Visualisation simple complexes moléculaires In Vivo Utilisation avancée de microscopie par fluorescence

Ici, nous démontrons le protocole permettant d'effectuer une microscopie de fluorescence à l'échelle de la molécule unique sur des cellules bactériennes vivantes, afin de détecter, suivre et quantifier des complexes moléculaires fonctionnels. Ce protocole commence par la culture de bactéries produisant une protéine marquée par une molécule fluorophore. Après quatre à six heures, un petit volume de cellules est prélevé à partir de la culture, puis les filaments des flagelles sont tronqués par cisaillement.

Un couvre-objet en verre à l'intérieur d'une cellule d'écoulement est revêtu afin de permettre aux cellules de s'attacher à la surface. Les cellules sont injectées dans la cellule d'écoulement et fixées au moyen d'une tige de gel, que l'on observe en fluorescence à l'aide d'une microscopie à excitation laser. Une caméra à haute efficacité quantique enregistre alors les images claires en champ clair et en fluorescence des complexes moléculaires marqués.

Bonjour, je m'appelle Ian Doy et je travaille avec Mark Lee au Département de biochimie de l'Université d'Oxford. Je suis Alex Robertson, travaillant avec Mark Lee au département de physique. Je suis Nick De du laboratoire Leak, également basé au département de physique.

Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure permettant de visualiser des complexes moléculaires uniques dans des bactéries vivantes à l'aide de la microscopie à fluorescence avancée. Nous utilisons cette procédure pour étudier ceci dans un état fonctionnel. Nous l'utilisons également pour étudier en temps réel la dynamique de machines biologiques naturelles à l'échelle nanométrique.

Commençons. Commencez par décongeler 50 microlitres de tiges congelées de bactéries E. coli. Ces bactéries ont été modifiées génétiquement.

Pour marquer une protéine avec une molécule de colorant fluorescent, inoculer cinq millilitres de milieu de culture LB et faire croître les bactéries en agitation aérobie toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, prélever 50 microlitres de la culture saturée et la sous-cultiver dans un milieu de culture minimal M 63 au glucose, puis incuber à 30 degrés Celsius pendant quatre à six heures. Deux souches cellulaires différentes sont utilisées ici.

Un des souches exprime un cytochrome transporteur d'électrons fusionné à la GFP. L'autre exprime une protéine impliquée dans le moteur du flagelle bactérien. Les cellules fusionnées à la GFP peuvent soit être récoltées directement à partir de la sous-culture en cours de croissance si elles doivent être observées comme des échantillons immobilisés, soit être soumises à un cisaillement pour tronquer les flagelles bactériens si elles sont observées en conditions liées.

Pour cisailler les bactéries, introduisez un à cinq millilitres de la sous-culture dans un dispositif composé de deux seringues stériles à l’aide d’un tube stérile. Poussez alternativement chaque piston de seringue afin de forcer la culture à passer environ 50 à 100 fois à travers le tube étroit, selon le degré de cisaaillement souhaité. Ensuite, centrifugez la culture pour former un culot cellulaire, puis resuspendez les cellules dans un milieu minimal afin d’éliminer les fragments de flagelles. Une fois les cellules prêtes, préparez des lamelles en verre BK7 propres en les immergeant dans une solution saturée d’hydroxyde de potassium et d’éthanol pendant 20 minutes.

Rincez soigneusement à l'eau déionisée et à l'éthanol, puis laissez sécher à l'air pendant au moins une heure. Ensuite, construisez une cellule d'écoulement simple pour accueillir les cellules dans le microscope. Pour ce faire, tracez des lignes de graisse au paraffine sur une lame de microscope en verre BK7, puis créez un tunnel en sandwich en plaçant l'une des lamelles nettoyées par-dessus.

Appuyez doucement avec une paire de forceps. Cela devrait donner un volume de la cellule d'écoulement compris entre cinq et dix microlitres. Pour observer les cellules immobilisées, remplissez la cellule d'écoulement en injectant une solution à 0,1 % de poly-L-lysine et laissez incuber à température ambiante pendant au moins une minute.

Ensuite, rincer la cellule d'écoulement en injectant 100 microlitres de milieu minimum à partir d'une extrémité de la cellule d'écoulement tout en aspirant simultanément le milieu à travers la cellule d'écoulement avec du papier essuie-tout à l'autre extrémité. Par la suite, ajouter 20 microlitres d'une dilution au 1/500 de microbilles de latex de 200 nanomètres de diamètre dans le milieu minimum afin de marquer la surface du coverslip. Placer la cellule d'écoulement dans une chambre d'humidité simple et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. La cellule d'écoulement est inversée de sorte que le coverslip soit orienté vers le bas.

Les billes non liées sont ensuite éliminées par lavage capillaire à l’aide de 100 microlitres de milieu minimal et de papier absorbant. Pour observer les cellules fixées, omettez plutôt l’étape d’incubation avec la poly-L-lysine, remplissez la chambre d’écoulement avec une solution d’anticorps anti-Flag gellan à cinq microgrammes par millilitre, puis placez-la dans une chambre humide pendant 10 minutes. Après l’incubation, rincez la chambre d’écoulement par capillarité à l’aide de papier absorbant.

Ensuite, aspirez 20 microlitres de la culture cellulaire à travers la cellule d'écoulement à l'aide de papier absorbant, en utilisant soit l'échantillon cisaillé pour observer les cellules fixées, soit l'échantillon non cisaillé pour examiner les cellules immobilisées ; la cellule d'écoulement est alors retournée et placée dans la chambre d'humidité pendant 20 minutes. Les cellules non liées sont ensuite éliminées par aspiration à travers 100 microlitres de milieu minimal. Déposez une goutte d'huile à immersion au centre de la surface supérieure du coverslip.

Placer délicatement la cellule d'écoulement sur le porte-échantillon du microscope à fluorescence conçu sur mesure. Cela doit établir un contact optique avec l'objectif à haute ouverture numérique. Ensuite, allumer la caméra à multiplication électronique du microscope et régler la caméra pour qu'elle soit refroidie à moins 70 degrés Celsius.

Le logiciel est configuré pour acquérir des images à une fréquence d'images typique de 25 hertz. En mode transfert d'image. Activez l'illumination en champ clair et mettez l'image au point.

Sélectionnez une cellule ou un groupe de cellules approprié à imager en fonction de leur position collée selon leur axe long. Parallèlement à la surface du lamelle, ajustez la mise au point afin que les billes de latex de 200 nanomètres collées à la surface du lamelle soient juste au point. Acquérez une séquence d'images en champ clair pour enregistrer le contour du corps cellulaire.

L'illumination en champ clair est ensuite désactivée et le gain de la caméra est activé au maximum pour l'acquisition d'images en fluorescence par réflexion totale interne, également connue sous le nom de turf. Démarrez l'acquisition avec la caméra et ouvrez l'obturateur du laser pour exciter les protéines fluorescentes au sein des bactéries. Les paramètres d'intensité du laser et de vitesse d'acquisition doivent être optimisés en fonction du système biologique particulier.

Les échantillons en cours d'étude sont illuminés jusqu'à ce qu'ils soient photodécolorés, ce qui prend généralement environ 10 secondes. Une fois les données recueillies, les images sont transmises à un programme d'analyse conçu sur mesure, qui détecte automatiquement les positions des points fluorescents dans les cellules avec une précision de quelques nanomètres et en extrait la taille et la luminosité. La luminosité du tracé de photodécoloration en fonction du temps du complexe moléculaire attractant est ensuite utilisée pour estimer la stœchiométrie utilisée.

Grâce à cette méthode, l'image des cellules observée en champ clair est très nette, de sorte que les contours des corps cellulaires apparaissent sombres par rapport à un corps cellulaire gris pâle, en utilisant la fluorescence avec des cellules immobilisées. Des points distincts d'intensité, d'une largeur typique de 250 à 300 nanomètres, peuvent être observés ici en fausses couleurs. Des cellules saines fixées peuvent être vues en rotation autour du point d'attachement du brin d'ancrage sur les images en champ clair sous excitation fluorescente.

Certains complexes moléculaires peuvent également être observés au point d'attachement, indiquant une localisation de la protéine associée au moteur de Geller. Ces points correspondent à des complexes moléculaires individuels. Le nombre de ces complexes observés dépendra du mode d'éclairage utilisé et du nombre de complexes effectivement présents dans la cellule à un moment donné.

Si la densité des points est initialement très élevée, comme c'est le cas avec les cytochromes marqués utilisés ici, alors la réalisation d'une photodétruction FRAP initiale peut améliorer le contraste de l'image. La mobilité des points dépend du système biologique spécifique étudié. Nous venons de vous montrer comment visualiser des complexes moléculaires uniques à l'aide de la microscopie à fluorescence avancée.

Lors de cette procédure, il est important d'éviter de provoquer un cisaillement des cellules, car cela pourrait altérer le fonctionnement du moteur flagellaire. Il est également important de ne pas laisser les cellules sur les lames de microscope plus d'une heure, car elles pourraient devenir déficientes en oxygène. Une automatisation est nécessaire pour trouver les meilleures conditions d'imagerie.

Il peut être utile d'utiliser la GFP purifiée seule pour déterminer la puissance laser appropriée pour votre système de microscope particulier. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.