Utilisation de cellules souches pluripotentes induites par l'homme pour la génération de lymphocytes T spécifiques à l'antigène tumoral

Nous présentons une méthode pour générer des cellules T alpha bêta monopositives pluripotentes induites par l’homme en utilisant le système de co-culture OP9-Delta-1. Cette méthode est un outil puissant pour la génération in vitro de cellules T et facilitera le développement de cellules T in vitro pour une utilisation en médecine régénérative et en thérapies cellulaires. Il peut également être adapté pour la génération d’autres lymphocytes, comme les cellules NK.

Lors de l’exécution de cette technique, il est important de pré-évaluer le lot de FBS et de passage OP9-Delta-1 cellules de façon cohérente lorsque le contact cytoplasmique cellule à cellule commencent à prévenir la différenciation cellulaire et la sénescence. La démonstration de l’intervention sera le Dr Meghan Good, un chercheur en oncologie chirurgicale de mon équipe. Commencez par vérifier les colonies humaines d’iPSC au microscope stéréo et éliminez toutes les zones de différenciation de la culture avec le bord en plastique d’une pointe de pipette de 200 microlitres.

Lorsque les colonies atteignent 0,8 à 1,2 millimètre de diamètre, passer les iPSCs humains. Aspirer les médias usés, et ajouter 10 millilitres de médias iPSC humains complétés par un inhibiteur rock de 10 micromolaires. Roulez un outil de passage de cellules jetables sur l’ensemble du plat dans une direction, en vous assurant de maintenir une pression uniforme et que toute la lame de rouleau touche le plat de culture.

Faites pivoter le plat de culture à 90 degrés et répétez le roulement. Confirmez visuellement la bonne coupe des colonies à l’aide d’un microscope. Ils devraient apparaître à la caisse.

Ensuite, détachez les colonies coupées par une douce chasse d’eau mécanique avec une pipette de 200 microlitres. Estimer visuellement le nombre d’amas de colonies et transférer entre 350 et 600 touffes dans un nouveau plat de 10 centimètres de fibroblastes embryonnaires de souris avec 10 millilitres de médias iPSC humains frais complétés par un inhibiteur rock. Incuber le plat toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, aspirez les médias dépensés, et ajoutez 10 millilitres de médias humains frais d’iPSC. Changez les médias tous les un ou deux jours, selon le taux de croissance cellulaire. Culture des cellules OP9-Delta-1 dans les médias OP9 à 37 degrés Celsius.

Quand ils atteignent la confluence, aspirent le média, et lavent les cellules une fois avec cinq millilitres de magnésium 1x, calcium, et phénol rouge-libre PBS. Aspirer le PBS, ajouter deux millilitres de 05% trypsine-EDTA, et incuber les cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez quatre millilitres de supports OP9 et dissociez mécaniquement la couche cellulaire par pipetting.

Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres à travers une passoire cellulaire de 100 micromètres et une centrifugeuse à 300 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirer le supernatant, et resuspendre les cellules en 12 millilitres de médias OP9. Ajoutez huit millilitres de supports OP9 à chacun des six nouveaux plats de culture cellulaire et assiettez deux millilitres de la suspension cellulaire OP9-delta-1 sur chaque plat.

Faire basculer le plat d’un côté à l’autre et d’avant en arrière pour assurer une distribution uniforme des cellules. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, et répéter le passage lorsque les cellules atteignent la confluence. Préparez des plats OP9-Delta-1 gélatineux une semaine avant la co-culture avec les iPSCs humains.

Ajouter quatre millilitres de 0,1% de gélatine à trois nouveaux plats de culture cellulaire, et les incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, aspirer la gélatine et ajouter huit millilitres de supports OP9 à chaque plat. Passage d’un plat confluent de cellules OP9-Delta-1 à trois plats recouverts de gélatine.

Après quatre jours, ajouter 10 millilitres de supports OP9 à chaque plat de cellules, pour un total de 20 millilitres de médias par plat. Commencez la co-culture de l’iPSC humain sur les plats confluents OP9-Delta-1 sept à huit jours après avoir passé les cellules. Aspirez les médias à partir d’un plat confluent d’iPSCs humains, et ajoutez 10 millilitres de médias OP9.

Couper et détacher les colonies cellulaires à l’aide d’un outil de passage cellulaire jetable et transférer de 350 à 600 touffes de colonies coupées sur un plat OP9-Delta-1 prégélatinisé avec 10 millilitres de médias OP9 frais. Rock le plat de culture d’un côté à l’autre et d’avant en arrière pour assurer une distribution uniforme des colonies. Le lendemain, aspirez les médias dépensés et remplacez-les par 20 millilitres de nouveaux médias OP9.

Les touffes humaines d’iPSC co-cultivés sur OP9-Delta-1 pendant une journée devraient apparaître comme de petites colonies rondes et monocouches. Le cinquième jour, aspirez 10 millilitres de médias usés et ajoutez 10 millilitres de nouveaux supports OP9. Les colonies commenceront à se différencier en mésoderm primitif, qui se caractérise par un centre sombre à plusieurs superpositions.

Répétez ce processus le neuvième jour, à quel moment les structures du centre multicouche évolueront en formes en forme de dôme. Récoltez les cellules progénitrices hématopoïétiques le jour 13, à partir de laquelle les structures sont composées d’un organoïde central foncé entouré d’un réseau de zones en forme de dôme. Aspirez les médias et lavez les cellules une fois avec cinq millilitres de solution de sel équilibré hanks sans phénol sans rouge avec du calcium et du magnésium, ou HBSS.

Après le lavage, ajouter 250 microlitres de 5000 unités par millilitre de collagène IV à 10 millilitres de HBSS. Ajouter le mélange aux cellules et les incuber à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Aspirez le mélange HBSS-collagène, et lavez les cellules une fois avec cinq millilitres de PBS.

Après le lavage avec PBS, ajouter cinq millilitres de 0,25% trypsine-EDTA, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, ajouter quatre millilitres de supports OP9, et dissocier la couche cellulaire par pipetting pour faire une suspension à cellule unique. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres à travers une passoire de 100 micromètres et centrifuger le tube à 300 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Aspirer le supernatant, et resuspendre les cellules en 10 millilitres de médias OP9. Plaquez la suspension cellulaire sur un nouveau plat de culture cellulaire gélatinel de 10 centimètres et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Ensuite, recueillir toutes les cellules non adhérentes par pipetting doux.

Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres à travers une passoire et une centrifugeuse comme décrit précédemment. Ensuite, aspirez le supernatant, et résuspendez les cellules en 10 millilitres de médias de différenciation. Plaquez la suspension cellulaire sur un nouveau plat confluent OP9-Delta-1.

Passez les cellules le jour 16 selon les instructions manuscrites, et continuez à passer les cellules non adhérentes tous les cinq à sept jours par la suite. Après 35 jours de différenciation, enrichir la population de cellules CD4 positives par l’isolement des perles magnétiques CD4 selon le protocole du fabricant. Ensuite, resuspendez les cellules dans les médias OP9, et plaquez un millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits d’une culture tissulaire, à fond plat, plaque de 24 puits de confluent OP9-Delta-1.

Stimulez les cellules en ajoutant 100 unités internationales d’IL-2 humain, cinq nanogrammes d’anticorps humains IL-7, 500 nanogrammes d’anticorps CD3 anti-humains et deux microgrammes d’anticorps anti-humains CD28 à chaque puits. Après quatre à sept jours, les cellules peuvent être collectées pour une analyse plus approfondie. Après la culture sur OP9-Delta-1 non gélatineux en présence du facteur humain de cellules souches, du FLT3-ligand humain, et de l’interleukin-7 humain, les progéniteurs hématopoïétiques se sont différenciés en CD3, CD7, CD4, et cd8 cellules doubles-positives de lignée de T, dont la majorité a exprimé des récepteurs de cellule T spécifiques à l’épitope de MART1.

Lorsque les lymphocytes T CD4, CD8 double-positifs ont été stimulés avec des anticorps anti-humains CD3 et CD28 en présence d’interleukine humaine-7 et 2, le nombre de cellules CD3-positives cd8 alpha bêta mono-positive a augmenté et est resté spécifique pour l’épitope MART1, confirmant la préservation de leur spécificité héréditaire d’antigène. Un test ELISpot a révélé que lorsqu’elles sont cultivés en présence de peptide MART1, les lymphocytes T alpha bêta positifs d’iPSC sécrètent des quantités plus élevées d’interféron gamma par rapport aux lymphocytes T alpha alpha en vrac et en CD8 alpha. Aucune expression gamma d’interféron n’a été détectée pour les cellules T et les cellules présentant des antigènes seules, démontrant que les cellules T-iPSC-dérivées humaines sont antigène-spécifiques et fonctionnelles.

Une étape importante dans cette méthode est l’enrichissement magnétique de perle de CD4 pour éliminer les cellules double-négatives cd8-négatives de CD4-négatives, qui peuvent causer la mise à mort directe des cellules double-positives sur la stimulation. Cette technique est applicable pour une utilisation avec plusieurs sources de cellules humaines, y compris les cellules souches hématopoïétiques et les cellules souches embryonnaires. Les cellules T immatures dérivées de l’iPSC générées par cette méthode pourraient être encore améliorées pour la génération de cellules T naïves spécifiques aux antigènes tumorales humaines matures pour un usage thérapeutique futur.

Après avoir regardé cette vidéo, le spectateur doit comprendre comment générer des lymphocytes T alpha bêta-positifs CD8 dérivés de l’iPSC à l’aide du système de co-culture OP9-Delta-1.