Name: Enregistrements tableau multi-électrodes des Avalanches neuronale dans des cultures organotypiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: Découvrez l'enregistrement des avalanches neuronales dans des cultures organotypiques de cortex et mésencéphale sur réseaux multi-électrodes. Cette méthode permet d'étudier la dynamique critique de l'activité cérébrale in vitro.

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Cette étude a été financée par la Division du programme de recherche intra-muros (PRID) de l&#39;Institut national de santé mentale, National Institutes of Health.

<ol><li>Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity+in+early+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical activity in early neuronal development.</a> Nature. 444, 707-712 (2006).</li>
<li>Beggs, J. M., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+in+neocortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches in neocortical circuits.</a> J. Neurosci. 23, 11167-11177 (2003).</li>
<li>Beggs, J. M., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+are+diverse+and+precise+activity+patterns+that+are+stable+for+many+hours+in+cortical+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches are diverse and precise activity patterns that are stable for many hours in cortical slice cultures.</a> J Neurosci. 24, 5216-5229 (2004).</li>
<li>Stewart, C. V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted-U+profile+of+dopamine-NMDA-mediated+spontaneous+avalanche+recurrence+in+superficial+layers+of+rat+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inverted-U profile of dopamine-NMDA-mediated spontaneous avalanche recurrence in superficial layers of rat prefrontal cortex.</a> J. Neurosci. 26, 8148-8159 (2006).</li>
<li>Stewart, C. V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis+of+neuronal+avalanches+during+postnatal+cortex+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Homeostasis of neuronal avalanches during postnatal cortex development in vitro.</a> J. Neurosci. Meth. 169, 405-416 (2007).</li>
<li>Gireesh, E. D., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+organize+as+nested+theta-+and+beta%2Fgamma-oscillations+during+development+of+cortical+layer+2%2F3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches organize as nested theta- and beta/gamma-oscillations during development of cortical layer 2/3.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 7576-7581 (2008).</li>
<li>Petermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+cortical+activity+in+awake+monkeys+composed+of+neuronal+avalanches%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Spontaneous cortical activity in awake monkeys composed of neuronal avalanches.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 15921-15926 (2009).</li>
<li>Kinouchi, O., Copelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+dynamical+range+of+excitable+networks+at+criticality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Optimal dynamical range of excitable networks at criticality.</a> Nature Physics. 2, 348-351 (2006).</li>
<li>Shew, W. L., Yang, H., Petermann, T., Roy, R., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+imply+maximum+dynamic+range+in+cortical+networks+at+criticality%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches imply maximum dynamic range in cortical networks at criticality.</a> J. Neurosci. 29, 15595-15600 (2009).</li>
<li>Shew, W. L., Yang, H., Yu, S., Roy, R., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+capacity+is+maximized+in+balanced+cortical+networks+with+neuronal+avalanches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Information capacity is maximized in balanced cortical networks with neuronal avalanches.</a> J Neurosci. 5, 55-63 (2011).</li>
<li>Karpiak, V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+maintenance+of+organotypic+cultures+for+multi-electrode+array+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and maintenance of organotypic cultures for multi-electrode array recordings.</a> Current Protocols in Neuroscience. 1, 6-6 (2002).</li>
<li>Hammerle, H., Egert, U., Mohr, A., Nisch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+recording+in+neuronal+networks+with+substrate+integrated+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Extracellular recording in neuronal networks with substrate integrated microelectrode arrays.</a> Biosens. Bioelectron. 9, 691-696 (1994).</li>
<li>Nisch, W., Bock, J., Egert, U., Hammerle, H., Mohr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin+film+microelectrode+array+for+monitoring+extracellular+neuronal+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A thin film microelectrode array for monitoring extracellular neuronal activity in vitro.</a> Biosens. Bioelectron. 9, 737-741 (1994).</li>
<li>Egert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organotypic+long-term+culture+of+the+rat+hippocampus+on+substrate-integrated+multielectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays.</a> Brain Res. Protoc. 2, 229-242 (1998).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Atlas+of+Prenatal+Rat+Brain+Development%22">Atlas of Prenatal Rat Brain Development</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1995).</li>
<li>Clauset, A., Shalizi, C. R., Newman, M. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+distributions+in+empirical+data%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Power-law distributions in empirical data.</a> arXiv. , (2009).</li>
<li>Plenz, D., Thiagarajan, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organizing+principles+of+neuronal+avalanches%3A+cell+assemblies+in+the+cortex%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The organizing principles of neuronal avalanches: cell assemblies in the cortex?</a> Trends Neurosci. 30, 101-110 (2007).</li>
<li>Cäser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp. Brain Res. 477, 234-244 (1989).</li>
<li>Cäser, M., Schüz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+neurons+in+neocortical+slice+cultures.+A+light+and+electron+microscopic+study+on+in+situ+and+in+vitro+material%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hirnforsch%22%5BJournal%5D)">Maturation of neurons in neocortical slice cultures. A light and electron microscopic study on in situ and in vitro material.</a> J. Hirnforsch. 33, 429-443 (1992).</li>
<li>Götz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vasoactive+intestinal+polypeptide+%28VIP%29-containing+neurons+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Development of vasoactive intestinal polypeptide (VIP)-containing neurons in organotypic slice cultures from rat visual cortex.</a> Neurosci. Lett. 107, 6-11 (1989).</li>
<li>Götz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+Preservation+of+cortical+layers+in+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation and Preservation of cortical layers in slice cultures.</a> J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Götz, M., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+target-specific+neuronal+projections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of target-specific neuronal projections in organotypic slice cultures from rat visual cortex.</a> Nature. 346, 359-362 (1990).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12, 3054-3070 (1992).</li>
<li>Novak, N., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+efferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus+and+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific efferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus and superior colliculus.</a> Eur. J. Neurosci. 5, 15-24 (1993).</li>
<li>Plenz, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+dynamics+in+cortex-striatum+co-cultures.+I.+Anatomy+and+electrophysiology+of+neuronal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural dynamics in cortex-striatum co-cultures. I. Anatomy and electrophysiology of neuronal cell types.</a> Neurosci. 70, 861-891 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+dynamics+in+cortex-striatum+co-cultures.+II.+Spatio-temporal+characteristics+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal dynamics in cortex-striatum co-cultures. II. Spatio-temporal characteristics of neuronal activity.</a> Neurosci. 70, 893-924 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cortex-striatum-mesencephalon+cultures%3A+the+nigro-striatal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Organotypic cortex-striatum-mesencephalon cultures: the nigro-striatal pathway.</a> Neurosci. Lett. 209, 177-180 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up%27+and+%27down%27+states+in+striatal+medium+spiny+neurons+simultaneously+recorded+with+spontaneous+activity+in+fast-spiking+interneurons+studied+in+cortex-striatum-substantia+nigra+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Up' and 'down' states in striatal medium spiny neurons simultaneously recorded with spontaneous activity in fast-spiking interneurons studied in cortex-striatum-substantia nigra organotypic cultures.</a> J. Neurosci. 18, 266-283 (1998).</li>
<li>Plenz, D., Herrera-Marschitz, M., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+organization+of+the+globus+pallidus-subthalamic+nucleus+system+studied+in+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Morphological organization of the globus pallidus-subthalamic nucleus system studied in organotypic cultures.</a> J. Comp. Neurol. 397, 437-457 (1998).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+basal+ganglia+pacemaker+formed+by+the+subthalamic+nucleus+and+external+globus+pallidus+%5Bsee+comments%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A basal ganglia pacemaker formed by the subthalamic nucleus and external globus pallidus [see comments].</a> Nature. 400, 677-682 (1999).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-frequency+oscillations+in+local+circuits+of+rat+somatosensory+cortex+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Generation of high-frequency oscillations in local circuits of rat somatosensory cortex cultures.</a> J Neurophysiol. 76, 4180-4184 (1996).</li>
<li>Klostermann, O., Wahle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+spontaneous+activity+and+morphology+of+interneuron+types+in+organotypic+cortex+and+thalamus-cortex+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterns of spontaneous activity and morphology of interneuron types in organotypic cortex and thalamus-cortex cultures.</a> Neurosci. 92, 1243-1259 (1999).</li>
<li>Cowan, R. L., Wilson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+firing+patterns+and+axonal+projections+of+single+cortico-striatal+neurons+in+the+rat+medial+agranular+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous firing patterns and axonal projections of single cortico-striatal neurons in the rat medial agranular cortex.</a> J. Neurophysiol. 71, 17-32 (1994).</li>
<li>Porter, L. L., Rizzo, E., Hornung, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+affects+parvalbumin+expression+during+cortical+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine affects parvalbumin expression during cortical development in vitro.</a> J Neurosci. 19, 8990-9003 (1999).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

1. Problèmes techniques: <ol><li> Technique stérile. La préparation de l&#39;AME et la préparation de la culture sont toutes effectuées dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles. Les antibiotiques, qui affectent l&#39;activité neuronale, ne sont pas utilisées à tout moment pendant le processus de préparation et de la culture. </li><li> Plasma / thrombine coagulation et l&#39;adhérence des tissus sur la survie des AEM. Tissu sur la MEA exige un équilibre délicat entre le temps requis pour le plasma / thrombine coagulation et le temps d&#39;exposition des tissus à l&#39;atmosphère. Un temps de coagulation courte risques décollement prématuré des sections de la MEA, tandis que l&#39;exposition prolongée à l&#39;atmosphère provoque la dégénérescence des tissus. Parce que la force de la solution de thrombine détermine la vitesse du processus de la coagulation, il est un paramètre très important pour réussir à fixer, des cultures saines à la surface de la MEA. Nous obtenons de meilleurs résultats à l&#39;aide de 1000 unités (1KU; 1 unité = 0,324 ± NIH 0,073 mg). Surtout, mélange incomplet des résultats solution de plasma / thrombine dans la coagulation du plasma spatialement hétérogènes promotion-ruptures en cours de culture. «Trous» Ces plasmatique gravement affecter la santé de la culture et de détacher la culture de microélectrodes, compromettant ainsi la qualité de l&#39;enregistrement électrophysiologiques. Travailler avec des plaques de refroidissement lors de la MEA / tissu montage ralentit la coagulation et permet un mélange homogène de la solution de plasma / thrombine et le bon positionnement des sections de tissus. De même, en ajoutant le milieu dans des gouttelettes unique pour la chambre de culture de submerger la culture, après seulement 5 min de la coagulation, réduit considérablement le risque de détachements de tissu due à des tensions de surface. Une culture réussie va aplatir sur la MEA et légèrement expansion montrant une croissance saine pendant des semaines, sans aucun des signes importants de tissus incomplète-MEA contact ou la dégénérescence des tissus (par exemple, Fig. 1D). </li><li> Dissection des tissus. Couteaux Micro ont grandement amélioré notre processus de dissection. Nous utilisons des lames de rasoir à double pointe (Outils Fine Science - cassables les lames de bistouri - 100050-00), à partir de laquelle nous avons divisé ~ 2 mm de large &quot;lames&quot; en utilisant une pince, et les maintenir avec un support de scalpel. Des échantillons de tissus disséqués de la tranche coronale en utilisant une surface lisse, mouvement ferme verticale de la lame ce qui réduit considérablement les contraintes mécaniques dues à la traction du tissu améliorer la santé globale de la culture. </li><li> Refroidissement des tissus. Refroidissement correct des tranches et des coupes de tissus lors de la préparation est essentielle pour la réussite de la culture. Nous utilisons des faits sur des assiettes froides construites d&#39;éléments Peltier attaché en dessous pour un disque de métal. La chaleur produite par l&#39;élément Peltier est enlevé par une perfusion d&#39;eau froide. Ceci réduit considérablement le temps de préparation et standardise le refroidissement pendant chaque étape de la préparation (Labs Dold &amp; Engineering 131 Plantation Dr Seguin, TX 78155;. (830) 560-1471)). </li><li> Incubateur état. Un incubateur sur mesure avec précision les conditions de bascule interne a été essentielle à notre succès à cultiver les tranches sur les AEM. Basé sur un original en interne la conception par Multichannelsystems (actuellement non disponible dans le commerce), l&#39;appareil bascule interne est composé de plateaux qui sont attachés aux deux roues grand côté. Les moteurs pas à pas et des contrôles informatisés permettant une trajectoire précise à bascule (rocking angle, bascule la vitesse, et pauses intermittentes). Finalement, les cultures tranche besoin d&#39;être exposés à moyenne atmosphère et la culture en alternance lente. L&#39;approche traditionnelle est de placer les cultures tranche dans des tubes étroits qui tournent lentement le long il axe le plus long. Ici, la rotation lente ne produit pas de contraintes mécaniques dues à la rotation elle-même, et la vitesse de rotation est suffisamment élevée pour obtenir un optimal »d&#39;alimentation / respiration» du cycle d&#39;environ 5 à 10 min durée. L&#39;intérieur plus compact de la chambre de la MEA, son volume total d&#39;environ 2 cc, et le volume de culture petit moyen nécessaire pour le conditionnement de support par le tissu lui-même, représente un défi important. En basculant la MEA entre ± ~ 70 ° d&#39;angle (temps de cycle: ~ 200 s), ce qui ralentit la vitesse de balancement que les transitions de la culture entre la phase liquide et l&#39;atmosphère, et l&#39;arrêt de la bascule au niveau des angles extrêmes d&#39;une exposition prolongée à l&#39;atmosphère a été essentielle pour la survie de la culture. </li></ol> 2. Le stade de développement des cultures à l&#39;étude du cortex avalanches neuronale Tranches de cortex de rats aiguë sont souvent prises au PND 0-1 et cultivées pendant plusieurs semaines sur la MEA. Les premières études ont clairement démontré que seule tranche de cultures cortex, après plusieurs semaines in vitro, de maintenir une structure en couches avec différents types cellulaires identifiables qui peuvent être facilement comparées aux classes de cellules in vivo 18,18-21. L&#39;organisation en couches dans ce système in vitro a été utilisée pour étudier commodément thalamiqueinnervation du cortex pendant le développement 22-24, ainsi que pour la conduite des structures sous-corticales comme le striatum 25,26. En fait, la spécificité de la formation des connexions neuronales au sein et entre les régions du cerveau permet la construction de complexes systèmes in vitro que la récupération de nombreux systèmes de projection détaillée, par exemple, que des ganglions de la base du cortex-circuits 27-30. Après 4 - 6 semaines in vitro, seule tranches et des tranches de cortex 31 cortex co-cultivées avec striatum 26 ou 32 montrent thalamus spontanée haut et le bas on trouve habituellement dans les États vivo chez le rat anesthésié uréthane 33. L&#39;organisation temporelle fine de ces états-place porte le poinçon de imbriquées θ et γ-oscillations indicative d&#39;un réseau électrophysiologique des neurones pyramidaux matures et fast-dopage interneurones GABAergiques 31. Surtout, en l&#39;absence de dopamine récepteur D2 de stimulation, la maturation de la parvalbumine-positif interneurones corticaux est retardée d&#39;environ deux semaines dans les cultures tranche de cortex 34. En ligne avec ces résultats, le cours du temps de développement de imbriquées θ-, β-et γ-oscillations est adaptée à celle in vivo lorsque tranches cortex sont co-cultivées avec l&#39;aire tegmentale ventrale (VTA), qui contient les neurones dopaminergiques se projetant vers l&#39; corticale 6. Ces études indiquent que lorsque l&#39;on étudie les avalanches neuronale, qui dépendent essentiellement matures inhibition GABAergique rapide et sont situés dans les couches superficielles du cortex 2,4, le plus grand soin doit être pris pour assurer la maturation adéquate du tissu cortical. Alors que les avalanches surviennent dans les cultures neuronales du cortex seule au cours du temps de 2 - 5 semaines 4, en exigeant un cours à temps de développement qui est adaptée à la développement in vivo, des tranches de cortex ont besoin de stimulation d&#39;un récepteur approprié de la dopamine, par exemple, par tranches de cortex co-culture avec le VTA 6.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Intégré array multiélectrodes planaire </td><td> Systèmes multicanaux ( <a href="www.multichannelsystems.com">www.multichannelsystems.com</a> ) ALA Scientific Instruments (Www.alascience.com) </td><td> <a href="http://www.multichannelsystems.com/products-mea/product-details/products/158/20030ir-ito-wo.html">200/30iR-ITO-w/o</a> </td><td> Titane nitrates (TiN) électrodes (30 mm de diamètre) ont une surface importante résultant en une faible impédance (~ 1,5 kQ à 1 kHz) et une excellente bande large enregistrements (w / o - sans anneau) </td></tr><tr><td> Chambre en verre </td><td> www.aceglass.com </td><td> 7620-32 </td><td> Cylindre de verre fileté </td></tr><tr><td> Chambre bouchon </td><td> www.aceglass.com </td><td> 7622-114 </td><td> Bouchon en plastique avec garniture en Teflon </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> www.wpiinc.com </td><td> SYLG184 </td><td> Élastomère de silicone en deux parties </td></tr><tr><td> Poly-D-lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407-5mg </td><td> γ-irradiés, poudre lyophilisée, cellule cultivée testés. Reconstitué avec 5 ml d&#39;eau désionisée avant usage. </td></tr><tr><td> Gey solution saline équilibrée </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9779-500ml </td><td> filtré stérile et cultivé testé </td></tr><tr><td> de poulet de plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3266-5mL </td><td> Lyophilisée, reconstituer avec 5 ml d&#39;eau déminéralisée avant utilisation. </td></tr><tr><td> thrombine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6634-1KU </td><td> à partir de plasma bovin, sous forme de poudre lyophilisée. </td></tr><tr><td> sérum de cheval </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H1138-100mL </td><td> troupeau donneur, inactivé par la chaleur, la culture de cellules testées </td></tr><tr><td> Medium base de Eagle </td><td> Invitrogen </td><td> 21010-046 </td><td> 1x, 500 ml - (+) des sels de Earle, (-) L-glutamine), </td></tr><tr><td> Hank solution saline tamponnée </td><td> Invitrogen </td><td> 24020-117 </td><td> 500 ml - (+) Magnésium, (+) de calcium, w / rouge de phénol) </td></tr><tr><td> Diapositives Chambre </td><td> Lab-Tek Chamber-Glissez w / couvercle (Nunc), stérile </td><td> 177429 </td><td></td></tr><tr><td> Uridine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U3003 </td><td></td></tr><tr><td> ARA-C-β-cytosine D-arabinofuranoside </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6645 </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluoro-2&#39;-désoxyuridine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td><td></td></tr></tbody></table>

enregistrements tableau multi-électrodes des avalanches neuronale dans des cultures organotypiques

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Le cortex est spontanément actif, même en l&#39;absence de toute entrée ou sortie particulière du moteur. Lors du développement, cette activité est importante pour la migration et la différenciation des types de cellules du cortex et de la formation des connexions neuronales 1. Dans l&#39;animal adulte, l&#39;activité continue reflète le passé et l&#39;état actuel d&#39;un animal dans lequel les stimuli sensoriels sont parfaitement intégrés pour calculer les actions futures. Ainsi, une compréhension claire de l&#39;organisation de cours de l&#39;activité spontanée savoir est une condition préalable pour comprendre la fonction du cortex. De nombreuses techniques d&#39;enregistrement a révélé que l&#39;activité continue dans le cortex est constitué de nombreux neurones dont les activités individuelles transitoirement somme à des événements plus importants qui peuvent être détectés dans le potentiel de champ local (LFP) avec des microélectrodes extracellulaires, ou de l&#39;électroencéphalogramme (EEG), le magnétoencéphalogramme (MEG ), et le signal BOLD de l&#39;imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf). La LFP est actuellement la méthode de choix lorsque l&#39;on étudie l&#39;activité de la population neuronale avec une résolution temporelle et spatiale à l&#39;échelle mésoscopique (plusieurs milliers de neurones). Lors de la microélectrode extracellulaire, localement synchronisées activités de résultat neurones spatialement neighbored de déflexions rapides dans la LFP jusqu&#39;à plusieurs centaines de microvolts. Lorsque vous utilisez un tableau de microélectrodes, les organisations de tels détournements peuvent être facilement surveillés dans l&#39;espace et du temps. Avalanches neuronale décrire l&#39;organisation invariante d&#39;échelle spatio-temporelle de l&#39;activité neuronale dans le cerveau continue 2,3. Elles sont spécifiques à des couches superficielles du cortex comme établi in vitro, 4,5, in vivo chez le rat anesthésié 6, et chez le singe éveillé 7. Surtout, les études théoriques et empiriques suggèrent que les avalanches 2,8-10 neuronale montrent une dynamique bien équilibré état ​​critique du cortex qui optimise le transfert de l&#39;information et de traitement de l&#39;information. Afin d&#39;étudier les mécanismes du développement neuronal avalanches, l&#39;entretien et la réglementation, dans des préparations in vitro sont très bénéfiques, car ils permettent des enregistrements d&#39;activité stable avalanches dans des conditions contrôlées avec précision. L&#39;actuel protocole décrit comment étudier les avalanches neuronales in vitro, en profitant du développement de la couche superficielle du cortex dans les cultures organotypiques, les cultures tranche-dire, cultivé sur planaires, les tableaux de microélectrodes intégré (AME; voir aussi 11-14).

Une manière robuste à l&#39;étude des avalanches neuronale, c&#39;est à dire invariante d&#39;échelle éclate l&#39;activité spatio-temporelle, indicative de la dynamique de l&#39;état critique dans le cortex. Avalanches émergent spontanément dans le développement de couches superficielles du cortex culture qui permet de mesures à long terme de l&#39;activité avec des tableaux intégrés planaires multi-électrodes (MEA) dans des conditions contrôlées avec précision.

Enregistrements tableau multi-électrodes des Avalanches neuronale dans des cultures organotypiques

Le cortex est spontanément actif, même en l'absence de tout stimulus d'entrée ou de sortie motrice particulière. Au cours du développement, cette activité est importante pour le...

L'objectif de cette expérience est d'étudier l'auto-organisation de l'activité cérébrale saine en avalanches neuronales, caractéristique des dynamiques à état critique dans le cortex. Cela est réalisé en combinant une tranche corticale coronale stratifiée avec une tranche de mésencéphale, qui fournit des entrées dopaminergiques importantes sur le plan développemental au cortex. Dans un deuxième temps, la culture mixte cortex-mésencéphale est cultivée sur une matrice multielectrode, ce qui permet de stimuler et d'enregistrer l'activité neuronale à plusieurs sites dans la culture.Ensuite, nous laissons la co-culture s'aplatir, s'étendre et s'attacher à la surface de la MEA pendant les une à deux premières semaines dans un incubateur conçu sur mesure, qui soumet la culture à des cycles d'exposition à l'air ambiant et au milieu de culture. Des résultats fluides sont obtenus, montrant l'auto-organisation spontanée de décharges de potentiels de champ locaux spatio-temporels en avalanches neuronales. Ces résultats sont basés sur des enregistrements à l'aide de la MEA et une analyse hors ligne des avalanches permettant d'identifier la loi de puissance dans les tailles d'avalanches.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les cultures dissociées, réside dans son aspect systémique et en neurosciences. Nous pouvons réaliser des co-cultures de nombreuses régions cérébrales simultanément, et ces cultures multi-régionales établissent une organisation cérébrale correcte à grande échelle, comme les couches corticales et les systèmes de projections. Les applications de cette technique vont au-delà de l'étude des avalanches neuronales.Par exemple, nous pouvons étudier le stimulus en réponse au niveau du réseau dans des conditions in vitro rigoureusement contrôlées. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car l'application correcte du mélange de thrombine plasmatique et le positionnement du tissu sur la MEA sont difficiles à maîtriser. Ces étapes exigent un chronométrage approprié, un gradient de température adéquat et l'évitement de tout contact direct avec la surface délicate de la MEA.Pour préparer une chambre en verre stérile et hermétique destinée aux enregistrements, commencez par couper des cylindres en verre filetés munis d'un bouchon en plastique en téflon, à environ deux millimètres du bas du filetage. Ces pièces sont nécessaires pour assurer une fermeture étanche et sécurisée de la chambre de culture. Ensuite, nettoyez les anneaux de verre en les rinçant trois fois à l'eau, puis en les faisant bouillir pendant cinq minutes dans de l'alcool éthylique à 200 degrés.Mettez-les de côté pour les faire sécher, car une solution de silicone est nécessaire pour fixer les anneaux de verre à la surface de la MEA. Utilisez un kit de caoutchouc de silicone Cell Guard 180 4 et mélangez soigneusement 15 millilitres des composants A et B. Laissez ensuite reposer pendant 15 minutes afin d'éliminer les bulles d'air.Séparez la solution en une prise d’un millilitre d’Eloqua, puis stockez-la à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Collez maintenant un anneau en verre sur la MEA en prélevant un millilitre de silicone à 23 degrés Celsius dans une seringue munie d’une aiguille de petit calibre, puis en l’appliquant sur la surface coupée non polie de l’anneau en verre. Centrez ensuite l’anneau en verre sur la MEA et appliquez une couche supplémentaire de silicone autour de l’extérieur de l’anneau afin d’obtenir un joint plus étanche.Laisser polymériser pendant une à deux heures à environ 60 degrés Celsius sur un agitateur chauffant. Ensuite, stériliser la chambre MEA et les bouchons de chambre sous hotte à flux laminaire en rinçant trois fois avec de l'eau déionisée, puis trois fois avec de l'alcool à 70 % pour le dernier rinçage. Laisser la chambre en contact avec l'alcool pendant 10 minutes.Procéder ensuite à l'exposition de la chambre et de l'intérieur du bouchon à la lumière UV pendant 10 minutes. Stériliser en autoclave à 120 degrés Celsius pendant 45 minutes. Une fois stérilisés, laisser ces éléments sécher.Recouvrez maintenant la surface de la MEA à l'intérieur de la chambre de culture avec de la poly-D-lysine. Les nouvelles MEAs utilisées dans cette expérience sont plutôt lipophiles ; appliquez donc le revêtement par ajout répété de gouttelettes. Aspirez la solution à partir de la grille d'électrodes.Fixer le bouchon afin de sceller la chambre MEA pour le stockage et une utilisation ultérieure. Cette procédure permet d'obtenir des sections de cortex et de VTA pour environ 12 cultures co-cultivées et doit être réalisée à l'intérieur d'une hotte à flux laminaire, en conditions stériles, en utilisant des animaux sains âgés de un à deux jours après la naissance ; le temps total de collecte des tissus ne doit pas dépasser une heure. Après la décaptitation, commencer l'extraction du cerveau en effectuant d'abord deux incisions latérales avec des ciseaux pour retirer la peau du cuir chevelu.Retirer puis ouvrir le crâne à l’aide de ciseaux oculaires fins, en effectuant une incision sagittale médiane et une incision coronaire au niveau de la jonction entre le cortex et le cervelet. Replier les quatre lamelles osseuses pour exposer le cerveau. Ensuite, à l’aide d’une spatule aiguisée, sectionner frontalement le bulbe olfactif.Ensuite, avancez la spatule par quarts sous le cerveau. Soulevez délicatement le cerveau hors du crâne et laissez-le glisser dans une solution de trempage refroidie pour un refroidissement rapide et un stockage temporaire.Répétez la procédure ci-dessus pour deux cerveaux supplémentaires. Pour obtenir le tissu de la VTA, transférez les cerveaux sur une boîte de Pétri stérile et sèche. À l’aide d’une petite spatule, éliminez tout excès de liquide en faisant doucement glisser chaque cerveau latéralement d’environ un centimètre.Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour retirer le tronc cérébral en effectuant une coupe verticale coronaire au niveau du cervelet. Collez maintenant un bloc d'agar sur un disque de fixation afin de stabiliser mécaniquement les cerveaux pendant la procédure de découpe. Placez ensuite un fin trait de colle super glue, quelques millimètres devant le bloc d'agar sur le disque, mais évitez que la colle touche l'agar à l’aide d'une petite spatule.Transférez et montez chaque cerveau avec le pôle frontal vers le bas. Veillez à ce que les pôles frontaux soient collés sur le disque de montage et que les faces ventrales touchent l'agar sans résidu de colle. Cela assure une stabilisation mécanique adéquate pendant la coupe et un détachement facile des tranches découpées.Ensuite, immergez et fixez soigneusement le disque de montage avec les cerveaux montés dans un plateau vibram rempli de solution de gaze refroidie. Puis, à l’aide d’un rasoir soigneusement nettoyé, découpez des sections coronales de 400 micromètres d’épaisseur du mésencéphale à la fréquence de vibration la plus élevée et à une vitesse d’avancement relativement faible. À l’aide d’une pipette à pâtes inversée munie d’une poire d’aspiration, récupérez et transférez les tranches contenant la VTA dans des boîtes de Pétri de 35 par 10 millimètres remplies de solution de gaze stérile et refroidie destinée aux sections corticales. Répétez les étapes de découpage précédentes, mais effectuez une incision verticale entre le cortex et le cervelet, puis montez les quatre cerveaux avec le pôle frontal vers le haut.Prélèvez environ trois tranches coronales d'une épaisseur de 350 micromètres, en commençant au niveau du striatum. À l’aide d’un microcouteau fabriqué à partir de lames de rasoir cassées, disséquez sous microscope stéréo des sections coronales d’environ deux millimètres de largeur, comprenant le cortex frontal et les régions du mésencéphale contenant la VTA. Récoltez chaque section tissulaire séparément dans de petits récipients remplis de solution de Gaze fraîchement refroidie.Pour commencer le montage du tissu dans la chambre MEA en position initiale, placez la MEA à température ambiante sous un microscope stéréo, en mettant l'array d'électrodes au point. Ensuite, centrez une goutte de 25 microlitres de plasma sur la matrice d'électrodes propre, exempte de poussière et stérile. À l’aide d’une petite spatule, faites glisser délicatement une section de cortex et de VTA dans la goutte de plasma.Placez maintenant la MEA sur une plaque de refroidissement et recentrez l’image. Laissez refroidir environ 15 secondes avant d’ajouter 25 microlitres de thrombine dans la goutte de plasma. Ensuite, à l’aide de la pipette de thrombine, étalez soigneusement le mélange plasma-thrombine en effectuant de petits mouvements circulaires sur toute la surface de la MEA.Veillez à ne pas toucher directement le réseau d'électrodes fragile. Ensuite, positionnez délicatement le cortex sur le réseau, en alignant la bordure dorsale le long de la deuxième rangée d'électrodes du réseau. Ainsi, les couches superficielles en développement couvriront éventuellement le reste du réseau.Placez ensuite la VTA adjacente à la bordure ventrale de la section corticale. Fermez maintenant le couvercle de la chambre MEA sans serrer afin de maintenir une humidité élevée. Laissez l'assemblage de culture MEA reposer environ six minutes dans la hotte à température ambiante pour permettre la coagulation par thrombine plasmatique et la rétraction.Entre-temps, répétez la procédure pour préparer trois cultures supplémentaires. Ensuite, ajoutez soigneusement en petites gouttes 600 microlitres de milieu de culture dans les chambres de culture, à l’aide d’une seringue d’un cm³ munie d’une aiguille de calibre 25 par cinq huitièmes. Puis fermez hermétiquement la chambre MEA et placez l’ensemble de culture MEA sur le plateau de stockage oscillant à l’intérieur de l’incubateur.Après deux jours in vitro, ajouter 10 microlitres d'inhibiteur de mitose. Ensuite, renouveler le milieu de culture à 60 % au quatrième jour in vitro, puis tous les quatre jours par la suite. Pendant la croissance normale, la culture s'aplatit considérablement et s'étend légèrement en direction dorsale.En raison du développement de couches corticales superficielles, une culture saine est identifiée par son tissu grisâtre opaque en champ clair. Inversement, la présence de vésicules brillantes et réfléchissantes, caractéristique des cellules dégénératives mortes, indique que les cultures sont prêtes pour l'enregistrement et la stimulation environ 10 à 12 jours après leur préparation. Pour commencer une session d'enregistrement, la MEA est transférée du plateau de stockage vers le support de la tête d'enregistrement.Pour enregistrer le potentiel de champ local ou LFP, utilisez un filtre passe-bande de un à 200 hertz. L'activité multiunitaire peut également être étudiée à l'aide d'un filtre passe-bande de 300 à 3000 hertz. L'activité spontanée saine a tendance à survenir en salves de taille et de durée variées.Pour étudier la relation entre les potentiels de champ locaux (LFP) et l'activité unitaire, nous pouvons calculer les moyennes déclenchées par les pics de LFP. Pour ces cultures corticales, les déflexions négatives des LFP sont corrélées aux décharges neuronales afin d'enregistrer l'activité induite par un stimulus. Tout d'abord, la forme d'onde temporelle et l'amplitude des stimuli sont définies à l'aide d'un logiciel qui contrôle un générateur de stimulus.Un paradigme de stimulation utile consiste en une impulsion unique, à onde carrée bipolaire et contrôlée en courant, neutre en charge. Ensuite, on sélectionne une électrode qui servira à délivrer les stimuli. Les réponses évoquées typiques du PCL aux stimuli présentent des allures similaires à celles des rafales d'activité spontanée.Le circuit de balayage déconnecte les amplificateurs pendant la stimulation afin de réduire les artefacts de stimulation et d'éviter la saturation de l'amplificateur. L'électrode de stimulation nécessite plusieurs secondes pour se rétablir après la stimulation et ne peut donc pas être utilisée pour enregistrer l'activité de réponse. Sur la MEA, l'activité a tendance à apparaître sous forme d'agrégats spatiotemporels, une activation en un site étant souvent accompagnée d'une activité sur d'autres sites.En même temps, les formes d'onde typiques du PCL pendant ces périodes d'activité sont montrées ici en superposant trois groupes survenant à plusieurs secondes d'intervalle pour chaque groupe. Des déflexions négatives du PCL peuvent être observées sur plusieurs électrodes dans une fenêtre d'une seconde lors de l'extraction des pics de PCLN qui franchissent un seuil de plusieurs écarts-types négatifs ; l'activité sous forme de temps de pics de PCLN est commodément visualisée dans un rasta où des colonnes de points représentent des PPSN quasi simultanés sur diverses électrodes. L'organisation spatiotemporelle de cette activité est plutôt complexe.Les colonnes qui apparaissent plus ou moins homogènes à faible résolution temporelle sont composées de grappes distinctes à plus haute résolution temporelle, et ainsi de suite. L’émergence de l’espace, des grappes géotemporelles et des grappes de potentiels de champ locaux (LFP) est fortement organisée dans les réseaux corticaux. Plus précisément, cette organisation est invariante d’échelle pour les avalanches neuronales.Cela est démontré en calculant la probabilité des tailles de groupes à une résolution temporelle donnée, Delta T. Ici, les groupes sont composés de PLSN qui surviennent dans les mêmes intervalles temporels ou dans des intervalles successifs ; lorsque la taille d'un tel groupe est exprimée par le nombre total de PLSN par groupe ou par les amplitudes intégrées de PLSN par groupe, la distribution des tailles de groupes suit une loi de puissance dont l'exposant est proche de -1,5. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de disséquer soigneusement le tissu cérébral et de cultiver des tissus sur des réseaux de microélectrodes afin d'étudier l'auto-organisation de l'activité neuronale.Ces méthodes ont également été utilisées pour étudier la relation entre l'activité spontanée et l'activité induite par un stimulus dans les réseaux corticaux.

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