Visualisation simple complexes moléculaires In Vivo Utilisation avancée de microscopie par fluorescence

Nous démontrons ici le protocole permettant d’effectuer la microscopie à fluorescence à molécule unique sur des cellules bactériennes vivantes afin de permettre la détection, le suivi et la quantification de complexes moléculaires fonctionnels. Ce protocole commence par la croissance de bactéries, qui fabriquent une protéine associée à une molécule de colorant fluorescent. Après quatre à six heures, un petit volume de cellules est extrait de la culture et leurs filaments de flagelle sont tronqués par cisaillement.

Une lamelle de verre à l’intérieur d’une cellule d’écoulement est recouverte d’un revêtement pour permettre aux cellules de coller à la surface. Les cellules sont injectées dans la cellule d’écoulement et attachées via un bout de gellaire, qui est observé en fluorescence à l’aide d’une microscopie d’excitation laser. Une caméra à haute efficacité quantique enregistre ensuite les images en fond clair et en fluorescence des complexes moléculaires marqués.

Bonjour, je m’appelle Ian Doy et je travaille avec Mark Lee au département de biochimie de l’Université d’Oxford. Je m’appelle Alex Robertson et je travaille avec Mark Lee au département de physique. Je suis Nick De du laboratoire des fuites, également basé dans le département de physique.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer la procédure de visualisation de complexes moléculaires uniques dans des bactéries vivantes à l’aide de la microscopie à fluorescence avancée. Nous utilisons cette procédure pour étudier cela dans un état fonctionnel. Nous l’utilisons également pour étudier la dynamique en temps réel de la machine biologique naturelle et de l’échelle nanométrique.

Alors commençons. Pour commencer, décongelez 50 microlitres de tiges congelées de bactéries E. coli. Ceux-ci ont été modifiés génétiquement.

Pour marquer une protéine avec une molécule de colorant fluorescent, inoculez cinq millilitres de milieu de croissance LB et cultivez les bactéries en secouant aérobiement pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, prenez 50 microlitres de la culture saturée et sous-cultivez-la dans un milieu de culture de glucose M 63 minimal à incuber à 30 degrés Celsius pendant quatre à six heures. Ici, deux souches cellulaires différentes sont utilisées.

L’un exprime un électron transportant le cytochrome fusionné à la GFP. L’autre exprime une protéine impliquée dans le moteur des flagelles bactériens. Les cellules fusionnées à la GFP peuvent soit être récoltées directement à partir de la sous-culture en croissance si elles doivent être considérées comme des échantillons immobilisés, soit être cisaillées pour tronquer les flagelles bactériens si elles sont observées dans des conditions attachées.

Pour cisailler les bactéries, placez un à cinq millilitres de la sous-culture dans un dispositif composé de deux seringues stériles par une tuyauterie stérile. Alternez les poussées dans chaque pousse-seringue pour forcer la culture à travers le tube étroit environ 50 à 100 fois selon l’étendue du cisaillement acquis Ensuite, centrifugez la culture pour granuler les cellules, puis remettez les cellules en suspension dans un minimum de milieu pour éliminer les fragments de flagelle. Une fois que les cellules sont prêtes, préparez des lamelles en verre BK sept nettoyées en les immergeant dans une solution saturée d’hydroxyde de potassium et d’éthanol pendant 20 minutes.

Rincez abondamment à l’eau déminéralisée et à l’éthanol et laissez sécher à l’air libre pendant au moins une heure. Ensuite, construisez une cellule d’écoulement simple pour loger les cellules dans le microscope. Pour ce faire, tracez des lignes de graisse de paraffine sur une lame de microscope en verre BK à sept verres, puis créez un sandwich tunnel en plaçant l’une des lamelles nettoyées sur le dessus.

Appuyez doucement avec une paire de pinces. Cela devrait donner un volume de cellule d’écoulement de cinq à 10 microlitres. Pour observer les cellules immobilisées, remplissez la cellule d’écoulement en injectant une solution à 0,1 % de poly L lysine et laissez-la incuber à température ambiante pendant au moins une minute.

Ensuite, il a rincé la cellule d’écoulement en injectant 100 microlitres de média minimal à une extrémité de la cellule d’écoulement et en évacuant simultanément le média à travers la cellule d’écoulement avec du papier de soie de l’autre par la suite, WIC a jeté 20 microlitres d’une dilution d’un sur 500 de microsphères de latex de 200 nanomètres de diamètre dans un média minimal pour marquer la surface de la lamelle. Placez la cellule d’écoulement dans une simple chambre d’humidité et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. La cellule d’écoulement est inversée de telle sorte que la lamelle soit tournée vers le bas.

Les perles non liées sont ensuite lavées par évacuation à travers 100 microlitres de support minimal avec du papier de soie. Pour observer les cellules attachées, sautez plutôt l’étape d’incubation de la poly L lysine, remplissez la cellule d’écoulement avec cinq microgrammes par millilitre de solution d’anticorps gellane Anti-Flag, puis placez-la dans une chambre d’humidité pendant 10 minutes. Après l’incubation, rincez la cellule d’écoulement en la faisant passer avec du papier de soie.

Ensuite, WIC 20 microlitres de la culture cellulaire à travers la cellule d’écoulement avec du papier de soie, soit en utilisant l’échantillon cisaillé pour observer les cellules attachées, soit l’échantillon non partagé pour voir les cellules immobilisées, la cellule d’écoulement est inversée et placée dans la chambre d’humidité pendant 20 minutes. Les cellules non liées sont ensuite lavées par mèche à travers 100 microlitres de milieu minimal. Placez une goutte d’huile d’immersion au centre de la surface supérieure de la lamelle.

Placez délicatement la cellule d’écoulement sur le porte-échantillon du microscope à fluorescence construit sur mesure. Cela devrait établir un contact optique avec l’objectif à grande ouverture numérique. Ensuite, allumez la caméra multiplicatrice d’électrons du microscope et réglez la caméra pour qu’elle soit refroidie à moins 70 degrés Celsius.

Le logiciel est configuré pour acquérir des images à une fréquence d’images typique de 25 hertz. En mode transfert d’image. Allumez l’éclairage en fond clair et faites la mise au point sur l’image.

Sélectionnez une cellule ou un groupe de cellules approprié à imager en fonction de leur collage sur leur axe long. Parallèlement à la surface de la lamelle, ajustez la mise au point pour vous assurer que les billes de latex de 200 nanomètres collées à la surface de la lamelle sont juste nettes. Acquérez une séquence d’images en fond clair pour enregistrer le contour du corps de la cellule.

L’éclairage en fond clair est alors désactivé et le gain de la caméra est activé au maximum pour l’imagerie utilisant la fluorescence à réflexion interne totale, également connue sous le nom de turf. Démarrez l’acquisition de la caméra et ouvrez l’obturateur laser pour exciter les protéines fluorescentes à l’intérieur des bactéries. Les paramètres d’intensité laser et de vitesse d’acquisition doivent être optimisés pour le système biologique particulier.

Sous l’étude, les échantillons sont éclairés jusqu’à ce qu’ils soient photoblanchis, ce qui prend généralement environ 10 secondes. Une fois les données collectées, les images sont introduites dans un programme d’analyse écrit personnalisé, qui détecte automatiquement les positions des points fluorescents dans les cellules avec une précision de quelques nanomètres et extrait leur taille et leur luminosité. La luminosité de la trace de photoblanchiment par rapport au temps d’attraction du complexe moléculaire est ensuite utilisée pour estimer l’utilisation de la stœchiométrie.

En utilisant cette méthode, l’image des cellules visualisées en fond clair est très distincte, de sorte que les périmètres des corps cellulaires sont sombres contre un corps cellulaire gris blanc utilisant la fluorescence avec des cellules immobilisées. Des taches distinctes d’intensité de 250 à 300 nanomètres de largeur peuvent être vues ici affichées en fausses couleurs. On peut voir des cellules attachées saines tourner autour du point de fixation de l’attache dans les images en fond clair sous excitation fluorescente.

Certains complexes moléculaires peuvent également être observés au point d’attachement, indiquant une localisation de la protéine tankée avec le moteur Geller. Ces taches sont des complexes moléculaires individuels. Le nombre de ceux-ci visibles dépendra du mode d’éclairage utilisé et du nombre de complexes réellement présents dans la cellule à un moment donné.

Si la densité des taches est initialement très élevée, comme c’est le cas avec les cytochromes marqués utilisés ici, alors la réalisation d’un premier javellisation peut améliorer le contraste d’imagerie. La mobilité des taches dépend du système biologique spécifique. Dans le cadre de l’étude, nous venons de vous montrer comment visualiser des complexes moléculaires uniques à l’aide de la microscopie à fluorescence avancée.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas avoir de cellules de cisaillement car cela pourrait nuire à la fonctionnalité du moteur du drapeau. Il est également important de ne pas laisser les cellules sur les lames de microscope pendant plus d’une heure, car elles pourraient s’appauvrir en oxygène. L’automatisation est nécessaire pour trouver les meilleures conditions d’imagerie.

Il peut être utile d’utiliser uniquement la GFP purifiée pour déterminer la puissance laser correcte pour votre système de microscope particulier. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.