Protocole facile pour la synthèse d’auto-assemblage axée sur les polyamines peptides Amphiphiles (AAE) et des biomatériaux

Cette méthode peut répondre à des questions clés sur la façon de décorer les amphiphiles peptidiques en polyamines et sur l’utilisation de groupes protecteurs octogonaux Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez générer des amphiphiles peptidiques hybrides avec des blocs de construction chimiques non protégés contenant plusieurs côtés réactifs. Mehdi, Nathalia et Krishnaiah, étudiants en laboratoire du laboratoire Conda Sheridan, feront la démonstration de la procédure. Tout d’abord, pesez soigneusement la résine de chlorure de 2-chlorotrityle et placez-la dans un récipient de synthèse fritté, à porocité moyenne, d’une capacité de 50 millilitres.

Ensuite, fixez le récipient de synéthèse à un agitateur mécanique à vitesse variable et tournez le récipient à un angle de 45 degrés pour maximiser l’agitation. Ajoutez ensuite 15 millilitres de DCM à la résine. Après avoir laissé gonfler les billes de résine pendant 15 minutes, ajoutez huit équivalents de la polyamine souhaitée à la résine et laissez-la réagir pendant cinq heures.

Après cinq heures, effectuez un test de kaiser pour confirmer une réaction réussie de la polyamine à la résine. Ensuite, protégez le groupe amine primaire en ajoutant quatre équivalents de DDE dans du méthanol anhydre et en agitant le mélange réactionnel pendant la nuit. Le lendemain, effectuez un test de kaiser pour confirmer la protection réussie par l’absence de couleur bleue de la perle de résine.

Ensuite, égouttez le DCM et lavez la résine deux fois avec un mélange de DCM et de DMF. Maintenant, ajoutez 20 équivalents d’anhydride Boc dans du DCM à la résine et laissez la réaction se poursuivre pendant trois heures. Après avoir effectué un test au chloranil pour confirmer la protection de l’amine secondaire, égouttez le mélange de solvant et lavez la résine deux fois avec un mélange deux pour un de DCM et de DMF.

Ensuite, ajoutez 10 millilitres d’une solution à 2 % d’hydrazine dans du DMF à la résine. Après avoir secoué pendant une heure, effectuez un test de Kaiser pour confirmer la déprotection réussie de l’amine primaire. Ensuite, mélangez quatre équivalents de l’acide aminé protégé par le Fmoc, 3,95 équivalents de HBTU et 15 équivalents de DIPEA.

Ajouter un mélange individuel de DCM et de DMF et soniser le cocktail jusqu’à dissolution complète. Assurez-vous que l’acide aminé, l’agent de couplage et le DIPEA sont vraiment mélangés et activés avant d’ajouter le mélange à la résine. Après avoir attendu trois à cinq minutes pour assurer l’activation de l’acide carboxylique, ajoutez le mélange réactionnel dans le récipient contenant la résine et laissez la réaction se dérouler pendant deux à quatre heures à température ambiante.

Effectuez un test de kaiser ou de chloranil à chaque étape pour confirmer la réussite de l’accouplement. Après avoir effectué un test de Kaiser pour confirmer le couplage réussi, déprotégez le groupe Fmoc de l’acide aminé en ajoutant 10 millilitres d’une solution à 20 % de 4-méthylpyridine dans du DMF. Une fois la réaction terminée, effectuez un test de kaiser pour confirmer la déprotection réussie de l’acide aminé.

Ensuite, lavez la résine deux fois avec 10 millilitres de DMF chaque lavage durant 5 minutes, et enfin avec 10 millilitres de DCM pendant 10 minutes. Après avoir coulé tous les acides aminés requis, conjuguez la queue hydrophobe au dernier acide aminé en ajoutant 10 équivalents de la fonctionnalité souhaitée de l’acide carboxylique à 9,5 équivalents de HBTU et 12 équivalents de DIPEA. Sonicez le cocktail jusqu’à dissolution complète, puis ajoutez-le dans le récipient.

Effectuez la réaction pendant au moins cinq heures, bien qu’il soit conseillé de l’effectuer toute la nuit pour obtenir le rendement le plus élevé. Lavez la résine avec huit millilitres de DMF pendant deux minutes, et deux fois avec huit millilitres de DCM pendant cinq minutes. Avant chaque ajout, vidangez le solvant du récipient.

Une fois le dernier lavage effectué, séchez la résine sous vide pendant 15 minutes. Pour préparer 15 millilitres de cocktail de clivage, ajoutez 14 millilitres de TFA à 0,5 millilitre d’eau et 0,5 millilitre de triisopropylsilane. Ajoutez ce cocktail de décolleté à la résine et secouez pendant deux à quatre heures à température ambiante.

Une fois la réaction de clivage terminée, recueillir la solution dans une fiole à fond rond de 50 millilitres. Ensuite, concentrez le TFA sous vide à un à deux millilitres à l’aide d’un évaporateur rotatif à pression réduite, tout en chauffant le mélange à 40 degrés Celsius Après évaporation, ajoutez la solution TFA obtenue, goutte à goutte, dans un ballon à fond rond contenant 15 millilitres d’éther froid anhydre pour précipiter le PPA. Ensuite, ajoutez 5 millilitres d’éther froid anhydre dans le ballon d’origine contenant la solution concentrée de TFA.

Sonicate pour récupérer des solides supplémentaires. Ensuite, combinez avec la solution d’éther de l’étape précédente. Couvrez le flacon et placez-le à l’intérieur du réfrigérateur pendant la nuit pour maximiser les précipitations.

Le lendemain, collectez le matériau précipité par filtration sous vide à l’aide d’un entonnoir de filtre à disque central de taille fine ou moyenne. Enfin, lavez le précipité deux fois avec cinq à dix millilitres d’éther froid pour éliminer tous les résidus organiques. Le tracé HPLC et le spectre MALDI confirment la présence du produit PPA qui doit avoir une pureté supérieure à 95 % pour la caractérisation du matériau ou l’évaluation biologique.

Un seul pic net est observé dans la trace HPLC à base d’UV et le spectre MALDI correspond à celui de la masse moléculaire calculée du PPA à plus ou moins un dalton près. L’auto-assemblage des PPA peut être visualisé et analysé par microscopie électronique en transmission, microscopie à force atomique, diffusion des rayons X aux petits angles, microscopie électronique à balayage et diffusion dynamique de la lumière. Un auto-assemblage réussi aboutira à des nanostructures bien définies, à la fois en microscopie électronique à transmission et en microscopie à force atomique.

Une fois maîtrisé, ce protocole peut être réalisé en trois jours s’il est exécuté correctement. Lorsque vous essayez cette procédure, n’oubliez pas de purifier les produits et d’évaluer leur pureté avant toute étude ultérieure. À la suite de cette procédure, d’autres molécules, telles que des amphiphiles peptidiques, des peptides et des hybrides peptide-polyamine, peuvent être préparées.

Après son développement, cette technique aide la recherche dans le domaine des amphiphiles peptidiques auto-assemblés pour explorer l’influence des nanostructures de polyamines dans des domaines tels que l’administration de médicaments, l’imagerie ou la catalyse Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser la synthèse des amphiphiles peptidiques à base de polyamines et des amphiphiles peptidiques apparentés. L’acide trifluoroacétique et la 4-méthylpyridine peuvent être dangereux, et des précautions telles que le port de gants, de blouses de laboratoire et le travail dans la hotte doivent être prises lors de l’exécution de cette procédure.