Synthèse Submonomer en phase solide de polymères et de leurs peptoïde auto-assemblage dans le hautement ordonné nanofeuillets

L’objectif général de cette procédure est de décrire une méthode simple et efficace pour la synthèse de peptides en phase solide et l’auto-assemblage aqueux de peptides en nano-feuillets hautement ordonnés. Structurellement similaire aux polypeptides, les peptides se trouvent dans des polymères de glycine substitués où les chaînes latérales sont attachées à l’azote plutôt qu’au carbone alpha. Le processus commence par la synthèse d’une séquence peptidique spécifique via une autre méthode de sous-monomère.

La méthode des sous-monomères consiste en deux étapes chimiques simples qui introduisent chaque monomère dans la chaîne de manière séquentielle. Tout d’abord, une amine attachée à un support solide est bromo-acétylée. Deuxièmement, le bromure est déplacé avec une amine primaire.

Ces étapes sont répétées jusqu’à ce que la longueur de chaîne souhaitée soit atteinte. Après l’allongement de la chaîne, le peptide est clivé du support solide et l’huile peptidique brute résultante est purifiée par HPLC et caractérisée pour initier l’auto-assemblage des peptides en nano-feuilles. Une solution tampon aqueuse diluée du peptide est préparée dans un flacon en verre et mélangée délicatement. Comme dernière étape.

Les nanofeuillets sont examinés au microscope. Les résultats démontrent qu’un cycle itératif de deux étapes chimiques simples peut produire un polymère spécifique à une séquence qui s’assemble spontanément en nano-feuilles. Les peptides sont une nouvelle classe de polymères bio-inspirés dont les propriétés se situent entre celles des protéines et des polymères traditionnels.

Ils sont robustes et synthétiquement polyvalents comme les polymères traditionnels, mais sont également hautement réglables et spécifiques à des séquences comme les protéines et les peptides d’ADN émergent comme un matériau avancé pour résoudre des problèmes clés en biomédecine et en science des matériaux, tels que l’identification de médicaments bioactifs ou la conception de protéines artificielles. Les principaux avantages des peptides comprennent un contrôle précis de la séquence, la disponibilité d’éléments constitutifs incroyablement diversifiés, une synthèse efficace et la stabilité de la protéase. La méthode générale de synthèse manuelle des peptides, impliquant un équipement de base et des réactifs disponibles dans le commerce, est décrite, permettant aux peptides d’être facilement synthétisés dans la plupart des laboratoires.

La démonstration visuelle des étapes de synthèse est essentielle et constitue une référence précieuse pour les personnes qui entrent dans le domaine de la synthèse en phase solide. Pour la première fois ici, la purification et la caractérisation d’un peptide amphiphile décrit ainsi que son auto-assemblage en nano feuillets hautement ordonnés. Commencer ce protocole par la configuration de l’appareil expérimental comme décrit dans le protocole écrit.

Les étapes suivantes seront effectuées dans un récipient de réaction en verre au lieu d’une cartouche frittée en polypropylène jetable pour plus de clarté. Après la mise en place à 100 milligrammes de résine R amide dans un récipient de réaction fritté, gonflez la résine en ajoutant deux millilitres de diméthyl forme amide ou de DMF, agitez en bouillonnant pendant 10 minutes. Égouttez ensuite la solution sous vide pour isoler la résine gonflée.

Ensuite, ajoutez un millilitre de méthylpyridine à 20 % dans du DMF pour protéger le groupe FM O. Agitez pendant deux minutes et égouttez. Répétez ce processus pendant 12 minutes, puis rincez la résine en ajoutant deux millilitres de DMF en agitant pendant 15 secondes et en égouttant.

Commencez à faire croître la chaîne peptidique avec le premier cycle de sous-monomères, qui comprend une bromo-acétylation et une étape de déplacement. Pour la bromo-acétylation, ajoutez un millilitre d’acide bromo-acétique 0,6 molaire dans du DMF et 86 microlitres d’acarien di isopropylcarbo . Après avoir agité pendant 30 minutes, égouttez et rincez avec deux millilitres de DMF.

Ensuite, effectuez le déplacement en ajoutant un millilitre d’amine une à deux molaires dans l’incubation finale de méthyl pyro genone pendant 30 à 120 minutes après l’incubation, égouttez et rincez avec deux millilitres de DMF. Encore une fois, continuez à développer la chaîne peptidique en répétant le cycle du sous-monomère. Une fois le déplacement final effectué, rincez avec deux millilitres de DMF.

Poursuivez avec un bouchon de lavage en méthane diora et stockez le récipient de réaction jusqu’à ce qu’il se décolle. Pour commencer le clivage, transférez toute la résine séchée dans un flacon en verre à scintillation de 20 millilitres travaillant à l’intérieur d’une hotte et, à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié, ajoutez quatre millilitres d’acide trifluoroacétique ou de cocktail de clivage TFA dans le flacon en verre à scintillation et le bouchon. Remuez bien pendant 10 minutes à deux heures à température ambiante.

Vous pouvez également utiliser un agitateur rotatif pour mélanger la solution. Récupérez la solution de clivage TFA en filtrant la résine à travers une cartouche frittée en polypropylène jetable dans un nouveau flacon en verre à scintillation de 20 millilitres pré-pesé. Ensuite, ajoutez un millilitre de cocktail de décolleté frais pour rincer la résine et recueillir tout peptide résiduel.

Répétez cette opération, rincez deux fois. Évaporez le TFA en soufflant un léger jet d’azote ou en utilisant une charge de biot. V 10 évaporateur rouge dissoudre le pétrole brut dans six millilitres d’un à un acéto nitrile et de l’eau.

Ensuite, congelez et lyophilisez l’échantillon. Ce processus doit être répété une fois de plus après la deuxième lyophilisation. Enregistrez le poids du stock de produit brut sous forme de poudre sèche à moins 20 degrés Celsius à l’aide d’une combinaison de HPLC analytique moisie et/ou d’électrospray LCMS.

La pureté du produit brut et la présence de la masse moléculaire souhaitée peuvent être déterminées en suivant les procédures décrites dans le texte. Le mélange peptidique brut peut ensuite être purifié à l’aide d’une HPLC de préparation en phase inverse conformément à la procédure écrite. Cette section décrit le protocole de formation de feuillets à partir d’une séquence de chaîne unique peptide amphiphile 36 me.

Une fois que le brin peptidique est synthétisé, purifié et lyophilisé, la poudre blanche résultante est dissoute dans du DMSO pour former une solution mère de deux millimolaires. Ensuite, procurez-vous une lime Dr.Glass pour préparer une solution de peptide de 20 micromolaires. Tout d’abord, ajoutez 445 microlitres d’eau milli Q et 50 microlitres de tampon de formation de 10 x feuilles.

Vortex la fiole à mélanger. Ajoutez ensuite cinq microlitres d’une solution mère de peptides de deux millimolaires et gonflez doucement. Les feuilles de solution résultantes sont formées par l’agitation douce de la solution peptidique aqueuse diluée.

Inclinaison lente du flacon en verre bouché de la position horizontale à la position verticale. Entraîne une agitation douce des feuilles, donne également des feuilles. Cependant, les feuilles ont tendance à être plus petites et avec moins de bords droits pour de nombreuses feuilles de haute qualité.

Faites pivoter lentement les flacons en verre autour de l’axe horizontal pendant une journée à l’aide d’un rotateur de tube ou d’une bascule personnalisée pour la coloration fluorescente des nano-feuilles, ajoutez un microlitre de 100 micromolaires de rouge du Nil à 100 microlitres de la solution de nano-feuillets pour obtenir une concentration finale d’une micromolaire du Nil. Le rouge est un colorant sensible à l’environnement dont l’intensité de fluorescence augmente lorsqu’il est localisé dans des environnements hydrophobes. Ensuite, préparez une solution à 1 % aros dans de l’eau chaude et versez dans une boîte de Pétri en plastique.

Assurez-vous que la solution aros a une épaisseur d’environ un huitième de pouce et laissez la solution refroidir sans être dérangée sur une surface plane. Une fois que l’aros a pris, utilisez une spatule pour couper des carrés d’un centimètre sur un centimètre. Transférez ensuite les carrés découpés sur une lame de verre pour recueillir les feuilles dans le même plan : placez un microlitre de solution de feuille sur le morceau d’aros.

Au bout de deux minutes, les aros devraient absorber le tampon en laissant les feuilles à la surface. Imagez la feuille dans les 15 minutes. Alternativement, pour imager des feuilles et une solution, chargez 15 microlitres à l’intérieur d’un joint de 20 millimètres de diamètre et de 0,12 millimètre sur une lame de verre.

Recouvrez l’échantillon d’une lamelle et d’une image en quelques jours pour effectuer une MEB de nano-feuilles. Tout d’abord, les puces de silicium gravées au plasma pour faciliter l’absorption des nano-feuilles. Ensuite, déposez 20 microlitres de solution en feuille de peptide sur un substrat de silicium traité au plasma et laissez la solution reposer après trois minutes, retirez l’excès de solution avec la pointe d’une pipette à essuyage Kim 20 microlitres d’eau sur la surface et évacuez à nouveau l’excès de solution pour éliminer le tampon et les sels.

Alternativement, les solutions de feuille de peptide sont dialysées contre l’eau pour éliminer le tampon et le sel. Dans ce cas, 20 microlitres de la solution en feuille dialysée peuvent être déposés sur les substrats de silicium traités au plasma et laissés sécher à l’air. Une fois que la solution en feuille a séché sur les substrats de silicium traités au plasma, la feuille peut être imagée par MEB à l’aide d’un détecteur à lentille à des énergies de faisceau comprises entre un kilovolt et cinq kilovolts.

La synthèse, la caractérisation et la purification d’un peptide de charge de bloc 36 me spécifique à une séquence qui se replie en une nanofeuille bidimensionnelle hautement ordonnée a été réalisée. Les amines utilisant la synthèse du peptide de charge de bloc 36 me vont transformer l’éthylène diamine en phénéthyle, amine et t butyl bêta alanine. Après la synthèse, le peptide brut a été clivé de la résine avec 95 % de TFA aqueux.

Après que la solution TFA a été collectée et évaporée. Le peptide brut de charge de bloc 36 me a été purifié par HPLC en phase inverse. La masse du peptide de charge de bloc purifié a ensuite été confirmée par du moisi.

La masse observée 4981,2 correspond étroitement à la masse calculée de 4981,74. La poudre lyophilisée a été dissoute dans du DMSO pour former une solution mère de deux millimolaires et stockée à quatre degrés Celsius. Les feuilles ont été préparées selon le protocole susmentionné et l’image a été obtenue par microscopie optique à fluorescence.

Une variété de formes avec des tailles allant jusqu’à 300 microns est observée, et notamment les bords droits sont proéminents. Le MEB a également été utilisé pour imager les feuilles, révélant de la même manière des bords droits proéminents. Cette vidéo décrit un protocole simple et efficace pour la synthèse de peptides à face solide et l’auto-assemblage aqueux de peptides en nanofeuillets.

Étant donné que des centaines de blocs de construction sont facilement disponibles et peuvent être utilisés dans ce protocole, l’espace de conception accessible avec les polypeptides est pratiquement illimité. Les peptides sont des matériaux prometteurs pour la biomédecine et la recherche en nanosciences en raison de leur flexibilité synthétique, de leur robustesse et de leur ordre. Au niveau atomique en particulier, les nano-feuilles servent de plate-forme potentielle pour les échafaudages d’affichage bidimensionnels, les mimétiques de membrane, les capteurs biologiques, les mimétiques de protéines et la fabrication de dispositifs.

Travailler avec des réactifs corrosifs tels que le trior, l’acide acétique et l’acide bromo-acétique est extrêmement dangereux pour prévenir les blessures, effectuer toutes les réactions dans une hotte et porter un équipement de protection individuelle approprié.