Assistée par ordinateur à grande échelle de visualisation et quantification de la messe des îlots pancréatiques, distribution de taille et d'architecture

L’objectif global de cette procédure est de collecter des données représentatives non biaisées au sein d’un échantillon limité et d’analyser avec précision la structure tridimensionnelle complexe du tissu. Ceci est accompli en capturant d’abord des coupes virtuelles d’immunohisto, des coupes pancréatiques colorées chimiquement. Ensuite, les tranches virtuelles sont quantifiées avec la macro de tranche virtuelle IHC dans le logiciel image J, et les données sont analysées avec des scripts écrits pour Mathematica.

Ensuite, une reconstruction 3D des tranches virtuelles est effectuée à l’aide de l’image J.La dernière étape de la procédure consiste à capturer une pile d’images d’îlots individuels à l’aide du logiciel de diaporama et à cartographier manuellement les piles d’images en trois dimensions à l’aide d’un enquêteur stéréo. En fin de compte, une architecture précise des œillets avec des coordonnées 3D pour chaque cellule d’œillet peut être obtenue grâce à une méthode combinée d’imagerie 3D et de cartographie manuelle. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des études sur l’obésité et le diabète, telles que la façon dont les conditions physiologiques et physiologiques affectent le pancréas, la masse des cellules bêta, la distribution des œillets et l’architecture.

Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic ou au traitement de l’obésité et du diabète Mélitis, car une meilleure compréhension des changements dans la masse des cellules bêta facilitera le développement et l’évaluation d’interventions thérapeutiques. Bien que les méthodes décrites dans la présente étude fournissent spécifiquement un aperçu de l’immunohistochimie dynamique, l’analyse immunohistochimique du pancréas peut également être appliquée à un éventail d’autres organismes et tissus. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’analyse assistée par ordinateur sont difficiles à apprendre.

En raison de la complexité de l’analyse de tels ensembles de données en deux et trois dimensions. Commencez cette procédure en plaçant une lame propre contenant une section entière d’un pancréas immunohisto coloré chimiquement dans le support d’un microscope fluorescent. Ouvrez le logiciel d’investigation stéréo et visualisez l’échantillon en cliquant sur acquisition.

Et puis l’image en direct. Déterminez les niveaux d’exposition pour chaque canal à l’aide de la fenêtre de l’histogramme vidéo, qui affiche l’intensité de la fluorescence. Dans cet exemple, le canal deux est utilisé pour le DAP, le canal P le troisième canal pour le GFP le canal quatre pour l’appel d’offres, le canal cinq pour le sci cinq et le canal six pour le SCI sept.

À l’aide de la fenêtre des paramètres de l’appareil photo, ajustez le niveau d’exposition de sorte que l’intensité de la fluorescence diminue. À l’extrémité droite de l’histogramme vidéo, l’image peut être mise au point à l’aide de la molette de mise au point du microscope. Avant de créer une tranche virtuelle, contournez l’échantillon en cliquant sur l’écran à un point éloigné de l’échantillon, ce qui marquera un point de référence.

Cliquez ensuite sur le contour de l’échantillon lorsque le contour est terminé. Cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Fermer le contour pour relier les points de début et de fin une fois le contour fermé, capturez une tranche virtuelle pour l’échantillon en sélectionnant acquisition, puis acquérez une tranche virtuelle. Lorsque les options de la fenêtre de tranche virtuelle s’ouvrent, sélectionnez Acquisition à grande vitesse, ainsi que Désactiver le manuel.

Mise au point en décochant la case à côté de manuel. Enregistrez le fichier. Calibrez le préfo en cliquant avec le bouton droit de la souris et en sélectionnant Ajouter à la liste des sites cibles.

Focaliser manuellement plusieurs sections aléatoires dans l’aperçu de la tranche virtuelle Lorsque plusieurs sites ont été sélectionnés, démarrez la tranche virtuelle en cliquant avec le bouton droit de la souris et en la sélectionnant. Démarrez la tranche virtuelle avec prefo une fois la tranche virtuelle terminée pour le premier échantillon, passez au canal suivant et ajustez l’exposition en conséquence. Cette procédure est répétée pour chaque canal afin d’effectuer la quantification des œillets, de traiter les images à l’aide d’une macro d’image J NOMMÉE I-H-C-V-S, qui prépare d’abord les images chargées pour l’analyse, puis quantifie les caractéristiques des œillets telles que la composition cellulaire.

Les macros I-H-C-V-S divisent la pile en ses canaux de couleur respectifs. Dans l’image, J convertit chaque image en un masque noir et blanc de huit bits. Après l’intensité automatique, le seuillage et l’addition arithmétiquement des images de canaux séparés dans un masque composite.

L’analyse des particules intégrée à l’image J sur l’image composite identifiera ensuite les régions d’intérêt ou les zones d’intérêt tout en excluant les particules plus petites qu’une cellule bêta. La quantification des ROI. L’utilisation de l’image J produit une feuille de calcul des paramètres de cellule.

Enregistrez les résultats agrégés dans une feuille de calcul Excel. Stockage de données telles que la circularité du périmètre de la surface, le diamètre de l’œillet et le centre de l’œillet pour chaque œillet, ainsi que les numéros correspondants étiquetés dans l’image. L’analyse informatique de ces paramètres peut être effectuée comme décrit dans le protocole écrit. Pour révéler des informations, y compris la distribution des œillets et l’analyse de fréquence, effectuez une reconstruction 3D de tranches virtuelles en exécutant un script qui convertit toutes les deux images JP du répertoire en fichiers TIF, qui est le format utilisé dans la construction et la quantification des piles tridimensionnelles à partir des tranches virtuelles.

Ici, un script appelé I MJ two two tiff est utilisé. Copiez le script dans le répertoire qui contient les deux images JP. Exécutez le script avec le shell Linux en tapant dot slash i am JP two two TIFF dans la console, puis en appuyant sur Entrée.

Lorsque toutes les images capturées ont été converties de JP deux en fichiers TIFF, elles sont prêtes à être utilisées pour l’analyse dans l’image J.À l’aide de l’image J, ouvrez toutes les images du premier échantillon, qui dans ce cas proviennent d’un pancréas fœtal humain et fusionnez-les en une seule en sélectionnant image, couleur, puis fusionner les chaînes. Répétez ce processus pour chacun des échantillons lorsque tous les échantillons ont été combinés en images uniques. Nettoyez les images en sélectionnant les régions indésirables à l’aide de l’outil de sélection de polygones.

Remplissez-les en sélectionnant modifier, puis remplir. Convertissez chaque image en une image couleur RVB. Enfin, créez une pile à partir des images, après quoi elles peuvent être alignées avec le plugin stack reg.

En fin de compte, la fusion des canaux et la combinaison des images créent un montage 3D de tous les œillets de l’ensemble du pancréas. Pour collecter des piles d’images, placez l’ensemble des œillets pancréatiques de la monture sous le microscope. Appliquez de l’eau si vous utilisez une lentille d’objectif à immersion dans l’eau.

Ouvrez le logiciel du diaporama, accédez à la commande de capture et de mise au point en appuyant sur la touche Ctrl plus Maj plus E dans la fenêtre de contrôle de la mise au point. Réglez l’objectif sur 20 ou 40 fois selon la taille de l’œillet. Pour utiliser l’oculaire du microscope pour localiser les œillets, réglez le bac sur deux fois et réglez le filtre sur l’utilisateur un.

Dans la fenêtre de contrôle de la mise au point, la sélection de l’émission doit être réglée sur 100 %Les yeux en densité neutre doivent être réglés sur GFP en un clic, puis ouvrez le sol pour visualiser l’échantillon dans le diaporama, revenez à la fenêtre de contrôle de la mise au point et changez de filtre réglé sur fixer. Cliquez ensuite sur G-F-P-D-S. Utilisez le joystick pour centrer l’œillet dans la fenêtre de l’appareil photo aussi bien que possible.

Faites la mise au point à une profondeur près du centre de l’œillet où les cellules peuvent être facilement discernées. Dans la fenêtre de contrôle du focus, sélectionnez le zab. Utilisez la commande de portée pour faire défiler jusqu’à la profondeur la plus élevée de l’œillet dans laquelle les caractéristiques peuvent être clairement discernées, puis cliquez sur Définir en haut.

Faites défiler jusqu’au bas de l’œillet et cliquez sur Set. Cliquez en bas de l’écran. Pour revenir au point de référence dans la fenêtre de capture, cliquez sur avancé, puis sur alterner avec le mode canal.

Réglez le facteur de bac sur deux fois et le type de capture sur 3D sur le côté droit de la fenêtre, cliquez sur utiliser les positions haut et bas et revenez au volume central après la capture. Réglez la taille du pas sur trois. Réglez le jeu de filtres pour qu’il se trouve sous la boîte du jeu de filtres.

Sélectionnez DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U et SCI five DSU. Pour chacun d’eux, cliquez sur Trouver le mieux sous Ajuster l’exposition. Cliquez ensuite sur tester pour vous assurer que l’exposition sélectionnée est adaptée.

Cliquez sur démarrer pour commencer la capture. Une fois la capture terminée, ajustez les niveaux si nécessaire et changez la couleur affichée pour l’appel d’offres en blanc. Enregistrez la diapositive et accédez à la section Exporter la série TIFF.

Tapez le nom de la diapositive avec un tiret à la fin et enregistrez-la. Des dizaines de fichiers TIF individuels sont créés, il peut donc être utile de conserver chaque pile d’images d’œillets dans un dossier séparé. Pour cartographier des piles d’images, ouvrez le logiciel stereo investigator.

Visualisez l’image en ouvrant les piles d’images dans le menu de mise à l’échelle de l’image. Réglez la distance entre les images à trois microns pour corriger la flexion deux fois. Dans le diaporama, sélectionnez Remplacer la mise à l’échelle X et Y et utiliser une valeur spécifiée pour la source de la mise à l’échelle x et Y.

Entrez 0,65 pour les centres X et Y et zoomez sur l’image en cliquant sur le bouton de zoom, puis au milieu de l’ilis d’intérêt dans la fenêtre macro du marché au moins une cellule. À l’aide du marqueur approprié, les cellules bêta apparaîtront en vert. Les cellules alpha apparaîtront en rouge et les cellules delta apparaîtront en blanc.

Marquez les cellules au centre de leur noyau, qui apparaîtra en bleu si l’échantillon a été coloré avec DPI utilisez le marqueur deux pour marquer les cellules bêta. Marqueur cinq pour marquer les cellules alpha et marqueur six pour marquer les cellules delta. Une fois qu’au moins une cellule a été marquée, affichez la vue orthogonale à l’aide de l’icône dans le menu supérieur, cochez Filtre Z et symétrique.

La plage doit être réglée sur 15,00. À partir du 0,0 Z.Faites défiler les œillets à l’aide de la molette de la souris et marquez chaque cellule avec le marqueur approprié, marquez chaque cellule une seule fois au centre de sa profondeur. Une fois le marquage de chacun des niveaux Z terminé, la case Filtre Z peut être décochée.

Cela affichera tous les marqueurs de tous les niveaux Z. Une fois que chaque cellule a été marquée, enregistrez le fichier en tant que fichier DAT. Allez ensuite dans le suivi d’exportation de fichiers.

Enregistrez le suivi sous forme de fichier TXT. Enfin, cliquez sur Nouveau fichier de données pour effacer l’espace de travail avant d’essayer de cartographier de nouveaux œillets. La préparation de coupes virtuelles à partir d’un échantillon de pancréas coloré immunohistochimiquement permet d’examiner les cellules endocrines alpha, bêta et delta de l’ensemble du pancréas, car la coloration immunohistochimique des îlots de Langerhans est visible en vert, le glucagon en rouge, la somatostatine en blanc et le dap en bleu.

Les images ont ensuite été converties au masque de huit bits après le seuillage automatique. Voici l’image composite de fusion. Cependant, la distribution des œillets à l’aide d’une tranche virtuelle permet également une analyse individuelle dans des canaux séparés.

Ici, les vues de chaque canal sont affichées pour révéler les cellules delta, les cellules bêta et les cellules alpha. Analyse des particules avec réalisation sur masque composite montrant chaque structure d’œillet numérotée et surlignée en bleu. L’analyse des particules des masques composites est générée sous la forme d’une table de données contenant des paramètres tels que la circularité du périmètre de la zone Islas et divers diamètres pour chaque œillet détecté, dont les ID correspondent aux étiquettes numérotées sur le masque composite.

L’analyse à grande échelle de ces images permet de produire des histogrammes de distribution du nombre total d’œillets et de la taille des œillets, ainsi que des comparaisons détaillées des zones des cellules alpha, bêta et delta. La cartographie des œillets et l’analyse mathématique de la composition et de l’architecture cellulaires peuvent révéler un plan focal unique à partir d’une pile d’images reconstruites en 3D d’œillets humains téléchargées dans un enquêteur stéréo. Ici, les cellules bêta sont en vert, les cellules alpha en rouge, les cellules delta en blanc et les noyaux en bleu.

Suite à la capture d’œillets distincts, les cellules alpha, bêta et delta sont marquées à différents plans de mer ici, des images fluorescentes et les données cartographiques correspondantes sont affichées pour trois plans focaux différents à un intervalle de 10 microns. Une fois que les cellules alpha, bêta et delta ont été marquées à différents plans, l’œillet peut être visualisé en 3D. Voici une reconstruction 3D de l’œillet coupé en quart de tranche à partir des coordonnées obtenues par cartographie des œillets.

De plus, l’analyse mathématique automatisée des œillets cartographiés peut afficher la composition et l’architecture cellulaires. Ici, la fréquence relative des distances entre deux cellules dans une seule population de cellules est illustrée. La fréquence relative des distances entre deux populations cellulaires différentes est également illustrée.

Les probabilités cumulatives des distributions de distance de cellule à cellule pour les cellules alpha à alpha, bêta à bêta et delta à delta sont également illustrées. Le test Cole, OV, Smirnov ou KS peut être effectué sur ces probabilités pour obtenir les distances KS correspondantes. Une fois maîtrisés, l’imagerie à grande échelle et l’analyse d’une coupe de tissu entier peuvent être réalisées en quatre heures.

La reconstruction 3D d’un bloc de tissu peut être effectuée en 30 minutes. Enfin, l’imagerie 3D et la cartographie manuelle peuvent être réalisées en quatre heures si elles sont effectuées correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de commencer par une coloration immunohistochimique de haute qualité des sections.

La précision de l’analyse ultérieure dépendra des données brutes. Assurez-vous également que vos ordinateurs disposent d’au moins huit gigaoctets de RAM pour traiter une analyse à si grande échelle après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs, non seulement dans le domaine de l’obésité et du diabète, mais aussi dans de nombreux autres domaines qui utilisent l’analyse pathologique standard.

Il peut être particulièrement utile lorsque la disponibilité des échantillons est limitée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de collecter des données représentatives impartiales au sein d’un échantillon de taille limitée à l’aide de techniques standard. La sélection d’une seule région spécifique peut ne pas être représentative de l’ensemble du tableau, comme nous l’avons montré à l’aide de notre étude sur la distribution des œillets pancréatiques.