. Modifier la taille de la pelouse bactérienne et/ou le type de bactérie modifie également le comportement des vers. Les tests de paralysie peuvent être réalisés avec des souches alternatives d’E. coli. Par exemple, la souche HT115 est utilisée dans les expériences d’ARNi. Toutefois, cela peut modifier la cinétique du test de paralysie.Par conséquent, vous devez utiliser des contrôles internes appropriés à la souche. La souche CL 476 est la plus couramment utilisée pour tester une paralysie induite par le bêta. Cette souche et d'autres modèles transgéniques sont disponibles pour les chercheurs académiques, moyennant des frais modiques, auprès du Centre génétique Saint Ahadi.Pour maximiser la synchronisation d'âge de la population test, il est préférable de commencer avec une génération parentale synchronisée. Une semaine avant d'initier le test de paralysie de la population test, utilisez un prélèveur de nématodes en platine pour transférer de 20 à 30 adultes gravides sur plusieurs plaques NGM de 10 centimètres.Étaler avec OP50 pour une ponte de deux heures à 16 degrés Celsius, qui est la température permise pour CL4176. Retirer les adultes GR et laisser la descendance se développer pendant sept jours, au bout desquels ils seront des adultes âgés de deux jours. Adultes âgés de deux jours.Les adultes sont utilisés pour préparer les populations témoins âgées synchrones pour chaque condition expérimentale. L'objectif est de générer des plaques en triple exemplaire contenant de 50 à 75 vers âgés de façon synchrone à l'aide d'un prélévateur de vers en platine. Transférez 10 à 12 adultes de deux jours sur des plaques NGM de 60 millimètres ensemencées avec OP50. Laissez les vers pondre leurs œufs à 16 degrés Celsius pendant deux heures, puis retirez les adultes et laissez les œufs éclore et se développer à 16 degrés Celsius.À ce stade, il est préférable que quelqu’un qui ne sera pas chargé de l’évaluation des boîtes les code afin que l’analyse soit effectuée à l’aveugle par rapport aux conditions expérimentales. Le stade de développement embryonnaire au moment où les œufs sont pondus, qui correspond approximativement au stade à 26 cellules pour les vers de type sauvage dans des conditions optimales, dépend de l’âge des adultes et de leur nutrition. Si les adultes soumis à la gravité utilisés pour la ponte sont plus âgés ou ont subi une privation alimentaire, des œufs à un stade plus avancé seront pondus et la population synchronisée ne sera pas obtenue, ce qui affectera la cinétique du test de paralysie.Il est essentiel d'utiliser des cultures bactériennes monogéniques telles que e coli, OP 50, car toute contamination bactérienne peut gravement affecter ce test. La reproductibilité est maximale si vos plaques en triplicata contiennent un nombre similaire de vers pour induire le transgène et réaliser le test de paralysie. Augmenter la température des plaques à 25 degrés Celsius.48 heures après la fin de la ponte synchronisée, les vers doivent se trouver au stade larvaire troisième. Les boîtes doivent être disposées sans être empilées dans un incubateur à 25 degrés Celsius afin de permettre aux boîtes d'atteindre cette température. En même temps, commencez à évaluer la paralysie des vers 18 à 20 heures après le début de la montée en température.À ce stade, tous les vers de la population doivent avoir atteint le quatrième stade larvaire ; poursuivez le comptage par incréments de deux heures jusqu'à ce que tous les vers sur chacune des boîtes soient paralysés. Pour des raisons inconnues, la paralysie ne se répartit pas uniformément sur toute la longueur du corps. La région de la tête est la dernière partie du ver à cesser de bouger.Ainsi, les vers qui ont récemment commencé à être paralysés ne peuvent pas se déplacer sur la plaque, mais peuvent bouger la tête, ce qui leur permet d'éliminer les bactéries autour de leur extrémité antérieure et de laisser un halo de bactéries éliminées. Ces vers deviendront inévitablement complètement paralysés et sont donc caractérisés comme paralysés. Certains vers n'auront pas de halo, mais ne présenteront pas non plus de mouvement spontané.On les teste en les piquant avec le curet à vers. Si un ver piqué ne peut pas effectuer une propagation complète de l'onde corporelle après le piquage, il est également considéré comme paralysé afin d'assurer une évaluation efficace. Il est plus facile de déplacer les vers paralysés vers un secteur non utilisé de la boîte, afin qu'ils ne soient pas évalués par erreur lors du prochain cycle d'évaluation.Cela permet également aux vers mal classés de démontrer des mouvements, permettant ainsi une correction du score pour générer une courbe de paralysie. À chaque point temporel, la fraction de vers sur chaque plaque qui n'ont pas été paralysés est convertie en pourcentage, et le pourcentage moyen non paralysé est tracé en fonction du temps à partir du moment où l'augmentation de température a été initiée. La courbe obtenue est formellement analogue à une courbe de survie et peut donc être analysée à l'aide de statistiques non paramétriques classiques de survie.Le passage des vers transgéniques myo trois A bêta à une température plus élevée doit être effectué au milieu du stade L quatre afin que la paralysie commence. Le promoteur Myo trois est régulé au cours du développement. Une fois que les vers ont atteint le stade L quatre tardif ou l'âge adulte, le niveau d'expression a considérablement diminué.L'expression du transgène est bloquée si les vers sont privés de nourriture, il est donc très essentiel que les vers soient bien nourris tout au long de l'expérience. Nous n'avons jamais observé qu'un ver paralysé récupère, quelle que soit la condition. Après 12 à 16 heures de passage à une température supérieure, CL 41 76 deviendra paralysé, indépendamment du fait que vous le repassiez à 16 degrés ; chez la souche CL 41 76, la surexpression de l'expression du transgène responsable de la paralysie peut survenir à des températures plus basses.Toutefois, veuillez noter que le taux de paralysie sera affecté dans son timing. Le taux de paralysie dépend de la souche transgénique spécifique utilisée. Nous avons construit des souches myo trois A bêta dont le taux de paralysie est plus rapide ou plus lent que celui de la CL 41 76, et par conséquent, vous devez ajuster votre fenêtre d'évaluation pour le test de paralysie en conséquence.On voit ici un graphique de la courbe de paralysie pour CL 4 1 76, non traité et exposé à de la caféine à 6,27 millimolaire. Ce traitement entraîne un retard hautement significatif sur le plan statistique de la paralysie d'environ quatre heures, que nous interprétons comme un indice de la suppression d'une toxicité bêta. Dans ce modèle, cette expérience a évalué les effets d'ol un autre composé présent dans le café.Le tracé est typique des traitements qui n'affectent pas la toxicité bêta. Notez que dans les deux expériences, environ la moitié des populations non traitées de CL 4 1 76 sont paralysées au bout de 24 heures et la paralysie est complète à 28 heures. Ce sont des délais typiques pour la paralysie du témoin.Des écarts significatifs par rapport à ce calendrier chez les populations CL 4 1 7 6 indiquent des conditions environnementales modifiées ou une suppression spontanée de copies du transgène. Consulter le protocole associé pour obtenir des informations supplémentaires sur la souche CL 4 1 7 6. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prendre en compte l'âge des boîtes, le stade de la population de vers et la capacité à évaluer le taux de paralysie des vers.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser ce système à *C. elegans* pour évaluer avec précision la toxicité de l'amyloïde bêta. Vous devriez être en mesure de détecter des effets assez subtils de divers traitements environnementaux ou médicamenteux sur cette toxicité. Les variables que nous avons abordées sont importantes à prendre en compte, car elles vous permettront de réaliser le test de manière très reproductible et avec une cinétique de paralysie constante.Cela est en réalité très important si vous souhaitez comparer vos résultats obtenus dans votre laboratoire à différents moments et par différentes personnes, ou comparer vos résultats à ceux d'autres chercheurs utilisant ce système modèle.

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