ARN interférence dans les tiques

L’objectif général de cette procédure est de démontrer la technique d’interférence ARN chez les tiques par injection. Ceci est accompli en synthétisant d’abord l’ARN double brin du ou des gènes d’intérêt. L’ARN est ensuite injecté dans les tiques, après quoi elles sont conservées dans une chambre d’humidité pendant 24 heures.

Passé ce délai de retenue, les tiques sont autorisées à se nourrir d’un animal tel qu’un mouton enfin tique. Les paramètres d’alimentation tels que le poids, la mue et la position des ovules, ainsi que l’expression du ou des gènes d’intérêt ciblés par R-T-P-C-R en temps réel sont déterminés. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui démontrent l’effet du silençage des gènes ciblés sur la biologie des tiques en évaluant les paramètres biologiques des tiques et l’expression des gènes par R-T-P-C-R en temps réel.

Notre groupe travaille avec des tiques en essayant de caractériser les événements moléculaires à l’interface entre les agents pathogènes des tiques et d’utiliser ces informations de base pour développer des méthodes de contrôle de l’infestation par les tiques et de la transmission des agents pathogènes aux humains et aux animaux. L’interférence ARN est apparue comme un outil essentiel dans cette recherche car c’est la seule méthode disponible pour la manipulation génétique des tiques. La fonction de nombreux gènes de tiques est inconnue.

L’interférence ARN nous permet de définir le rôle des gènes des tiques et de l’expression des gènes dans de nombreux aspects de la biologie des tiques, y compris l’accouplement, la reproduction, l’alimentation, la digestion, la fonction des glandes salivaires et la compétence des vecteurs de tiques pour la transmission des agents pathogènes. La démonstration de la procédure sera faite par l’équipe d’interférence ARN de tique de notre laboratoire, le Dr Ed Lewin, étudiant diplômé, Busby et moi-même. Pour générer de l’ARN double brin, synthétisez d’abord des amorces oligonucléotidiques contenant sept séquences promotrices pour la transcription in vitro de l’ARN.

Par exemple, derma centre vari lesin. Utilisez les amorces oligonucléotidiques D eight A a T 75 et D eight DVT 73 illustrées ici. Amplifiez le gène cible par R-T-P-C-R en utilisant 10 picomoles de chaque amorce oligonucléotidique et un à 10 nanogrammes d’ARN total de tique.

Ensuite, purifiez le produit PCR. Utilisez ensuite huit microlitres ou environ 100 nanogrammes pour synthétiser l’ARN double brin. Pour préparer d’abord les tiques à l’injection, lavez les tiques dans la série de solutions suivante, l’eau du robinet 3 % de peroxyde d’hydrogène distillée deux fois, 70 % d’éthanol et deux lavages finaux avec de l’eau distillée.

Effectuez chaque lavage dans un tube à centrifuger jetable de 50 millilitres en secouant. Ensuite, décantation de la solution à travers un tamis en fil de fer à mailles fines. Bloquez les tiques à l’aide d’essuie-tout, puis aliquotez-les en groupes de 20 à 50 selon l’expérience.

Placez chaque groupe dans un gobelet en plastique de 1,25 once avec un couvercle hermétique et étiquetez chaque gobelet avec le groupe expérimental. Ensuite, constituez une équipe ARNi composée de trois personnes qui effectueront le processus d’injection. La première personne positionne chaque tique sur du ruban adhésif double fixé à une feuille de cire dentaire rouge de trois pouces sur six.

La deuxième personne injecte les tiques et la troisième surveille les tiques après l’injection, respire du dioxyde de carbone sur les tiques pour les activer et compte et transfère les tiques vivantes dans des gobelets étiquetés avec le numéro de groupe expérimental. Tous les membres de l’équipe doivent porter des gants jetables Pour commencer le processus d’injection de tiques, capturez une tique à l’aide d’une pince fine dumont et placez-la sur le côté ventral vers le haut sur du ruban adhésif double fixé à la feuille de cire dentaire rouge Positionnez étroitement les tiques en groupes de cinq. Placez une petite bande de ruban adhésif sur les pièces buccales des cinq tiques.

Afin de les retenir davantage, laissez la majeure partie du corps exposée afin que le processus d’injection puisse être observé par l’injecteur de tiques. Pour injecter la tique, percez un trou dans le quadrant inférieur droit de la surface ventrale de l’exosquelette à l’aide d’une seringue à insuline à éjection unique munie d’une aiguille d’un demi-pouce de calibre 29. Ensuite, injectez immédiatement les tiques avec 0,2 à 0,5 microlitre de solution d’ARN double brin à l’aide d’une seringue Hamilton sur mesure et d’une aiguille d’un pouce de calibre 33 avec une pointe biseautée à 45 degrés, placez l’aiguille bien dans la cavité de la tique pour assurer le placement et la rétention de l’ARN double brin.

Même si le liquide est libéré après l’injection, la mise en place profonde de l’aiguille pour l’injection garantira qu’une quantité suffisante d’ARN double brin est déposée dans la cavité de la tique pour provoquer un silençage génique. Injectez les tiques, ce qui entraînera la perte d’hémolymphe et la mort de la tique. Immédiatement après avoir injecté les tiques, ramassez-les dans le double ruban adhésif à l’aide de la pince fine et placez-les dans un récipient de récupération en plastique.

Les tiques resteront brièvement inactives après l’injection, mais devraient bientôt commencer à ramper autour de la boîte. Activez les tiques en respirant du dioxyde de carbone sur elles. Une fois que les tiques sont rampantes et actives, la plaie d’injection guérira rapidement et elles survivront très probablement.

Comptez les tiques de chaque groupe expérimental et placez chaque groupe dans un gobelet en plastique étiqueté avec un couvercle bien ajusté. Remplacez toutes les tiques qui meurent dans le groupe actuel avant d’injecter le groupe expérimental suivant. Nettoyez la seringue Hamilton avant d’injecter le groupe expérimental suivant en remplissant puis en expulsant la seringue avec du peroxyde d’hydrogène frais à 3 %.

15 lavages suivis de 15 lavages à l’eau stérile. Veillez à ne pas plier le piston de la seringue Hamilton, sinon le piston ne se déplacera pas en douceur et ne répondra pas au toucher doux requis pour l’injection de tique. Après l’injection, placez les tiques dans une chambre avec un récipient rempli d’eau et de sulfate de potassium, ce qui maintient une humidité élevée et les maintient pendant une journée.

Ensuite, placez les tiques individuelles dans des cellules d’alimentation de tiques collées à un mouton et laissez-les se nourrir avec un nombre égal de tiques mâles ou femelles injectées non injectées, quel que soit le sexe qui n’a pas été injecté. Ramassez et agitez les tiques femelles de la cellule d’alimentation après qu’elles aient terminé de se nourrir pendant environ 10 jours ou lorsque les femelles témoins sont tombées, l’hôte incube chaque groupe de tiques dans la chambre d’humidité jusqu’à la fin de la position des ovules. Évaluez la position des ovules par groupe en pesant la masse d’œufs produite par toutes les tiques d’un groupe pour évaluer le phénotype de la tique après l’alimentation.

Déterminez le nombre de tiques qui ont survécu et calculez le poids des tiques ainsi que la position des ovules et la fertilité des œufs. En fonction du gène ciblé et des objectifs de l’étude, d’autres analyses peuvent être effectuées pour confirmer le silençage génique par R-T-P-C-R. Après l’alimentation, disséquez les glandes salivaires et les intestins de tiques individuelles des groupes témoins injectés et injectés d’ARN double brin, puis extrayez l’ARN total des échantillons de tissus individuels.

Analysez les transcrits du gène cible dans les tissus individuels par R-T-P-C-R en temps réel et normalisez les niveaux d’ARN par rapport à l’ARN ribosomique de la tique 16. À l’aide de la méthode de la norme génétique, exécutez des courbes de dissociation à la fin de la réaction pour vous assurer qu’un seul amplicon est formé et que les amplicons se dénaturent constamment dans la même plage de température pour chaque échantillon, comparez les valeurs CT normalisées pour les niveaux d’ARNm entre le témoin injecté et le double brin. Injection d’ARN de tiques à l’aide du test T de l’étudiant.

Le protocole décrit ici a été utilisé dans notre laboratoire pour l’ARNi chez de nombreuses espèces de tiques exotiques. La quantité d’ARN double brin injectée dans les tiques varie en fonction de la taille de la tique. Les espèces de tiques plus grandes peuvent accueillir un plus grand volume.

Les références se trouvent dans la partie écrite du protocole qui l’accompagne. Si le protocole est fait correctement, moins de 5 % de mortalité devrait être obtenue à la suite de la procédure d’injection après 24 heures. Un phénotype typique après l’inactivation d’un gène chez les tiques est montré ici, où un panel de tiques a reçu une injection de flaques d’ARN double brin qui ont été utilisés pour dépister les antigènes protecteurs des tiques.

Chez les tiques examinées en microscopie optique, on peut observer une dégénérescence cellulaire dans les tissus des tiques. Les modifications phénotypiques peuvent également s’accompagner d’une perte de fonction. Par exemple, l’ARN de SUBIN donne des mâles stériles qui ne peuvent pas s’accoupler avec succès avec les femelles.

D’autres méthodes peuvent être utilisées pour déterminer l’impact du silençage génique sur l’expression des gènes et des protéines et sur la biologie des tiques, notamment la microscopie R-T-P-C-R en temps réel, la microscopie électronique optique ou la microscopie confocale. Génomique ou protéomique. L’interférence de l’ARN peut également être réalisée dans les cultures de cellules de tiques et fournit une méthode in vitro pour l’étude des interactions entre les cellules de tiques et les agents pathogènes.