HLA-Ig des cellules à base Antigène artificielle Présentation d'Efficient Ex vivo Extension du CTL humaines

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser des cellules présentatrices d’antigènes artificielles ou un PC A pour l’expansion ex vivo de CTL spécifiques de l’antigène humain pour une utilisation potentielle dans l’immunothérapie adoptive. Ceci est accompli en conjuguant d’abord HLA A deux IG et l’anticorps monoclonal anti-humain CD 28 à des billes de dyna magnétiques pour faire A A PC. La deuxième étape de la procédure consiste à effectuer le contrôle de la qualité et le chargement peptidique de l’A A PC. La troisième étape de la procédure consiste à isoler les cellules T positives de huit cellules T du sang périphérique humain. La dernière étape de la procédure consiste à incuber huit lymphocytes T positifs CD avec un PC A pendant une semaine.

Les CTL sont ensuite récoltés et caractérisés avant d’être utilisés ou d’être restimulés pendant une autre semaine pour atteindre le niveau souhaité de spécificité et d’expansion. En fin de compte, des résultats de teum ou de coloration peuvent être obtenus qui montrent que les CTL qui sont expansés en présence d’un A PC ont une spécificité antigénique accrue. Aujourd’hui, je vais vous montrer un système PC basé sur HI IG et comment utiliser ce système pour étendre efficacement l’exvivo CTL humain spécifique au CMV par rapport à d’autres méthodes existantes.

Notre technologie A A PC offre plusieurs avantages importants. Il est disponible dans le commerce, il est en quantité illimitée, et disons qu’un PC peut être utilisé pour tous les donateurs positifs de l’ARAA. D’accord, commençons à transférer un millilitre de M quatre 50 billes d’époxy d’un stock d’environ 400 millions de billes dans une lime en verre stérile.

Lavez les perles une fois en ajoutant un millilitre de tampon boïde, puis en plaçant le flacon en verre contre un aimant NBC pendant que les billes sont collées sur le côté du flacon. Retirez le piège par aspiration Resus. Suspendez les billes dans un mélange de tampon boïde HLA A deux dimères IG et d’anticorps monoclonal anti-humain CD 28.

Ensuite, pour faciliter la conjugaison protéine-bille, faites pivoter le flacon en verre sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, placez le tube dans un aimant MPC et retirez tout le tampon de borate. Une fois le tampon retiré, lavez les perles deux fois avec un millilitre de tampon de lavage de billes.

Maintenant, incubez les billes dans un millilitre de tampon de lavage de billes et faites pivoter le flacon à quatre degrés Celsius pendant encore 24 heures pour bloquer les sites de liaison des protéines résiduelles sur les billes. Retirez ensuite le tampon du flacon en verre et remplacez-le par un millilitre de tampon de lavage aux billes fraîches. Transférez 100 microlitres de tampon de lavage de fax dans les tubes de fax, puis ajoutez cinq fois 10 à la cinquième bille.

Teignez les billes avec un microlitre d’IgG anti-muse, un PE et un microlitre d’IgG anti-muse deux fois après avoir taché pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. À trois millilitres de tampon de lavage de fax pour chacun des échantillons de coloration. Ensuite, granulez l’A A PC en dépensant à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Suspendez l’A A PC dans le tampon de fax frais et lisez immédiatement le résultat de la coloration par cytomètre en flux. Lavez les perles deux fois avec du PBS stérile comme précédemment. Ensuite, chargez les billes avec 10 microlitres de peptide CMV.

Comptez les billes à l’aide d’un hémocytomètre, puis étiquetez-les avec la date et la concentration des billes. Sous forme de billes par millilitre. Incuber l’A, A, PC, avec le peptide pendant au moins trois jours à quatre degrés Celsius, centrifuger environ 100 millilitres de sang périphérique frais d’un donneur HLA A deux positifs dans 10 tubes d’héparine sodique vacutainer à 300 Gs pendant 10 minutes.

À température ambiante, retirez soigneusement la couche supérieure de plasma par aspiration. Remplacer le plasma prélevé par du PBS stérile et transférer le sang dans une fiole de culture T 75 stérile. Mélangez bien le sang et le PBS par pipetage une fois que tout le sang a été prélevé à 15 millilitres de fial pack plus quatre tubes coniques de 50 millilitres.

Superposez lentement 30 à 35 millilitres de cellules sanguines sur le fial dans chaque tube. En gardant l’interface distincte entre le fial et les cellules sanguines, centrifugez le gradient sanguin et fial à 500 GS pendant 20 minutes à température ambiante avec la rupture et l’accélération aussi faibles que possible pour maintenir une interface claire entre les couches après l’aspiration de spin de la couche supérieure de plasma, puis utilisez une pipette sérologique pour aspirer soigneusement la couche PBMC. Transférez le PBMC dans un tube conique frais de 50 millilitres lorsque tous les PBMC ont été récoltés à 30 millilitres de PBS dans les cellules et centrifugez-les.

Ensuite, jetez le supernat et lavez le granulé. Une fois de plus avec 30 millilitres de PBS pour éliminer l’appel fi résiduel, puis enrichir pour la population de lymphocytes T positifs CD huit à l’aide d’un kit d’isolement de lymphocytes T positifs CD huit de Milton Human. Selon le protocole du fabricant, comptez les huit lymphocytes T positifs et confirmez la pureté par analyse par fax.

Suspendez 1 million de CTL dans huit millilitres de facteur de croissance des lymphocytes T, deux fois le milieu de culture et huit millilitres de milieu RPMI complet et ajoutez une fois 10 des six A A mélange PC. Ensuite, utilisez une pipette multicanaux pour plaquer 160 microlitres de cellules par puits sur une plaque de culture tissulaire à fond en U de 96 puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant sept jours.

Nourrissez les cellules le quatrième jour avec 80 microlitres par puits de croissance des cellules T. Facteur deux x milieu de culture. Récoltez les cellules le septième jour, puis placez les cellules contre l’aimant pour retirer l’ancien A A PC lorsque toutes les billes adhèrent à la paroi du flacon.

Récoltez et transférez les cellules dans un autre tube conique de 50 millilitres et comptez le nombre de cellules. Déterminer la spécificité antigénique de l’A A PC par coloration au tétramère selon le protocole du fabricant. Rejouez les cellules récoltées avec un nouveau PC A A dans les mêmes conditions pour générer un nombre accru de cellules en spécificité de l’antigène.

Voici un résultat représentatif de coloration au tétramère d’une CTL spécifique du CMV générée par un PC après une semaine de culture. Voici un résultat représentatif de coloration des cytokines intracellulaires de la CTL spécifique du CMV générée par A-A-P-C-C-M-V la spécificité était de 61 % par coloration des tétramères. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine des lymphocytes T, telles que comment pouvons-nous identifier les conditions culturales optimales et les exigences de la modulation fonctionnelle des lymphocytes T.

La méthode Lowly a fourni des informations sur le traitement des maladies virales. Il peut également être appliqué dans d’autres domaines tels que le cancer.