Isolement de plusieurs types de cellules à partir d’un cerveau de souris par homogénéisation mécanique
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:27 min • July 8th, 2025
Commencez par placer les composants du broyeur de mouchoirs sur de la glace. Cet appareil comprend un mortier et deux pilons de diamètres différents.
Versez un tampon de sel réfrigéré dans le mortier, puis ajoutez du tissu cérébral de souris.
Le tampon maintient l’équilibre osmotique, préservant la structure et la fonction cellulaires.
Broyez le tissu en plusieurs coups doux à l’aide du pilon de plus petit diamètre, qui cisaille mécaniquement le tissu en petits morceaux.
Ensuite, caressez avec le pilon de plus grand diamètre, facilitant la décomposition du tissu en ses cellules composantes.
Transférez le mélange dans un tube et centrifugez.
Retirez le surnageant.
Ajoutez un tampon de sel réfrigéré et un vortex pour briser les amas cellulaires et la myéline.
Ensuite, ajoutez un milieu à gradient de densité et centrifugez.
En raison des différences de forme et de masse, les cellules se déposent dans la couche inférieure, tandis que les débris et la myéline s’accumulent dans la couche supérieure.
Jetez le surnageant.
Ajoutez une solution appropriée pour obtenir une suspension à plusieurs cellules pour une utilisation ultérieure.
Pour l’homogénéisation des tissus, ajoutez 3 millilitres de HBSS pré-refroidi dans le mortier en verre pré-refroidi d’un broyeur de tissus Dounce, et transférez la moitié d’un des cerveaux récoltés dans le mortier. Faites macérer doucement le tissu avec 10 coups de pilon A, suivis de 10 coups de pilon B, et transférez le mélange homogénéisé dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.
Remplissez le tube jusqu’à un volume final de 10 millilitres avec du HBSS pré-refroidi pour la centrifugation et remettez le granulé en suspension dans 7 millilitres de HBSS frais avec vortex avant de maintenir l’échantillon sur de la glace. Pour l’élimination des débris, ajoutez 3 millilitres de solution isotonique pré-refroidie à chaque échantillon digéré ou homogénéisé, et agitez doucement les échantillons pour vous assurer qu’ils sont mélangés de manière homogène.
Ensuite, centrifugez les échantillons et retirez soigneusement le disque blanchâtre de débris et de myéline flottant à la surface de la solution. Lorsque les débris ont été jetés, récupérez tous les microlitres de surnageant de chaque tube, sauf les 100 derniers microlitres, sans déranger les granulés. Remettre en suspension chaque pastille dans 1 millilitre de solution FACS/BL pour le transfert dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,5 millilitre.
Après la centrifugation avec la solution de particules, il est important de retirer le disque de débris et le surnageant très soigneusement, sans déloger la pastille de cellule, afin d’éviter la perte d’échantillon.
Après la centrifugation, aspirez soigneusement le surnageant de chaque tube et remettez les granulés en suspension dans 350 microlitres de FACS/BL frais par tube.
Aperçu
Cet article décrit un protocole d'isolement de cellules à partir de tissu cérébral de souris en utilisant un broyeur de tissus et des techniques de centrifugation. Le processus assure la préservation de la structure et de la fonction cellulaires tout en facilitant la séparation des cellules par rapport aux débris et à la myéline.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Traitement des tissus
Contexte
- L'isolement des cellules à partir de tissu cérébral est essentiel pour diverses applications de recherche.
- Le maintien de l'équilibre osmotique est crucial pour préserver l'intégrité cellulaire.
- L'utilisation de pilons de tailles différentes dans les broyeurs de tissus facilite une homogénéisation efficace.
- Les techniques de centrifugation permettent de séparer les cellules des débris indésirables.
Objectif de l'étude
- Décrire une méthodologie détaillée pour isoler des cellules viables à partir de tissu cérébral de souris.
- Mettre en évidence l'importance de la préservation de la structure cellulaire au cours du processus d'isolement.
- Illustrer l'utilisation de la centrifugation en gradient de densité pour la séparation cellulaire.
Méthodes utilisées
- Utilisation d’un homogénéisateur mécanique Dounce pour la fragmentation mécanique du tissu.
- Centrifugation pour séparer les cellules de la myéline et des débris.
- Vortexage pour assurer un mélange homogène des échantillons.
- Préparation de suspensions cellulaires multiples pour des analyses ultérieures.
Résultats principaux
- Isolation réussie de cellules viables à partir de tissu cérébral de souris.
- Élimination efficace des débris et de la myéline par centrifugation.
- Préservation de la structure et de la fonction cellulaires tout au long du processus.
- Préparation de suspensions cellulaires adaptées aux applications en aval.
Conclusions
- Le protocole décrit est efficace pour isoler des cellules à partir de tissu cérébral.
- Le maintien de conditions adéquates pendant le processus est crucial pour la viabilité cellulaire.
- Des études futures peuvent utiliser ces cellules isolées à diverses fins de recherche.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les professionnels
L'isolement de plusieurs types cellulaires à partir de tissu cérébral de souris permet la validation précoce des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans la découverte de médicaments en neurosciences. Cette méthode renforce la confiance prédictive en fournissant des suspensions cellulaires viables et exemptes de débris pour les criblages phénotypiques en aval et le développement d'essais. Elle répond à un point critique de découverte où la pertinence biologique et l'engagement de la cible doivent être confirmés expérimentalement avant l'identification de candidats prometteurs.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à un accès direct aux populations cellulaires cérébrales natives.
- Valeur opérationnelle : Fournit un matériau de départ reproductible pour les tests de validation fonctionnelle des cibles.
- Valeur prédictive : Contribue à l'atténuation des risques biologiques en confirmant la présence de la cible dans des cellules physiologiquement pertinentes.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des suspensions cellulaires normalisées adaptées au criblage phénotypique par cytométrie en flux.
- Valeur opérationnelle : Garantit la préparation des tests en assurant une élimination constante des débris et de la myéline qui interfèrent avec les résultats.
- Extensibilité : Facilite la préparation de plusieurs échantillons pour une évaluation parallèle de composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Préserve le contexte cellulaire pertinent pour la maladie, du stade de découverte à la validation préclinique.
- Alignement des biomarqueurs : Permet la mesure de l'engagement de la cible et de la modulation de la voie dans des cellules primaires.
- Avancement ajusté au risque : Soutient les décisions de poursuite ou d'abandon basées sur des données mécanistiques obtenues à partir de cellules dérivées de tissus natifs.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur une cible à l'identification d'un composé précurseur, en fournissant des entrées biologiquement pertinentes pour les cascades de criblage précoce.
- Biologie de la découverte : Facilite l'élucidation des voies biologiques et la validation des cibles en isolant des types cellulaires natifs à partir du cerveau de souris.
- Criblage : Fournit des suspensions exemptes de débris permettant des essais de criblage de composés et de liaison à la cible fiables.
- Analytique : Produit des résultats quantitatifs compatibles avec la cytométrie en flux et d'autres plateformes d'analyse unicellulaires.
- Recherche translationnelle : Relie la phase initiale de découverte aux travaux précliniques grâce au maintien du phénotype et de la fonction cellulaires.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une capacité de dissociation tissulaire réutilisable, applicable à l'ensemble des projets en neurosciences.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique lors de la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation de la préparation des cellules entre les équipes.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en permettant une détection précoce des risques associés aux cibles en neurosciences.
- Impact sur le portefeuille : Guide la priorisation ajustée au risque à partir de données empiriques issues de cellules cérébrales natives.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des tissus et les techniques d'homogénéisation mécanique.
- Suppose l'accès à des broyeurs tissulaires de type Dounce, à des centrifugeuses et à des environnements de travail à basse température.
- Exige une standardisation du nombre de passages de broyage et des volumes de tampon entre les utilisateurs.
- Implique des adaptations à envisager lors de l'application à différentes régions cérébrales ou à divers modèles de maladies.
- Est limitée par la nécessité d'un traitement immédiat afin de préserver la viabilité cellulaire et d'éviter la dégradation.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026