Dosage β-amyloïde toxicité utilisant un transgéniques C. elegans

L’objectif général de l’expérience suivante est d’analyser la toxicité du peptide bêta-amyloïde dans un système modèle InVivo. La reproductibilité et la relative simplicité de ce test permettent de tester rapidement des médicaments, des conditions environnementales ou des modifications génétiques sur la toxicité bêta-amyloïde. Un facteur clé dans le développement de ce test est la génération de vers de Ligan transgéniques avec l’expression inductible de la température musculaire du peptide bêta-amyloïde.

Cette expression sensible à la température est modifiée par la construction d’un transgène qui contient une région anormalement longue à trois premières non traduites, faisant de l’ARNm du transgène une cible de la surveillance de l’ARNm L’expression de ce transgène est donc faible chez les vers de type sauvage avec un système de surveillance de l’ARNm fonctionnel en raison de la dégradation de l’ARNm du transgène. Si ce transgène est introduit dans un fond génétique contenant une mutation dans un composant essentiel du système de surveillance de l’ARNm, l’expression du transgène sera significativement plus élevée. Si le patrimoine génétique contient une mutation sensible à la température dans le système de surveillance de l’ARNm, alors la propagation de cette souche trenchgénique à la température non permissive bloquera la dégradation de l’ARNm du gène de tranchée et entraînera une expression élevée des gènes de tranchée utilisant ce système pour réguler l’expression musculaire de la paroi corporelle du peptide bêta-amyloïde augmentant la température de 16 degrés Celsius à 25 degrés Celsius, entraîne une accumulation élevée du peptide bêta-amyloïde, un dysfonctionnement des cellules musculaires et une paralysie des vers mesure du temps.

Il faut une population de ces vers tranchants pour devenir paralysée après la température. Upshift est un test sensible pour la toxicité bêta-amyloïde. Ceci est réalisé en fabriquant des plaques de milieu de croissance de nématodes frais pour le test de paralysie, ce qui aide à minimiser les variables environnementales qui peuvent influencer les taux de paralysie.

Dans un deuxième temps, les populations synchronisées d’âge des vers trenchgéniques ou initiées, cela minimise les effets du stade de développement sur l’expression des transgènes. Ensuite, les troisièmes stades larvaires synchronisés passent de 16 degrés Celsius à 25 degrés Celsius, ce qui augmente la stabilité de l’ARNm transgénique et conduit à l’accumulation du peptide bêta-amyloïde. La mesure du temps entre le passage ascendant et la paralysie pour chaque ver permet de capturer le taux de dysfonctionnement musculaire, ce qui permet de déterminer les effets toxiques de l’accumulation du peptide bêta-amyloïde Les résultats obtenus montrent l’effet de traitements spécifiques sur la toxicité du peptide bêta-amyloïde exprimé de manière endogène.

Ainsi, le principal avantage de notre technique, par rapport à l’utilisation de modèles de souris transgéniques pour tester l’activité des médicaments, est que nous pouvons faire la nôtre beaucoup plus rapidement et beaucoup moins cher. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Le score des vers L quatre dans un test de paralysie est très difficile à apprendre.

Ainsi, lorsque vous marquez un ver L quatre paralysé, ce que vous voulez regarder, c’est le mouvement de halo isolé de la région de la tête du ver. Une fois que celui-ci se déplace et que tout le corps du ver est paralysé, nous considérerions ce ver comme étant paralysé. Les essais sur la paralysie sont effectués sur des plaques de milieu de croissance de nématodes standard ou NGM couramment utilisés pour la propagation et la génétique de CL egan.

Pour préparer les plaques en autoclave, la solution NGM contenant du chlorure de sodium, de la gélose et du peptide dans un erlenmeyer, puis ajouter les quantités appropriées des solutions stériles suivantes qui peuvent être trouvées dans le protocole écrit d’accompagnement. Aliquote 10 millilitres de NGM liquide dans chaque boîte de Pétri de 60 millimètres sur 15 millimètres. Laissez le NGM se solidifier pendant la nuit à température ambiante.

Si vous testez les effets de composés ou d’extraits, aliquotez l’extrait sur chaque plaque et utilisez un écarteur pour le répartir uniformément sur la surface de la plaque. Laissez les plaques sécher toute la nuit à température ambiante. Les volumes supérieurs à un millilitre nécessiteront plus de temps pour sécher.

Ensuite, placez chaque plaque avec 250 microlitres de la souche E coli OP 50 cultivée dans un milieu LB pendant la nuit à une densité optique de 0,4 à 0,6, laissez les bactéries sécher pendant la nuit à température ambiante. L’âge de la plaque a un effet significatif sur le taux de paralysie et, en tant que tel, les plaques plus anciennes ont tendance à se dessécher. Les plaques doivent être versées dans la semaine suivant le test de paralysie.

Idéalement, vous souhaitez utiliser des plaques qui ont été versées trois à quatre jours avant que vos plaques de ponte d’œufs synchrones utilisées dans n’importe quelle expérience devraient toutes provenir du même lot, modifiant la taille de la pelouse et/ou les bactéries modifieront également le comportement des vers. Par exemple, HT one 15 est utilisé dans les expériences sur l’ARNi. Cependant, cela peut modifier la cinétique du test de paralysie.

Par conséquent, vous devez utiliser des contrôles internes qui sont appropriés. CL 476 est le plus souvent utilisé pour le dosage d’une paralysie induite par la bêta. Cette souche et d’autres modèles transgéniques sont disponibles pour les chercheurs universitaires pour une somme modique auprès du Centre génétique de Saint Ahadi.

Pour maximiser la synchronisme d’âge de la population test, il est préférable. Commencez par une génération parentale synchronisée. Une semaine avant de commencer l’essai de paralysie de la population d’essai, utilisez un ramasseur de vers de platine pour transférer 20 à 30 adultes graves sur plusieurs plaques NGM de 10 centimètres.

Étaler avec OP 50 pendant deux heures de ponte à 16 degrés Celsius, qui est la température permissive pour CL 4 1 76. Retirez les adultes GR et laissez la progéniture croître pendant sept jours, après quoi ils seront des adultes graves du deuxième jour. Gravité du deuxième jour.

Les adultes sont utilisés pour préparer les populations d’essai synchronisées selon l’âge pour chaque condition expérimentale. L’objectif est de générer des plaques triples contenant de 50 à 75 vers synchrones d’âge à l’aide d’un ramasseur de vers en platine Transfert 10 à 12 de la journée, deux adultes plus graves sur des plaques NGM de 60 millimètres repérées avec OP 50. Laissez les vers pondre à 16 degrés Celsius pendant deux heures, puis retirez les adultes et laissez les œufs éclore et croître à 16 degrés Celsius.

À ce stade, il est préférable d’avoir quelqu’un qui ne notera pas les plaques pour les coder afin que le score soit aveugle aux conditions expérimentales. Le stade de développement embryonnaire au moment de la ponte des œufs, qui correspond approximativement au stade de 26 cellules pour les vers de type sauvage dans des conditions optimales, est fonction de l’âge adulte et de la nutrition. Si les adultes gravitaires utilisés pour la ponte sont plus âgés ou affamés, les œufs à un stade plus avancé seront pondus et la population synchrone ne sera pas atteinte, ce qui affectera la cinétique de l’essai de paralysie.

Il est essentiel d’utiliser des cultures bactériennes monogéniques telles que e coli, OP 50 car la contamination bactérienne de toute nature peut gravement affecter ce test. La reproductibilité est plus élevée si vos plaques triples ont un nombre similaire de vers pour induire le transgène et effectuer le test de paralysie. Montez les plaques à 25 degrés Celsius.

48 heures après la fin de la ponte synchrone, le ver devrait être au troisième stade larvaire. Les assiettes doivent être disposées sans être empilées dans un incubateur à 25 degrés Celsius pour permettre aux assiettes d’atteindre cette température. Dans le même temps, commencez à évaluer la paralysie des vers 18 à 20 heures après le début du changement de vitesse.

À ce stade, tous les vers de la population devraient avoir atteint le quatrième stade larvaire, continuez à marquer par incréments de deux heures jusqu’à ce que tous les vers sur chacune des plaques soient paralysés. Pour des raisons inconnues, la paralysie n’est pas uniforme sur toute la longueur du corps. La région de la tête est la dernière partie du ver à cesser de bouger.

Ainsi, les vers qui ont récemment commencé la paralysie ne peuvent pas se déplacer à travers la plaque, mais peuvent bouger leur tête, éliminant ainsi les bactéries autour de leur abdomen et laissant un halo de bactéries éliminées. Ces vers deviendront invariablement complètement paralysés et, par conséquent, les vers avec des auréoles sont caractérisés comme paralysés. Certains vers n’auront pas d’auréoles, mais ne montreront pas non plus de mouvement spontané

Ceux-ci sont testés en les poussant avec le ramasseur de vers. Si un ver aiguillonné ne peut pas se propager de l’onde corporelle entière lors de l’aiguillon, il est également considéré comme paralysé pour un score efficace. Il est plus facile de déplacer les vers paralysés vers un secteur non tacheté de la plaque afin qu’ils ne soient pas involontairement réévalués lors de la prochaine période de score.

Cela permet également aux vers mal catégorisés de montrer leur mouvement, ce qui permet à une correction de score de générer une courbe de paralysie. À chaque point temporel, la fraction de vers sur chaque plaque qui n’ont pas été paralysés est convertie en pourcentage, et le pourcentage moyen inégalé est tracé en fonction du temps à partir du moment où le changement de vitesse a été initié. La courbe résultante est formellement analogue à une courbe de survie et peut donc être analysée à l’aide de statistiques de survie non paramétriques standard.

Le changement de vitesse ascendant des vers bêta transgéniques myo trois A doit être effectué au milieu du stade quatre L pour que la paralysie soit initiée. Le promoteur Myo three est régulé par le développement. Une fois que les vers ont atteint la fin de L quatre ou l’âge adulte, le niveau d’expression a été considérablement diminué.

L’expression du transgène est bloquée si les vers sont affamés, il est donc très essentiel que les vers soient bien nourris tout au long de l’expérience. Nous n’avons jamais observé un ver paralysé se rétablir dans quelque condition que ce soit. Après 12 à 16 heures de montée en vitesse, CL 41 76 sera paralysé, que vous le rétrogradiez à 16 degrés en déformation, la régulation à la hausse de l’expression du transgène CL 41 76 qui provoque la paralysie peut se produire à des températures plus basses.

Cependant, veuillez noter que le taux de paralysie sera affecté dans son calendrier. Le taux de paralysie dépend de la souche transgénique spécifique utilisée. Nous avons construit des souches bêta myo trois A qui ont un taux de paralysie plus rapide et plus lent que le CL 41 76, et en tant que tel, vous devez ajuster votre fenêtre de score pour le test de paralysie en conséquence.

On voit ici le graphique d’une courbe de paralysie pour CL 4 1 76, à la fois non traités et exposés à 6,27 millimolaires de caféine. Ce traitement entraîne un retard statistiquement significatif d’environ quatre heures dans la paralysie, ce que nous interprétons comme indiquant la suppression d’une toxicité bêta. Dans ce modèle, cette expérience a testé les effets d’un autre composé présent dans le café.

L’intrigue est typique des traitements qui n’impactent pas une bêta-toxicité. Il convient de noter que dans les deux expériences, environ la moitié des populations non traitées de CL 4 1 76 sont paralysées au bout de 24 heures et la paralysie est complète au bout de 28 heures. Il s’agit de délais typiques pour la paralysie du contrôle.

CL 4 1 7 6 populations des écarts significatifs par rapport à cette chronologie sont révélateurs d’une altération des conditions environnementales ou d’une délétion spontanée de copies du transgène. Voir le protocole d’accompagnement pour plus d’informations sur la souche CL 4 1 76. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de garder à l’esprit l’âge des plaques, le stade de la population de vers et la capacité d’évaluer le taux de paralysie des vers.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’utiliser ce système d’électrolyse pour doser soigneusement la toxicité de la bêta-amyloïde. Vous devriez être en mesure de détecter des effets assez subtils sur cette toxicité d’une variété de traitements environnementaux ou médicamenteux. Il est important de prêter attention aux variables dont nous avons parlé, car elles vous permettront d’effectuer le test de manière très reproductible et avec une cinétique de paralysie constante.

C’est en fait très important si vous voulez comparer vos résultats réalisés dans votre laboratoire à différents moments par différentes personnes, ou comparer vos résultats à ceux d’autres chercheurs utilisant ce système de modèle.