Enregistrements tableau multi-électrodes des Avalanches neuronale dans des cultures organotypiques

Le but de cette expérience est d’étudier l’auto-organisation d’une activité cérébrale saine en avalanches neuronales, la marque de la dynamique d’état critique dans le cortex. Ceci est réalisé en combinant une tranche de cortex coronal en couches avec une tranche de mésencéphale, qui fournit des entrées dopaminergiques importantes pour le développement du cortex. Dans un deuxième temps, la co-culture du mésencéphale du cortex est cultivée sur un réseau de plusieurs électrodes, ce qui permet de stimuler et d’enregistrer plusieurs sites les activités neuronales dans la culture.

Ensuite, nous laissons la co-culture s’aplatir, s’étendre et se fixer à la surface de la MEA pendant les deux premières semaines dans un incubateur conçu sur mesure, qui fait passer la culture à l’exposition à l’air et à la culture normaux. Des résultats fluides sont obtenus qui montrent l’auto-organisation spontanée des éclats de potentiel de champ local spatio-temporel en avalanches neuronales. Basé sur les enregistrements MEA et l’analyse des avalanches hors ligne qui identifie la loi de puissance dans les tailles d’avalanche

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les cultures dissociées, est son aspect systémique, neuroscience. Nous pouvons co-cultiver de nombreuses régions du cerveau ensemble et ces cultures multirégionales établissent une organisation cérébrale correcte à grande échelle, comme les couches corticales et les systèmes de projection. Les applications de cette technique vont au-delà de l’étude des avalanches de neurones.

Par exemple, nous pouvons étudier les stimuli en réponse au niveau du réseau dans des conditions in vitro contrôlées avec précision. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’application correcte du mélange de thrombine plasmatique et le positionnement du tissu sur le MEA sont difficiles à apprendre. Ces étapes nécessitent un bon timing, le bon gradient de température et éviter de toucher directement la surface délicate du MEA.

Pour préparer une chambre en verre stérile scellable pour les enregistrements, coupez d’abord des cylindres de verre filetés avec un capuchon en plastique téflon, à environ deux millimètres du bas du fil. Ceux-ci sont nécessaires pour une fermeture sûre et étanche de la chambre de culture. Nettoyez ensuite les anneaux de verre en les rinçant trois fois à l’eau, puis en les faisant bouillir pendant cinq minutes dans de l’alcool éthylique à 200 degrés.

Mettez-les de côté pour sécher, une solution de silicone est nécessaire pour fixer les anneaux de verre à la surface MEA. Utilisez un kit d’élastomère de silicone Cell Guard 180 4 et mélangez soigneusement 15 millilitres des pièces A et B. Ensuite, asseyons-nous pendant 15 minutes pour éliminer les bulles d’air.

Séparez la solution en un millilitre d’Eloqua et conservez-la à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation future. Collez maintenant un anneau de verre sur le MEA en prélevant un millilitre de silicium à 23 degrés Celsius dans une seringue avec une aiguille de petit calibre et en l’appliquant sur la surface coupée non polie de l’anneau de verre. Centrez ensuite l’anneau de verre sur le MEA et appliquez une couche supplémentaire de silicone autour de l’extérieur de l’anneau pour une étanchéité plus solide.

Laissez durcir pendant une à deux heures à environ 60 degrés Celsius sur une plaque chauffante. Ensuite, stérilisez la chambre MEA et les capuchons de la chambre sous la hotte à flux lamina en rinçant trois fois à l’eau déminéralisée puis trois fois avec de l’alcool à 70 % pour le dernier rinçage. Laissez la chambre reposer pendant 10 minutes dans l’alcool.

Ensuite, exposez l’intérieur de la chambre et du capuchon à la lumière UV pendant 10 minutes. Autoclave à 120 degrés Celsius pendant 45 minutes. Une fois stérilisés, laissez-les sécher.

Enduisez maintenant la surface MEA à l’intérieur de la chambre de culture avec de la lysine poly D. Les nouveaux meas utilisés dans cette expérience sont plutôt lipophiles, donc enrobés par gouttelettes répétées. Aspiration de la solution à partir de la grille d’électrodes.

Fixez le capuchon pour sceller la chambre MEA pour le stockage et l’utilisation future. Cette procédure produit des coupes de cortex et d’ATV pour environ 12 co-cultures et doit être effectuée à l’intérieur d’une hotte à flux de lames dans des conditions stériles en utilisant des animaux sains un à deux jours après l’accouchement, le temps total pour la collecte de tissus doit être inférieur à une heure. Après la décapitation, commencez l’ablation du cerveau en faisant d’abord deux coupes latérales en ciseaux pour enlever la peau du cuir chevelu.

Retirez puis coupez le crâne à l’aide de ciseaux à œil fins, en faisant une coupe médiane sagittale sur une coupe coronale à la jonction cortex-cervelet. Retournez ces quatre rabats du crâne pour exposer le cerveau. Ensuite, à l’aide d’une spatule aiguisée, coupez frontalement à travers le bulbe olfactif.

Ensuite, avancez la spatule tous les jours sous le cerveau. Soulevez doucement le cerveau hors du crâne et laissez-le glisser dans un regard glacé. Solution pour le refroidissement rapide et le stockage temporaire.

Répétez la procédure ci-dessus pour deux autres cerveaux. Pour obtenir du tissu VTA, transférez les cerveaux dans une boîte de Pétri sèche stérile. À l’aide d’une petite spatule, retirez tout excès de liquide en faisant glisser doucement chaque cerveau sur le côté d’environ un centimètre.

Ensuite, à l’aide d’une lame de rasoir, vous pouvez retirer le tronc cérébral en effectuant une coupe coronale verticale au niveau du cervelet. Collez maintenant un bloc de gélose sur un disque de montage pour la stabilisation mécanique du cerveau pendant la procédure de tranchage. Placez ensuite une fine ligne de super colle, à quelques millimètres devant le bloc d’agar sur le disque, mais évitez que la colle ne touche l’agar à l’aide d’une petite spatule.

Transférez et montez chaque pôle frontal du cerveau vers le bas. Assurez-vous que les pôles frontaux sont collés sur le disque de montage et que les côtés ventraux touchent la gélose sans aucun résidu de colle. Cela assure une bonne stabilisation mécanique pendant la coupe et un soulèvement facile des tranches coupées.

Ensuite, immergez et fixez soigneusement le disque de montage avec les cerveaux montés dans un plateau vibram rempli de solution pour le regard réfrigéré. Ensuite, avec une lame de rasoir soigneusement nettoyée, des sections coronales de 400 micromètres d’épaisseur du mésencéphale à la fréquence de vibration la plus élevée et à une vitesse d’avancement relativement faible à l’aide d’une pipette à pâtes inversée avec poire d’aspiration, collectez et transférez les tranches contenant le VTA dans des boîtes de Pétri de 35 x 10 millimètres remplies de solution de regard réfrigéré stérile pour les sections corticales. Répétez les étapes de tranchage précédentes, mais appliquez une coupe verticale entre le cortex et le cervelet et montez les quatre cerveaux avec le pôle frontal vers le haut.

Prélever environ trois tranches coronales de 350 micromètres d’épaisseur en commençant au niveau du striatum. Maintenant, à l’aide d’un micro-couteau fait de lames de rasoir cassées, disséquez environ deux sections coronales d’environ deux millimètres de large du cortex frontal et des zones du mésencéphale contenant le VTA sous un stéréomicroscope. Recueillir la section de tissu séparément dans de petits plats remplis de solution pour le regard réfrigéré.

Pour commencer à monter le tissu dans la chambre MEA en première position, le MEA à température ambiante sous un stéréomicroscope avec le réseau d’électrodes au point. Centrez ensuite une gouttelette de plasma de 25 microlitres sur la matrice de réseau d’électrodes propre, sans poussière et stérile. À l’aide d’une petite spatule, glissez avec précaution une section de cortex et de VTA dans la gouttelette de plasma.

Placez maintenant le MEA sur une plaque de refroidissement et recentrez la vue. Laissez-le refroidir pendant environ 15 secondes avant d’ajouter 25 microlitres de thrombine dans la gouttelette de plasma. Ensuite, à l’aide de l’embout de la pipette de thrombine, répartissez soigneusement le mélange de thrombine plasmatique avec de petits mouvements circulaires sur le MEA.

Veillez à ne pas toucher directement le porte-électrodes cassant. Ensuite, positionnez doucement le cortex sur le réseau avec le bord dorsal le long de la deuxième rangée d’électrodes du réseau. De cette façon, les couches superficielles en développement finiront par couvrir le reste du réseau.

Placez ensuite le VTA adjacent au bord ventral de la section du cortex. Maintenant, bouchez et fermez sans serrer la chambre MEA pour conserver une humidité élevée. Laissez l’ensemble de culture MEA reposer pendant environ six minutes à l’intérieur de la hotte à température ambiante pour permettre la thrombine plasmatique, la coagulation et l’exaltation.

Pendant ce temps, répétez la procédure pour préparer trois autres cultures. Ensuite, en petites gouttelettes, ajoutez soigneusement 600 microlitres de milieu de culture dans les chambres de culture, à l’aide d’une seringue d’un cc avec une aiguille de calibre 25 par cinq. Fermez ensuite hermétiquement la chambre MEA et placez l’ensemble de culture MEA sur le plateau de stockage à bascule à l’intérieur de l’incubateur.

Après deux jours, in vitro, ajoutez 10 microlitres d’inhibiteur de mitose. Ensuite, rafraîchir le milieu de culture de 60 % après quatre jours in vitro et tous les quatre jours par la suite. Au cours d’une croissance normale, la culture s’aplatira considérablement et s’étendra légèrement vers le dos.

En raison du développement de couches corticales superficielles, une culture saine est identifiée par son tissu grisâtre opaque en fond clair. À l’inverse, les vésicules réfléchissantes brillantes, une caractéristique des cellules dégénératives mortes environ 10 à 12 jours après la préparation des cultures, sont prêtes pour l’enregistrement et la stimulation. Pour commencer une session d’enregistrement, le MEA est transféré du plateau de stockage à l’étage de tête d’enregistrement.

Pour enregistrer le potentiel de champ local ou LFP, utilisez un filtre passe-bande de un à 200 hertz. L’activité multi-unités peut également être étudiée à l’aide d’un filtre passe-bande de 300 à 3000 hertz. Une activité spontanée saine a tendance à se produire en rafales de tailles et de durées diverses.

Pour étudier la relation entre la LFP et l’activité unitaire, nous pouvons calculer des moyennes de LFP déclenchées par des pics. Pour ces cultures de cortex, les déviations négatives de la LFP sont corrélées avec les pics neuronaux pour enregistrer l’activité évoquée du stimulus. Tout d’abord, la forme d’onde temporelle et l’amplitude des stimuli sont spécifiées à l’aide d’un logiciel qui contrôle un générateur de stimulus.

Un paradigme de stimulation utile est le choc unique neutre en charge contrôlé par courant avec une forme d’onde carrée bipolaire. Ensuite, une électrode est sélectionnée, qui sera utilisée pour délivrer les stimuli. Les réponses LFP évoquées typiques des stimuli semblent similaires à des explosions d’activité spontanée.

Le circuit de suppression déconnecte les amplificateurs pendant la stimulation afin de réduire les artefacts de stimulus et d’empêcher la saturation de l’amplificateur. L’électrode de stimulation a besoin de plusieurs secondes pour récupérer de la stimulation et ne peut donc pas être utilisée pour enregistrer l’activité de réponse. Sur le MEA, elle a tendance à émerger en grappes spatio-temporelles avec une activité à une électrode, souvent accompagnée d’une activité sur d’autres sites.

Dans le même temps, les formes d’onde typiques de la LFP pendant de telles périodes d’activité sont illustrées ici en sur-traçant trois clusters se produisant à plusieurs secondes d’intervalle pour chaque cluster. Des déviations LFP négatives peuvent être observées à plusieurs électrodes dans une fenêtre d’une seconde lors de l’extraction de pics NLFP qui franchissent un seuil de plusieurs sd négatifs, l’activité sous forme de temps de crête NLFP est commodément visualisée dans un Rasta dans lequel les colonnes de points représentent un NPS presque coïncident à diverses électrodes. L’organisation spatio-temporelle de cette activité est assez complexe.

Les colonnes qui apparaissent plus ou moins homogènes à faible résolution temporelle sont composées de grappes distinctes à haute résolution temporelle et ainsi de suite. L’émergence des clusters spatiaux, GEOTEMPORELS et LFP est fortement organisée en réseaux corticaux. Plus précisément, l’organisation est à l’échelle en variante pour les avalanches neuronales.

Ceci est démontré en calculant la probabilité de tailles de cluster à une résolution temporelle donnée. Les clusters Delta T.Here sont composés de FPS NL qui se produisent dans les mêmes intervalles de temps ou dans des intervalles de temps successifs lorsque la taille d’un tel cluster est exprimée en nombre total de NFPS par cluster ou d’amplitudes NLFP intégrées par cluster, les distributions de taille de cluster révèlent une loi de puissance avec un exposant proche de moins 1,5. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer soigneusement le tissu cérébral et de cultiver des cultures sur des réseaux de multi-électrodes afin d’étudier l’auto-organisation de l’activité neuronale.

Ces méthodes ont également été utilisées pour étudier la relation entre l’activité spontanée et l’activité évoquée par stimulus dans les réseaux corticaux.