Synthèse Submonomer en phase solide de polymères et de leurs peptoïde auto-assemblage dans le hautement ordonné nanofeuillets

L'objectif général de cette procédure est de décrire une méthode simple et efficace de synthèse peptidique en phase solide et d'auto-assemblage aqueux de peptides en feuillets nanostructurés hautement ordonnés. Structurellement similaires aux polypeptides, les peptides sont des polymères de glycine substituée dont les chaînes latérales sont liées à l'azote plutôt qu'au carbone alpha. Le processus commence par la synthèse d'une séquence peptidique spécifique par la méthode du sous-monomère.

La méthode du sous-monomère repose sur deux étapes chimiques simples permettant d'insérer chaque monomère dans la chaîne de manière séquentielle. Premièrement, une amine fixée sur un support solide est bromoacétylée. Deuxièmement, le bromure est remplacé par une amine primaire.

Ces étapes sont répétées jusqu'à l'obtention de la longueur de chaîne souhaitée. Après l'allongement de la chaîne, le peptide est clivé du support solide et l'huile brute de peptide obtenue est purifiée par HPLC et caractérisée afin d'initier l'auto-assemblage des peptides en feuillets nanométriques. Une solution tampon aqueuse diluée du peptide est préparée dans un flacon en verre et mélangée délicatement. En dernière étape.

Les nano-feuillets sont examinés au microscope. Les résultats démontrent qu'un cycle itératif de deux étapes chimiques simples peut produire un polymère spécifique à la séquence qui s'auto-assemble spontanément en nano-feuillets. Les peptides constituent une classe nouvelle de polymères inspirés du vivant, dont les propriétés se situent entre celles des protéines et des polymères traditionnels.

Ils sont robustes et synthétiquement polyvalents comme les polymères traditionnels, mais également très ajustables et spécifiques en séquence, ce qui fait que les peptides, à l'instar des protéines et de l'ADN, émergent comme un matériau avancé permettant de résoudre des problèmes clés en biomédecine et en science des matériaux, tels que l'identification de médicaments bioactifs ou la conception de protéines artificielles. Les principaux avantages des peptides incluent un contrôle précis de la séquence, la disponibilité de blocs constitutifs incroyablement variés, une synthèse efficace et une stabilité vis-à-vis des protéases. La méthode générale de synthèse manuelle des peptides, impliquant un équipement de base et des réactifs disponibles dans le commerce, est décrite ici, permettant ainsi de synthétiser facilement des peptides dans la plupart des laboratoires.

La démonstration visuelle des étapes de synthèse est essentielle et constitue une référence précieuse pour les personnes qui s'initient au domaine de la synthèse en phase solide. Pour la première fois ici, la purification et la caractérisation d'un peptide amphiphile composé de 36 résidus sont décrites, ainsi que son auto-assemblage en feuillets nanostructurés hautement ordonnés. Commencez ce protocole par la mise en place de l'appareillage expérimental tel que décrit dans le protocole écrit.

Les étapes suivantes seront effectuées dans un récipient réactionnel en verre au lieu d'une cartouche frittée en polypropylène jetable, pour plus de clarté. Après avoir mis en place 100 milligrammes de résine R-amide dans un récipient réactionnel fritté, faites gonfler la résine en ajoutant deux millilitres de diméthylformeamide ou DMF, puis agitez par barbotage pendant 10 minutes. Ensuite, éliminez la solution sous vide afin d'isoler la résine gonflée.

Ensuite, ajoutez un millilitre de 20 % de pyridine complète dans le DMF pour déprotéger le groupe FM O. Agitez pendant deux minutes et éliminez le liquide. Répétez ce processus pendant 12 minutes, puis rincez la résine en ajoutant deux millilitres de DMF, en agitant pendant 15 secondes et en éliminant le liquide.

Commencez la croissance de la chaîne peptidique avec le premier cycle de sous-monomère, qui comprend une bromoacétylation et une étape de déplacement. Pour la bromoacétylation, ajoutez un millilitre d'acide bromoacétique 0,6 molaire dans le DMF et 86 microlitres de diisopropylcarbodiimide. Après agitation pendant 30 minutes, égouttez et rincez avec deux millilitres de DMF.

Ensuite, effectuez un déplacement en ajoutant un millilitre d'une amine d'une à deux molaire dans la méthyl pyrogénone, incubez pendant 30 à 120 minutes. Après l'incubation, égouttez et rincez avec deux millilitres de DMF. Poursuivez ensuite la croissance de la chaîne peptidique en répétant le cycle du sous-monomère. Une fois le déplacement final terminé, rincez avec deux millilitres de DMF.

Procéder ensuite par un bouchon de lavage au méthane diora et conserver le récipient de réaction jusqu'au clivage. Pour commencer le clivage, transférer toute la résine sèche dans un flacon en verre scintillateur de 20 millilitres, en travaillant sous une hotte et en utilisant des équipements de protection individuelle adéquats. Ajouter quatre millilitres d'acide trifluoroacétique, ou cocktail de clivage TFA, au flacon en verre scintillateur et boucher. Agiter vigoureusement de 10 minutes à 2 heures à température ambiante.

Alternativement, utiliser un agitateur rotatif pour mélanger la solution. Recueillir la solution de clivage TFA en filtrant la résine à travers une cartouche frittée en polypropylène jetable dans un nouveau tube en verre de scintillation de 20 millilitres préalablement pesé. Ensuite, ajouter un millilitre de nouveau mélange de clivage pour rincer la résine et récupérer tout peptide résiduel.

Répétez cette opération, rincez deux fois. Évaporez l'acide trifluoroacétique en faisant passer un courant doux d'azote ou en utilisant un évaporateur à charge biot. À l'aide d'un évaporateur rotatif, dissolvez l'huile brute dans six millilitres d'un mélange d'acétonitrile et d'eau en proportion égale.

Ensuite, congeler et lyophiliser l'échantillon. Ce processus doit être répété une fois supplémentaire après la deuxième lyophilisation. Enregistrer la masse du produit brut et le conserver sous forme de poudre sèche à moins 20 degrés Celsius à l'aide d'une combinaison de HPLC analytique sur colonne moisie et/ou de LC-EM à ionisation par électrospray.

La pureté du produit brut et la présence du poids moléculaire souhaité peuvent être déterminées en suivant les procédures décrites dans le texte. Le mélange peptidique brut peut ensuite être purifié par HPLC préparative en phase inverse selon la procédure écrite. Cette section décrit le protocole permettant de former des feuillets à partir d'une séquence peptidique amphiphile monomérique spécifique de 36 me.

Une fois le peptide synthétisé, purifié et lyophilisé, la poudre blanche obtenue est dissoute dans du DMSO afin d'obtenir une solution mère de deux millimolaire. Ensuite, prélevez un fichier Dr.Glass pour préparer une solution peptidique de 20 micromolaire. Commencez par ajouter 445 microlitres d'eau milli Q et 50 microlitres de tampon 10 x de formation de feuillets.

Vortexez le flacon pour mélanger. Ajoutez ensuite cinq microlitres d'une solution mère de peptide à deux millimolaire et laissez gonfler doucement. Les feuillets de la solution obtenue se forment par agitation douce de la solution aqueuse diluée de peptide.

Incliner lentement le flacon en verre bouché depuis la position horizontale jusqu'à la position verticale. Cela entraîne un brassage doux en couches, produisant également des feuillets. Toutefois, les feuillets ont tendance à être plus petits et à présenter moins de bords droits par rapport à de nombreux feuillets de haute qualité.

Faire tourner lentement les vials en verre autour de l'axe horizontal pendant un jour à l'aide d'un rotateur de tubes ou d'un berceur personnalisé pour la coloration fluorescente de nano-feuillets, ajouter un microlitre de rouge Nil à 100 micromolaire à 100 microlitres de la solution de nano-feuillets afin d'obtenir une concentration finale de un micromolaire de rouge Nil. Le rouge Nil est un colorant sensible à l'environnement dont l'intensité de fluorescence augmente lorsqu'il se localise dans des environnements hydrophobes. Ensuite, préparer une solution d'aros à 1 % dans de l'eau chaude et verser dans une boîte de Petri en plastique.

Veillez à ce que la solution d'aros ait une épaisseur d'environ un huitième de pouce et laissez-la refroidir sans perturbation sur une surface plane. Une fois que la solution d'aros a pris, utilisez une spatule pour découper des carrés d'un centimètre sur un centimètre. Transférez ensuite les carrés découpés sur une lame de verre afin de recueillir les feuillets dans le même plan, puis déposez un microlitre de solution de feuillets sur le morceau d'aros.

Après deux minutes, les aros devraient absorber le tampon, laissant les feuillets en surface. Imager le feuillet dans les 15 minutes. Alternativement, pour imager les feuillets et charger la solution, déposer 15 microlitres à l’intérieur d’un joint de 0,12 millimètre d’épaisseur et de 20 millimètres de diamètre sur une lame de verre.

Couvrez l'échantillon avec une lame de couverture et observez-le en microscopie électronique à balayage (MEB) dans les quelques jours suivant pour analyser les nanofeuillets. Commencez par graver au plasma les puces de silicium afin de favoriser l'adsorption des nanofeuillets. Ensuite, déposez 20 microlitres de solution de feuillets peptidiques sur un substrat de silicium traité au plasma et laissez reposer la solution pendant trois minutes. Retirez ensuite l'excès de solution à l'aide de la pointe d'un essuie-tout, ajoutez 20 microlitres d'eau sur la surface, puis aspirez à nouveau l'excès de solution afin d'éliminer le tampon et les sels.

Alternativement, les solutions de feuillets peptidiques sont dialysées contre de l'eau afin d'éliminer le tampon et le sel. Dans ce cas, 20 microlitres de la solution de feuillets dialysée peuvent être déposés sur les substrats de silicium traités au plasma et laissés à sécher à l'air. Une fois la solution de feuillets sèche sur les substrats de silicium traités au plasma, le feuillet peut être observé en MEB à l'aide d'un détecteur en lentille, avec des énergies de faisceau comprises entre un kilovolt et cinq kilovolts.

La synthèse, la caractérisation et la purification d'un peptide chargé en bloc de 36 mètres présentant une séquence spécifique et se repliant en une nano-feuille bidimensionnelle hautement ordonnée ont été réalisées. Les amines utilisées lors de la synthèse du peptide chargé en bloc de 36 mètres lieront l'éthylènediamine au phényléthylamine et à la β-alanine t-butyle. Après la synthèse, le peptide brut a été clivé de la résine à l'aide de TFA aqueux à 95 %.

Après avoir récupéré et évaporé la solution de TFA, le peptide brut à charge bloquée 36 me a été purifié par HPLC en phase inverse. La masse du peptide à charge bloquée purifié a ensuite été confirmée par spectrométrie de masse.

La masse observée de 4981,2 correspond étroitement à la masse calculée de 4981,74. La poudre lyophilisée a été dissoute dans du DMSO afin d'obtenir une solution mère de deux millimolaire, puis stockée à quatre degrés Celsius. Les lames ont été préparées selon le protocole susmentionné et observées par microscopie optique en fluorescence.

Une variété de formes aux dimensions allant jusqu'à 300 microns est observée, et des bords particulièrement droits sont apparents. La microscopie électronique à balayage (MEB) a également été utilisée pour imager les feuillets, révélant de manière similaire des bords droits marqués. Cette vidéo décrit un protocole simple et efficace pour la synthèse en phase solide de peptides et l'auto-assemblage en milieu aqueux de peptides en nano-feuillets.

Étant donné que des centaines de précurseurs d'acides aminés sont facilement disponibles et peuvent être utilisés dans ce protocole, l'espace de conception accessible avec les polypeptides est pratiquement illimité. Les peptides constituent des matériaux prometteurs pour la recherche en biomédecine et en nanoscience en raison de leur flexibilité synthétique, de leur robustesse et de leur capacité à s'organiser. À l'échelle atomique en particulier, les feuillets nanostructurés offrent une plateforme potentielle pour des échafaudages d'affichage bidimensionnels, des mimes de membranes, des capteurs biologiques, des mimes de protéines et la fabrication de dispositifs.

Travailler avec des réactifs corrosifs tels que le trio, l'acide acétique et l'acide bromoacétique est extrêmement dangereux ; afin d'éviter toute blessure, effectuez toutes les réactions sous hotte chimique et portez des équipements de protection individuelle adaptés.