Visualisation de l'ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

L’objectif global de cette procédure est d’imager en temps réel des biomolécules telles que l’ADN et les protéines dans des tampons aqueux à l’aide de la microscopie à force atomique. Pour ce faire, il prépare d’abord les biomolécules à imager. Ensuite, le microscope à force atomique est installé et la sonde cantilever FM est positionnée.

La surface de l’échantillon et les biomolécules d’intérêt sont ensuite imagées et analysées. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la taille, la quantité et l’organisation générales de l’ADN et des protéines et des complexes biomoléculaires hétérogènes dans des conditions tamponnées grâce à la microscopie à force atomique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des chaperons moléculaires, telles que la géométrie STO des chaperons et le complexe des chaperons pour un client.

La démonstration visuelle de cette méthode est bénéfique, car les étapes de préparation de la sonde A FM et de la sonde à levier Kent peuvent être difficiles à apprendre à partir d’instructions imprimées, en grande partie à cause des subtilités associées à leur manipulation physique. Morgan Shannon et John Gertz, deux étudiants de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure pour commencer à isoler les molécules de protéine ou d’ADN à imager et les suspendre dans un tampon aqueux. Après avoir confirmé la pureté de l’échantillon, incubez-le dans un tampon d’absorption FM sur de la glace pour favoriser l’adhérence de l’échantillon au mica.

Pour les échantillons de protéines, utilisez un tampon de tas de 10 millimolaires. Et pour l’ADN contenant du magnésium, un tampon composé de 10 millimolaires, de pH 7,5, de 10 millimolaires de chlorure de sodium, de deux millimolaires de chlorure de magnésium convient pour monter la sonde A FM. Placez le support de sonde de cellule liquide sur la station d’accueil d’installation en porte-à-faux correspondante.

Localisez le long et épais porte-à-faux de la sonde à levier de nitrure pointue à utiliser pour l’imagerie. Transférez-le avec précaution dans le support de sonde à cellule liquide, en veillant à ce que l’embout reste droit. Ensuite, examinez le porte-à-faux au microscope optique pour vous assurer qu’il est intact et correctement inséré dans le support de sonde à cellule liquide.

Retirez ensuite avec précaution la tête FM de l’ensemble de queue d’aronde de l’instrument en serrant la vis de serrage de la tête neurale. Inversez la tête FM et poussez fermement le support de sonde de cellule liquide sur les quatre broches à la base de la tête FM. Enfin, remettez soigneusement la tête FM dans l’instrument d’assemblage de la queue.

Pour préparer davantage l’un FM avant d’imager des échantillons, déplacez les boutons du microscope optique embarqué pour localiser la pointe en porte-à-faux, ajustez les flèches haut et bas du contrôleur optique sur le logiciel pour faire la mise au point sur la pointe en porte-à-faux. Utilisez les boutons de réglage du laser pour aligner le laser sur la pointe en porte-à-faux. Il s’agit de l’une des étapes les plus difficiles techniquement du protocole : le positionnement se fait manuellement et nécessite un réglage précis du bouton.

Une surveillance attentive du laser dans le point de réflexion et le point d’éclairage augmente les chances de réussite de l’alignement. Ensuite, ajustez les boutons du photodétecteur sur la tête FM pour centrer le photodétecteur. Placez une feuille de MICA fraîchement clivée fixée à un disque d’échantillon métallique A FM sur le porte-échantillon aimanté au-dessus de la plaque de support A FM.

Faites pivoter la plaque de support FM de manière à ce que le disque de l’échantillon soit positionné pour l’imagerie initiale. Utilisez le contrôle de la surface de mise au point du logiciel de l’instrument pour déplacer la tête FM vers la surface du disque d’échantillon MICA. Jusqu’à ce que des caractéristiques distinctes sur la surface MICA ou la réflexion de la pointe soient nettes, sélectionnez l’icône de réglage dans le logiciel de l’instrument et accordez le cantilever.

La fréquence de résonance des sondes MSNL ou SNL recommandées est de 20 à 60 kilohertz. Sélectionnez un décalage de pic de 5 % pour imager l’échantillon MICA. Tout d’abord, engagez la sonde sur la surface MICA, réglez la taille de balayage initiale à 10 micromètres et la vitesse de balayage à un hertz.

Capturez des images de balayage complètes du champ de 10 micromètres. Réduisez ensuite la taille du balayage à cinq, un et 0,5 micromètre, et capturez des images complètes de chaque champ. Désengagez la sonde en cliquant une fois sur l’icône de désengagement du logiciel de l’instrument.

Pour imager les biomolécules d’intérêt, mélangez cinq microlitres de l’échantillon préparé avec 45 microlitres de tampon d’absorption frais. Ajoutez soigneusement 50 microlitres de la solution contenant une biomolécule de 0,5 microgramme par millilitre directement sur la surface des MICU. Faites une pause de cinq minutes pour permettre aux biomolécules de l’échantillon d’adhérer à la surface de Micah.

Ensuite, pipetez 50 à 100 microlitres supplémentaires de tampon d’absorption dans le support de sonde de cellule liquide. En faisant attention de ne pas toucher la sonde, une tête FM ou MICA avec la pointe de la pipette, réajustez le photodétecteur et réalignez le laser sur le cantilever si nécessaire. Utilisez ensuite le logiciel de l’instrument pour réengager la sonde.

Augmentez la taille du balayage pour identifier les régions d’intérêt. Une fois l’imagerie terminée, sélectionnez plusieurs fois l’icône de retrait sur le logiciel de l’instrument pour désengager la sonde. Enfin, utilisez de l’eau distillée pour rincer abondamment le support de sonde de cellule liquide et le disque d’échantillon.

Ensuite, essayez-le avec de l’air comprimé. Un exemple d’image A FM est présenté ici. Le substrat de mica fournit une surface moléculairement plane sur laquelle l’ADN et les protéines peuvent être absorbés.

L’imagerie MICA avant les échantillons de biomolécules fournit un contrôle négatif et une évaluation du bruit d’imagerie. Il fournit également un niveau d’assurance que le cantilever est correctement réglé et que l’imagerie ultérieure de l’échantillon sera réussie. L’ADN plasma double brin, présumé super-enroulé, est facilement identifiable par son apparence asymétrique et son dépôt uniforme sur le substrat de Micah, auparavant banal.

Les complexes protéiques de tailles de particules discrètes se distinguent également de manière unique du substrat Micah. Les différences de taille des particules indiquent l’hétérogénéité de l’échantillon et peuvent être utiles pour approximer les protéines, la géométrie stoïcienne complexe ou l’activité biochimique. La forme diagonale générale et l’orientation cohérente des particules de protéines observées.

Voici un artefact d’imagerie, car les protéines seraient orientées sur le substrat de Micah de manière aléatoire. Les causes possibles de l’artefact observé ou d’une anomalie physique de la pointe ou d’une imagerie FM à deux rapides d’une vitesse de balayage tandis que la convolution de la pointe empêche les calculs de mesure de la longueur absolue dans la mesure de la hauteur de l’axe x et Y ou de l’axe Z et des mesures relatives X et Y peuvent néanmoins être utiles pour estimer les propriétés biophysiques des biomolécules imagées. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de régler avec précision le porte-à-faux et d’aligner le photodétecteur En suivant cette procédure de base une procédure FM.

D’autres étapes, y compris l’utilisation d’une cellule de liquide d’échange de tampon, peuvent être ajoutées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la capacité des chaperons moléculaires à affecter la libération des récepteurs stéroïdiens à partir de leurs éléments de réponse à l’ADN. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de la façon d’imager les protéines d’ADN et les complexes biomoléculaires à l’aide de la microscopie à force atomique dans des conditions tamponnées.