Isolement de cellules mononucléées à partir du cerveau de souris : une technique de centrifugation à gradient de densité pour isoler les cellules mononucléées résidentes du cerveau

Les cellules mononucléées du cerveau, comprenant les lymphocytes et les monocytes, jouent un rôle crucial dans le maintien de la fonction cérébrale et de l’homéostasie.

Pour isoler ces cellules mononucléaires, il faut d’abord prendre un cerveau de souris fraîchement récolté et imprégné de solution saline.

La perfusion permet d’éliminer le sang et ses composants des vaisseaux sanguins, ce qui permet d’isoler les cellules immunitaires résidentes du cerveau dans les étapes suivantes.

Maintenant, rincez le cerveau avec un produit approprié pour éliminer les globules rouges adhérents. Faites suivre le rinçage d’un hachage pour obtenir de petits morceaux de tissu.

Homogénéiser les morceaux de tissu pour obtenir une suspension de cellules uniques et de fragments cellulaires.

À cette suspension, ajoutez ensuite un média refroidi et un milieu à gradient de densité approprié dans des volumes appropriés pour former un milieu à gradient de faible densité.

Ensuite, ajoutez un volume spécifique d’un support dégradé à haute densité ; le média dégradé à haute densité forme une couche distincte en bas, créant ainsi un dégradé de densité discontinu.

Centrifuger la suspension à grande vitesse et à basse température. Les cellules mononucléées occupent l’interface entre les deux couches de milieux à gradient de densité.

Jetez la couche supérieure contenant les débris cellulaires et la myéline - la gaine de tissu adipeux entourant les axones des cellules nerveuses.

Transférez la couche d’interface dans un tube frais contenant un média approprié et centrifugez.

Les cellules mononucléées purifiées sédimentent sous forme de pastilles et peuvent être remises en suspension dans un tampon pour une analyse plus approfondie.

Coupez soigneusement le crâne du nez au cou et transférez le cerveau de chaque animal de la boîte crânienne dans des tubes individuels de 50 millilitres contenant 10 millilitres de milieu RPMI.

Mélangez bien les tubes pour éliminer les globules rouges adhérents et retirez le milieu par aspiration. Ajoutez 10 millilitres de milieu frais dans chaque tube et transférez les cerveaux dans des plats individuels de 100 millimètres.

Hachez finement chaque cerveau avec un rasoir et utilisez une pipette en plastique pour transférer autant de tissu d’un plat à la fois dans 6 millilitres de milieu dans un homogénéisateur en verre fritté de 7 millilitres glacé.

Broyez le cerveau à l’aide du piston « lâche » du pilon avant d’utiliser le piston « serré » pour amener le tissu jusqu’à ce que la suspension soit homogène. Ensuite, versez la boue tissulaire résultante dans un tube conique pré-refroidi de 15 millilitres sur de la glace.

Lorsque tous les échantillons ont été homogénéisés, ajustez le volume de chaque tube à 7 millilitres avec un milieu frais avant d’ajouter chaque suspension tissulaire dans un nouveau tube réfrigéré de 15 millilitres contenant 3 millilitres de matrice de membrane basale à 100 % par tube.

Mélangez par inversion plusieurs fois et utilisez une pipette de 3 millilitres pour ajouter soigneusement et lentement 1 millilitre de solution à gradient de densité de 70 % sous chaque échantillon de solution tissulaire.

Séparez les cellules par centrifugation à gradient de densité et retirez presque toute la couche supérieure, en prenant soin d’éliminer complètement toute la myéline.

Transférez l’interface dans un nouveau tube de 15 millilitres et ajustez le volume à 10 millilitres avec un fluide frais. Ensuite, centrifugez à nouveau les échantillons et retirez le surnageant avant de remettre les granulés en suspension dans environ 100 microlitres de milieu par tube.

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