Imagerie de génération de secondes harmoniques dans un modèle de rat pour étudier les défauts de la tubuline

Commencez par une tranche de tissu cérébral de rat montée sur une lame de verre et immergée dans un tampon.

Le rat souffre de tubulinopathie, une affection causée par des défauts de la tubuline, les éléments constitutifs des microtubules, entraînant leur accumulation et leur perturbation anormales.

Cela affecte également la production de myéline dans le système nerveux central.

Placez la tranche sous un microscope à excitation à deux photons couvert pour une imagerie détaillée.

Hydratez régulièrement la tranche pour maintenir son intégrité.

Réglez le microscope sur un mode d’imagerie sans balayage, une technique sans marquage pour détecter les signaux faibles.

Exposez le tissu à un laser infrarouge pulsé.

Les microtubules émettent de la lumière sous forme de signaux détectables connus sous le nom de signaux de génération de seconde harmonique ou signaux SHG.

Les zones où l’accumulation de microtubules est anormale amplifient ces signaux, augmentant ainsi leur détectabilité.

Appliquez des filtres optiques pour affiner ces signaux.

L’image capturée révèle la densité et les anomalies des microtubules, dans lesquelles une intensité élevée de SHG et un regroupement indiquent des défauts de tubuline et une production réduite de myéline.

Placez l’échantillon sous le microscope et positionnez-le de manière appropriée sous l’objectif par observation directe à travers les oculaires avec lumière transmise. Retirez l’excès de HBSS de sorte qu’une fine pellicule liquide recouvre l’ensemble de l’échantillon. Vérifiez visuellement le film liquide toutes les quelques minutes pour éviter une évaporation et un séchage excessifs de l’échantillon.

Préparez la platine du microscope pour l’imagerie sans balayage, ce qui comprend la fermeture de toutes les portes de la chambre d’incubation sombre ou la couverture de la chambre d’incubation avec un tissu enduit de nylon et de polyuréthane noir. Sélectionnez le mode d’imagerie sans balayage le long du chemin de transmission. De cette façon, la capture du signal SH faible de la tubuline sera optimisée.

Sélectionnez ensuite l’objectif. Ensuite, réglez une puissance laser avec un temps de séjour des pixels de 12,6 microsecondes. Prenez des images ne dépassant pas 512 x 512 pixels, avec une vitesse de 5 et une moyenne de 2 pour un temps d’acquisition moyen de 15 secondes. Capturez d’abord des images à l’aide d’un filtre passe-court de 485 nanomètres. Et dans un deuxième temps, ajoutez un filtre passe-bande pointu de 405 nanomètres.