HLA-Ig des cellules à base Antigène artificielle Présentation d'Efficient Ex vivo Extension du CTL humaines

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser des cellules présentatrices d'antigène artificielles, ou aAPC, pour l'expansion ex vivo de lymphocytes T cytotoxiques humains spécifiques d'un antigène, en vue d'une éventuelle utilisation en immunothérapie adoptive. Cette étape est réalisée en conjuguant d'abord l'HLA A2-Ig et un anticorps monoclonal anti-CD28 humain à des billes magnétiques Dynabeads afin de fabriquer des aAPC. La deuxième étape de la procédure consiste à effectuer un contrôle qualité et le chargement des peptides sur les aAPC. La troisième étape consiste à isoler les lymphocytes T CD8 positifs à partir du sang périphérique humain. La dernière étape de la procédure est d'incuber les lymphocytes T CD8 positifs avec les aAPC pendant une semaine.

Les CTL sont ensuite récoltés et caractérisés avant d'être soit utilisés, soit à nouveau stimulés pendant une semaine afin d'atteindre le niveau souhaité de spécificité et d'expansion. En fin de compte, des résultats d'analyse ou de coloration peuvent être obtenus, montrant que les CTL expansés en présence de cellules APC ont une spécificité antigénique accrue. Aujourd'hui, je vais vous présenter un système de cellules APC basé sur HI IG et expliquer comment utiliser ce système pour amplifier efficacement, ex vivo, des CTL humains spécifiques du CMV par rapport aux autres méthodes existantes.

Notre technologie A A PC offre plusieurs avantages importants. Elle est disponible dans le commerce, disponible en quantité illimitée, et permet de dire que l'A A PC peut être utilisée pour tous les donneurs HRAA deux positifs. Bon, commençons par transférer un millilitre de billes d'époxyde M quatre 50, provenant d'un stock d'environ 400 millions de billes, dans un tube en verre stérile à vis.

Lavez les billes une fois en ajoutant un millilitre de tampon boid, puis en plaçant le flacon en verre contre un aimant Dynal NBC1 pendant que les billes adhèrent à la paroi du flacon. Éliminez le surnageant par aspiration. Resuspendez les billes dans un mélange de tampon boid, de dimère HLA-A2-Ig et d'anticorps monoclonal anti-CD28 humain.

Ensuite, afin de faciliter la conjugaison des protéines aux billes, faire tourner le flacon en verre sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Puis, placer le tube dans un aimant MPC1 et éliminer tout le tampon borate. Une fois le tampon éliminé, laver les billes deux fois avec un millilitre de tampon de lavage des billes.

Incubez maintenant les billes dans un millilitre de tampon de lavage des billes et faites tourner le flacon à quatre degrés Celsius pendant encore 24 heures afin de bloquer les sites de liaison protéiques résiduels sur les billes. Ensuite, retirez le tampon du flacon en verre et remplacez-le par un millilitre de tampon de lavage des billes frais. Transférez 100 microlitres de tampon de lavage fax dans des tubes fax, puis ajoutez cinq fois 10 à la puissance cinq billes.

Colorer les billes avec un microlitre d'anticorps anti-muse IgG1 PE et un microlitre d'anticorps anti-muse IgG2 a fite après une coloration de 20 minutes à quatre degrés Celsius. Ajouter trois millilitres de tampon de lavage fax à chacun des échantillons colorés. Ensuite, former le culot des A A PC par centrifugation à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Réensemencez les PC A dans du tampon fax frais et lisez immédiatement le résultat de coloration par cytomètre en flux. Lavez les billes deux fois avec du PBS stérile comme précédemment. Ensuite, chargez les billes avec 10 microlitres de peptide CMV.

Compter les billes à l'aide d'un hémocytomètre, puis les étiqueter avec la date et la concentration des billes en billes par millilitre. Incuber les A A PC avec le peptide pendant au moins trois jours à quatre degrés Celsius. Centrifuger environ 100 millilitres de sang périphérique frais provenant d'un donneur HLA A deux positif dans des tubes vacutainer contenant 10 % d'héparine de sodium à 300 ×g pendant 10 minutes.

À température ambiante, retirez soigneusement la couche supérieure de plasma par aspiration. Remplacez le plasma recueilli par du PBS stérile et transférez le sang dans un flacon de culture stérile de 75 cm². Mélangez bien le sang et le PBS par pipetage une fois que tout le sang a été recueilli, soit 15 millilitres de poche de prélèvement plus quatre tubes coniques de 50 millilitres.

Recouvrez lentement 30 à 35 millilitres des cellules sanguines par-dessus le fial dans chaque tube. En maintenant une interface bien distincte entre le fial et les cellules sanguines, centrifugez le gradient de sang et de fial à 500 ×g pendant 20 minutes à température ambiante, avec le freinage désactivé et l'accélération aussi faible que possible afin de préserver une interface nette entre les couches après la centrifugation. Aspirez délicatement la couche plasmatique supérieure, puis utilisez une pipette serologique pour prélever soigneusement la couche de PBMC. Transférez les PBMC dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Une fois tous les PBMC récoltés, ajoutez 30 millilitres de PBS aux cellules et centrifugez-les.

Ensuite, éliminez le surnageant et lavez le culot. Une fois de plus avec 30 millilitres de PBS afin d'éliminer les résidus de fi, puis enrichissez la population de lymphocytes T CD8 positifs à l'aide d'un kit d'isolement de lymphocytes T CD8 positifs humains Milton, conformément au protocole du fabricant. Comptez les lymphocytes T CD8 positifs et confirmez la pureté par analyse en FACS.

Suspendre 1 million de CTL dans huit millilitres de milieu de culture contenant deux fois le facteur de croissance des lymphocytes T et huit millilitres de milieu RPMI complet, puis ajouter une fois 10 des six A A PC mix. Utiliser ensuite une pipette multipuits pour répartir 160 microlitres de cellules par puits dans une plaque de culture tissulaire de 96 puits en U. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone pendant sept jours.

Alimentez les cellules au jour quatre avec 80 microlitres par puits de milieu de culture contenant le facteur de croissance pour lymphocytes T deux fois concentré. Récoltez les cellules au jour sept, puis placez les cellules contre l'aimant pour éliminer l'ancien A A PC lorsque toutes les billes adhèrent à la paroi du flacon.

Récupérez et transférez les cellules dans un autre tube conique de 50 millilitres et déterminez le nombre de cellules. Déterminez la spécificité antigénique des CPA AA par marquage au tétramère selon le protocole du fabricant. Reprenez les cellules récupérées et co-culturez-les avec de nouvelles CPA AA dans les mêmes conditions afin d'obtenir un nombre accru de cellules spécifiques à l'antigène.

Voici un résultat représentatif de coloration par tétramère de CTL spécifiques de la CMV générés par des A-A-P-C après une semaine de culture. On observe ici un résultat représentatif de coloration intracellulaire de cytokines pour des CTL spécifiques de la CMV produits par des A-A-P-C. La spécificité pour la CMV était de 61 % selon la coloration par tétramère. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine des lymphocytes T, telles que : comment identifier les conditions de culture optimales et les exigences pour la modulation fonctionnelle des lymphocytes T ?

La méthode humble a permis d'obtenir des informations sur le traitement des maladies virales. Elle peut également être appliquée à d'autres domaines tels que le cancer.