La caractérisation et l’isolement des microglies primaire de souris par Centrifugation en Gradient de densité

L’objectif global de ce protocole est d’isoler une population de microglie de haute pureté chez les rongeurs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuroinformation, telles que l’identification des propriétés immunomodulatrices des cellules souches sur la microglie ou la réalisation de tests de dépistage de médicaments. Le principal avantage de cette technique est l’isolement d’une population de microglie de haute pureté sans qu’il soit nécessaire de passer un temps prolongé en culture.

Pour commencer cette procédure, insérez les pointes des ciseaux à travers l’ouverture du canal rachidien et faites des incisions latérales au conduit auditif. Ensuite, faites glisser doucement le tissu vers le rostre pour exposer le crâne. Ensuite, faites une incision le long de la suture sagittale vers le bregma.

Ensuite, insérez la pointe des ciseaux dans le bregma et faites des incisions latérales. Ensuite, retirez doucement le crâne pour exposer le cerveau. À l’aide d’une pince incurvée, retirez-le et transférez-le dans un récipient stérile de cinq millilitres.

Lavez-le deux à trois fois avec cinq millilitres de produit de lavage glacé par lavage pour éliminer le sang. Dans une hotte à flux d’air laminaire, placez le contenu du récipient de cinq millilitres dans une petite boîte de Pétri reposant sur de la glace. À l’aide d’une lame de scalpel stérile ou de ciseaux stériles, retirez le cervelet et le bulbe olfactif.

Ensuite, faites une coupe médiane pour séparer les deux hémisphères. Par la suite, identifiez la couche méningée comme une très fine couche de cellules avec une teinte rouge à la surface du cerveau avec des vaisseaux sanguins visibles. Retirez soigneusement la couche méningée à l’aide d’une pince fine en prenant soin de ne pas endommager les cortex.

Si la couche méningée se brise, continuez à décoller les fragments déchirés jusqu’à ce qu’ils soient complètement éliminés. Ensuite, transférez les hémisphères dans une nouvelle petite boîte de Pétri sur de la glace et remplissez-la de produit de lavage. Coupez le cerveau en petits morceaux avec une lame de scalpel stérile.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de papaïne et 150 microlitres de DNase1 dans le milieu et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après la digestion, triturez le tissu à l’aide d’une pipette P1000. Si les morceaux de tissu sont trop gros pour entrer dans la pipette, envisagez d’utiliser une paire de ciseaux stériles pour élargir la pointe de la pipette.

Au cours de ce processus, veillez à ne pas introduire de bulles dans le milieu car cela pourrait réduire la viabilité cellulaire. Dans une hotte à flux laminaire, préparez un tube conique de 50 millilitres avec une crépine à cellules de 100 micromètres. Versez le milieu de digestion et les morceaux de cerveau sur la passoire.

Poussez à travers les morceaux de cerveau à l’aide du piston d’une seringue stérile de trois millilitres dans un mouvement de grincement jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de tissu visible. Lavez continuellement le filtre avec le produit de lavage tout au long de ce processus. Cela permettra de laver toutes les cellules piégées dans la passoire.

Ensuite, centrifugez la suspension unicellulaire à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, préparez le Percoll isotonique en ajoutant un rapport de neuf pour un de milieu à gradient de densité à 10X HBSS stérile. Préparez des dégradés de 30 % SIP dans DMEM et de 70 % SIP dans one-X HBSS.

Par exemple, pour préparer 10 millilitres de SIP à 30 %, ajoutez trois millilitres de SIP à sept millilitres de DMEM. Ensuite, aspirez le surnageant du tube conique et remettez en suspension la pastille cellulaire avec huit millilitres de 30 % SIP dans DMEM. Transférez tout le volume dans un tube conique frais de 15 millilitres.

Ensuite, sous-couche la solution 70 % SIP en remplissant une pipette de transfert avec 70 % SIP et poussez soigneusement à travers la pipette de transfert jusqu’au bas du tube conique. Une fois que l’embout est près du fond, poussez doucement le contenu à travers la pipette de transfert. Par la suite, centrifuger les couches SIP y compris les cellules à 650 G avec frein zéro et accélération quatre pendant 25 minutes à température ambiante.

La couche de Percoll à 70 % doit être sous-jacente avec le plus grand soin. La perturbation de cette interface peut avoir un impact sévère sur le piégeage de la microglie dans la couche cellulaire et réduire considérablement les rendements. Ensuite, aspirez quatre millilitres de média avec des débris cellulaires par le haut du tube pour faciliter le retrait des cellules mononucléées à l’étape suivante.

Ensuite, abaissez soigneusement la pointe de la pipette vers l’interface et isolez les cellules mononucléées de l’interface du milieu à gradient de densité 30/70. Prélevez environ trois millilitres de l’interface trouble et transférez-les dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Ensuite, diluez le mélange avec neuf millilitres de HBSS pour faciliter l’élimination du milieu à gradient de densité.

Centrifuger l’interface du milieu à gradient de densité dilué contenant les cellules mononucléées à 500 G pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant et mettez-le en suspension avec un millilitre de milieu de croissance. Par la suite, colorez les cellules remises en suspension avec du bleu de trypan et effectuez une numération cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre.

Dans cette étape, centrifugez les cellules mononucléées collectées à 300 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer le milieu de croissance car cela interférerait avec l’isolation magnétique. En utilisant le même nombre de cellules obtenu précédemment, remettre en suspension à une fois 10 aux huit cellules nucléées par millilitre dans un PBS contenant 2 % de FBS et un EDTA millimolaire dans une plage de volume de 0,1 à 2,5 millilitres. Ensuite, ajoutez le volume complet de cellules nucléées dans du PBS dans un tube à fond rond en polystyrène frais de cinq millilitres.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de réactif de marquage CD11b PE par millilitre d’échantillon. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes à l’abri de la lumière. Après cela, ajoutez 70 microlitres de cocktail de sélection par millilitre d’échantillon.

Incuber à température ambiante pendant 15 minutes à l’abri de la lumière. Par la suite, mélangez les particules magnétiques en pipetant de haut en bas plus de cinq fois. Ajouter 50 microlitres par millilitre à l’échantillon et incuber à température ambiante pendant 10 minutes à l’abri de la lumière.

Si le volume total du mélange cellulaire est inférieur à 2,5 millilitres, complétez jusqu’à ce volume avec du PBS contenant 2 % de FBS et un millimolaire d’EDTA et mélangez en pipetant doucement deux à trois fois. Ensuite, placez le tube dans l’aimant et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. En un mouvement continu, retournez complètement l’aimant contenant le tube pendant deux à trois secondes pour évacuer le surnageant.

Remettez l’aimant en position verticale et retirez le tube de l’aimant. Ensuite, lavez les cellules restantes de la colonne en répétant les procédures. Suspendez à nouveau les cellules dans le milieu de croissance souhaité.

Rincez le côté du récipient de collecte pour prélever les cellules sur les côtés du tube et maximiser les rendements. Comme on peut le voir sur cette figure, les microglies primaires isolées conservent leur corps cellulaire sphérique et leur structure ramifiée distincte. Voici les faits représentatifs des graphiques de la microglie isolée.

La coloration combinée de l’annexine V et de l’iodure de propidium permet de catégoriser les cellules apoptotiques, nécrotiques ou vivantes après stimulation avec le LPS. Le milieu conditionné par hAEC a significativement réduit l’apoptose de la microglie par rapport aux témoins, suggérant une forme de protection sur ce type de cellule. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six à huit heures si elle est exécutée correctement.

Lors de l’exécution de cette méthode, il est important de faire très attention à la superposition du Percoll car cette étape aura le plus grand impact sur les rendements. À la suite de cette technique, d’autres procédures telles que le test de la fonction phagocytaire, ou la co-culture avec des neurones, peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires sur les propriétés immunomodulatrices du type de cellule de votre choix sur la microglie primaire. Après sa mise au point, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine pour découvrir comment la microglie primaire peut être modulée dans les lésions cérébrales périnatales.

Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie et au diagnostic des lésions cérébrales périnatales, car elle permet de caractériser un type de cellule immunitaire primaire connu pour être impliqué dans la neuroinformation qui conduit à un dysfonctionnement moteur et cognitif. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des troubles moteurs tels que la paralysie cérébrale, elle peut également être appliquée à d’autres troubles où la microglie joue un rôle dans la pathogenèse, comme la maladie d’Alzheimer. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons voulu une technique de caractérisation rapide de la microglie contournant les changements épigénétiques potentiels après une période prolongée en culture.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler une population de microglie de haute pureté pour la caractérisation en aval.