Visualisation longitudinale stabilisée au niveau cellulaire in vivo du pancréas dans un modèle murin avec une fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique

Ce protocole décrit l’imagerie in vivo stabilisée et répétitive au niveau cellulaire du pancréas avec une nouvelle fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’effectuer une imagerie tridimensionnelle immobile avec une résolution allant jusqu’au niveau cellulaire pendant trois semaines dans le pancréas d’une souris vivante. Commencez par préparer la plate-forme chirurgicale et désinfectez les surfaces avec de l’éthanol à 70%.

Après l’anesthésie, utilisez une sonde rectale avec un coussin chauffant à commande homéotherme pour surveiller la température corporelle. Enlevez les poils du flanc gauche de la souris et appliquez de l’alcool et de l’iode alternativement, en tournant du site d’incision vers la surface externe, en ne revenant jamais au site d’incision et en terminant par de l’iode. Ensuite, faites une incision de 1,5 centimètre sur le flanc gauche de la souris, en disséquant la peau et le muscle.

Utilisez une suture noire ou en nylon 4-0 pour effectuer une suture de cordon de bourse dans la marge d’incision. Tirez soigneusement la rate avec une pince annulaire et identifiez le pancréas. En plaçant la fenêtre sur le flanc de la souris, passez la rate et le pancréas à travers l’espace ouvert de la fenêtre.

Ensuite, placez doucement le pancréas sur la plaque de la fenêtre d’imagerie tout en plaçant la rate sur l’espace ouvert de la fenêtre. Injecter PANC-1 nuclite rouge directement dans le pancréas. Utilisez une aiguille de cathéter de calibre 31 pour appliquer des gouttes de colle cyanoacrylate de n-butyle sur la marge de la fenêtre d’imagerie, en veillant à ce qu’une quantité minimale de colle soit appliquée.

Appliquez doucement un verre de couverture rond de 12 millimètres sur la marge de la fenêtre d’imagerie. Ensuite, maintenez la boucle de suture pour l’insérer dans la rainure latérale de la fenêtre et attachez-la trois fois. Enfin, pour éviter l’interruption de ces points serrés lorsque les souris sont éveillées, coupez le site proximal maximal de la cravate.

Commencez par allumer le microscope intravital, y compris la puissance laser. Pour insérer un cathéter vasculaire, appliquez une pression sur le côté proximal de la queue avec l’index et le troisième doigt. Si nécessaire, chauffez la queue avec une lampe.

Désinfectez la veine caudale avec un spray à 70% d’éthanol, puis insérez un cathéter de calibre 30 dans la veine latérale de la queue et visualisez la régurgitation du sang dans le tube PE-10. Appliquez du ruban de soie sur le cathéter pour le stabiliser. Injecter fitc dextran et TMR dextran, ou d’autres sondes fluorescentes selon le cas, selon la combinaison de sondes fluorescentes.

Insérez une sonde rectale pour contrôler automatiquement la température corporelle avec un système de coussin chauffant homéotherme. Ensuite, insérez la fenêtre d’imagerie pancréatique préparée lors de la configuration de la microscopie intravitale dans le porte-fenêtre. Transférez la souris de la plate-forme chirurgicale à l’étape d’imagerie.

Pour effectuer une imagerie intravitale, commencez par imager le pancréas à un faible grossissement, par exemple quatre fois, pour scanner toute la vue du pancréas dans la fenêtre d’imagerie pancréatique. Une fois la région d’intérêt déterminée, passez à une lentille d’objectif à grossissement plus élevé, comme 20 fois ou 40 fois, pour effectuer une imagerie au niveau cellulaire avec une résolution latérale et axiale d’environ 0,5 micromètre et 3 micromètres respectivement. Effectuez une imagerie Z-stack ou time-lapse pour observer la structure 3D ou la dynamique au niveau cellulaire telle que la migration cellulaire.

La microscopie intravitale combinée à la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique offre une stabilité tissulaire à long terme qui permet l’acquisition d’une imagerie à haute résolution pour suivre les îlots individuels jusqu’à trois semaines. La fenêtre implantée dans une souris C57 noire 6 N avec un anticorps anti-CD31 injecté par voie intraveineuse, conjugué avec un fluorophore Alexa 647, a facilité l’imagerie à grande échelle et l’imagerie 3D agrandie du pancréas. Des cellules acineuses ont été identifiées dans les images moyennes du tissu pancréatique dans le système vasculaire adjacent, visualisées à l’aide d’autofluorescence et d’anticorps anti-CD31 respectivement.

En utilisant la méthode d’imagerie en mosaïque, qui combine une vue à grand champ avec une imagerie haute résolution, environ 40 à 50 îlots avec la vascularisation adjacente ont été visualisés dans une souris MIP-GFP. Une étude précédente a montré que les îlots peuvent être suivis jusqu’à trois semaines en utilisant cette méthode d’imagerie stable. Pour visualiser les cellules cancéreuses, les globules rouges nuclite PANC-1 ont été directement implantés dans le pancréas de la souris pendant la chirurgie et les vaisseaux voisins ont été colorés avec un anti-CD31 conjugué avec Alexa 647.

À l’aide de ce protocole, des images à grand champ du cancer du pancréas ont été générées. Cela a permis de délimiter la marge de la tumeur, ainsi que d’obtenir des images 3D haute résolution au niveau de la cellule unique. L’étape la plus critique de cette méthode est l’implantation habile de la fenêtre d’imagerie pancréatique chez la souris.

En utilisant d’autres combinaisons de cellules fluorescentes de souris et de sondes d’anticorps, l’interaction dynamique des cellules voisines avec les îlots ou les cellules annulaires a pu être identifiée. Cette méthode peut être largement appliquée par ceux qui explorent le changement de l’îlot dans diverses conditions physiopathologiques et micro-environnements du cancer du pancréas in situ.