Isolement de plusieurs types de cellules à partir d’un cerveau de souris par homogénéisation mécanique

Commencez par placer les composants du broyeur de mouchoirs sur de la glace. Cet appareil comprend un mortier et deux pilons de diamètres différents.

Versez un tampon de sel réfrigéré dans le mortier, puis ajoutez du tissu cérébral de souris.

Le tampon maintient l’équilibre osmotique, préservant la structure et la fonction cellulaires.

Broyez le tissu en plusieurs coups doux à l’aide du pilon de plus petit diamètre, qui cisaille mécaniquement le tissu en petits morceaux.

Ensuite, caressez avec le pilon de plus grand diamètre, facilitant la décomposition du tissu en ses cellules composantes.

Transférez le mélange dans un tube et centrifugez.

Retirez le surnageant.

Ajoutez un tampon de sel réfrigéré et un vortex pour briser les amas cellulaires et la myéline.

Ensuite, ajoutez un milieu à gradient de densité et centrifugez.

En raison des différences de forme et de masse, les cellules se déposent dans la couche inférieure, tandis que les débris et la myéline s’accumulent dans la couche supérieure.

Jetez le surnageant.

Ajoutez une solution appropriée pour obtenir une suspension à plusieurs cellules pour une utilisation ultérieure.

Pour l’homogénéisation des tissus, ajoutez 3 millilitres de HBSS pré-refroidi dans le mortier en verre pré-refroidi d’un broyeur de tissus Dounce, et transférez la moitié d’un des cerveaux récoltés dans le mortier. Faites macérer doucement le tissu avec 10 coups de pilon A, suivis de 10 coups de pilon B, et transférez le mélange homogénéisé dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.

Remplissez le tube jusqu’à un volume final de 10 millilitres avec du HBSS pré-refroidi pour la centrifugation et remettez le granulé en suspension dans 7 millilitres de HBSS frais avec vortex avant de maintenir l’échantillon sur de la glace. Pour l’élimination des débris, ajoutez 3 millilitres de solution isotonique pré-refroidie à chaque échantillon digéré ou homogénéisé, et agitez doucement les échantillons pour vous assurer qu’ils sont mélangés de manière homogène.

Ensuite, centrifugez les échantillons et retirez soigneusement le disque blanchâtre de débris et de myéline flottant à la surface de la solution. Lorsque les débris ont été jetés, récupérez tous les microlitres de surnageant de chaque tube, sauf les 100 derniers microlitres, sans déranger les granulés. Remettre en suspension chaque pastille dans 1 millilitre de solution FACS/BL pour le transfert dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,5 millilitre.

Après la centrifugation avec la solution de particules, il est important de retirer le disque de débris et le surnageant très soigneusement, sans déloger la pastille de cellule, afin d’éviter la perte d’échantillon.

Après la centrifugation, aspirez soigneusement le surnageant de chaque tube et remettez les granulés en suspension dans 350 microlitres de FACS/BL frais par tube.