Name: Synthèse et caractérisation de 1, 2-Dithiolane modifiée Peptides auto-assemblage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Apprenez la synthèse de peptides modifiés par 1,2-dithiolane et la caractérisation des structures supramoléculaires auto-assemblées. Cette méthode efficace utilise un couplage sur résine avec une seule étape de purification.

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Les auteurs tiennent à remercier Dr B. Ellen Scanley pour sa formation technique et aider grâce à la TEM au Connecticut State Colleges and University (CSCU) Center for Nanotechnology et Dr Ishita Mukerji à la Wesleyan University pour son CD spectrophotomètre. Le travail a été en partie pris en charge par l’Institut des sciences à l’Université de Fairfield, la NASA Connecticut Space Grant Consortium et par la National Science Foundation sous Grant nombre CHE-1624774.

1. synthèse et Purification de 1, 2-Dithiolane modifiés Peptide
<ol><li>Synthèse d’un précurseur dithiolane, 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) acide propanoïque19.
	<ol>
<li>Ajouter 1 g 3-bromo - 2-(bromométhyl) l’acide propionique (1 équiv.) dissous dans une quantité minimale de 1 NaOH M (environ 4 mL) pour un ballon à fond rond 25 mL réaction en agitant à 55 ° C. Sceller le ballon à réaction avec un septum et placer sous atmosphère d’azote.</li>
		<li>Préparer une solution contenant 1,49 g de potassium thioacétate (3.2 équiv.) dans 4 mL d’eau désionisée et 3 mL d’acide sulfurique 2 M (H2SO4) pour créer thioacétique acid in situ.</li>
		<li>Tirez la solution acide thioacétique dans une seringue en plastique jetable 10 mL et placer une aiguille sur la seringue. Ajouter le mélange goutte à goutte le ballon à réaction en perçant à travers le septum avec l’aiguille. Continuer la réaction du jour au lendemain à 55 ° C.</li>
		<li>Surveiller la réaction par chromatographie sur couche mince (TLC) sur gel de silice 60 F254 plaques à l’aide d’un mélange de méthanol et de dichlorométhane (1:9). Visualiser la progression de la réaction de tache de vert de bromocrésol. Le produit a un Rf = 0,57.</li>
		<li>Après la réaction est complète et refroidi à la température ambiante, acidifier le mélange à pH 1 avec 2 M H2SO4. Une huile jaune sépare hors de la solution.</li>
		<li>Extrait le produit avec du chloroforme froid (40 mL x 3). Combiner les couches organiques et sécher sur sulfate de magnésium. Retirez le chloroforme sous pression réduite.</li>
		<li>Confirmer l’identité du produit isolé, 1, par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), comme illustré dans les Figures 1 b et C. Attendons les résultats suivants : 1H RMN, CDCl3, 300 MHz : d = 10,1 (b, 1 H), 3.2 (m, 4 H), 2,9 (m, 1 H) 2.4 (s, 6 H) ; 13 RMN du 13C, CDCl3, 75 MHz : d = 195.1 (CH3COS-), 177,6 (-OOHC), 45,1 (-CH2S), 30.5(Caba), 29.2 (-SCOCH3). Remarque : Le produit est une huile jaune et a un rendement global de 83 %. Utiliser le produit sans davantage de purification.</li>
	</ol></li>
	<li>RCR et le couplage sur la résine de Dithiolane précurseur Note : La synthèse de peptide de phase solide décrite ci-dessous a été effectuée sur un synthétiseur de peptide automatisé, suivant les protocoles du fabricant recommandée. Réactifs et des paramètres peuvent être adaptés pour d’autres instruments commerciaux ou lors de l’utilisation spécialisée des acides aminés.<ol>
<li>Peser de 0,156 g de résine de 4-methylbenzhydrylamine (MBHA) patinoire amide (0,1 mmol) et les placer dans un réacteur. Gonfler la résine dans le diméthylformamide (DMF) pendant au moins 15 minutes avant le début de la synthèse.</li>
		<li>Peser 4 équivalents de chaque fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) protégé des acides aminés (0,4 mmol) dans la séquence et 0,152 g de N, N, N', N'- tétraméthyl-O-(1H- benotriazol-1-yl) uranium hexafluorophosphate (0,4 mmol, HBTU) pour chaque acide aminé dans la séquence. Chaque cartouche contient le Fmoc-protégé des acides aminés et HBTU.</li>
		<li>Après l’exécution de synthèse avant tous les contrôles sur le synthétiseur (remplir les réactifs, vidées lignes réactif et pressurisé tous les flacons de réactifs), placer les cartouches acides aminés dans le carrousel au C' n ' direction terminus. Placez une cartouche vide après la position finale en acide aminé pour la dernière étape de déprotection Fmoc N-terminale.</li>
		<li>Synthétiser le peptide avec les paramètres recommandés standards.<ol>
<li>Déprotéger le groupe Fmoc de la résine avec 5 mL de pipéridine de 20 % dans le DMF (5 min x 2).</li>
			<li>Laver la résine avec DMF (6 x 5 mL) avant l’étape de l’accouplement.</li>
			<li>Pour une couplage unique étape, ajouter 4 mL de 0,4 M N-méthylmorpholine dans le DMF à l’aminoacide Fmoc-protégés et HBTU. Activer la solution Fmoc-protégé des acides aminés pendant 30 s avant de les transvaser la solution dans la cuve de réaction. Remarque : Le synthétiseur de peptide automatisé mêle la résine et la solution de propagation N2 gaz toutes les 30 s pendant 20 min alors que la réaction de couplage a lieu. Pour la synthèse peptidique manuelle, placer la cuve de réaction dans un agitateur orbital à basse vitesse pendant la durée de l’étape de l’accouplement.</li>
			<li>Egoutter la solution et laver la résine avec DMF (3 x 5 mL).</li>
			<li>Répétez les étapes 1.2.4.1 par 1.2.4.4 pour chaque acide aminé Fmoc-protégé dans la C' n '-direction terminus pour synthétiser le peptide d’intérêt.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Après l’étape finale de déprotection N-terminale, transférer la résine dans une seringue jetable frittée. Laver la résine avec DMF (3 x 5 mL) et le dichlorométhane (DCM, 3 x 5 mL). Remarque : La résine peut-être être conservée après lavage dans un dessiccateur à vide de DCM. Si la résine a été stockée avant l’accouplement, vérifier que vous pour gonfler la résine dans le DMF avant la réaction de couplage.</li>
		<li>Coupler le précurseur dithiolane (1) sur N-terminal du peptide sur la résine en ajoutant 4 équivalents de 1, 5 mL de DMF, 4 équivalents de HBTU et 10 équivalents de N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA). Préactiver le mélange de couplage pendant 10 min avant d’ajouter à la résine contenant une seringue frittée.</li>
		<li>Secouez la réaction de couplage pendant 2 h. Après 2 h, laver la résine avec DMF (3 x 5 mL) et répéter la réaction de couplage avec agitation du jour au lendemain.</li>
		<li>Après le deuxième couplage, laver la résine avec DMF (3 x 5 mL) et de DCM (3 x 5 mL). Remarque : La résine peut être stockée à ce point sous vide jusqu’au décolleté.</li>
	</ol></li>
	<li>La déprotection de thioacétate et de clivage du Peptide de résine
	<ol>
<li>Pour déprotéger le groupe thioacétate partir du précurseur de dithiolane aminée, transférer la résine séchée dans un tube de réaction de micro-ondes de 10 mL et ajouter 2 mL de DMF. Laisser l’échangeur gonfler, ajouter un petit magnétique au navire et remettre en suspension avec une faible vitesse de l’agitateur magnétique pendant 15 min.</li>
		<li>Ajouter 2 mL de concentré hydroxyde d’ammonium, cap de la cuve de réaction avec les septa silicone et placez la cuve dans un réacteur de micro-ondes en utilisant les paramètres de micro-ondes de 75 ° C pendant 45 min en remuant.</li>
		<li>Après que la réaction de micro-ondes est terminée, transférer la résine dans une seringue jetable propre frittée. Laver avec DMF (2 x 5 mL) et de méthanol (MeOH, 2 x 5 mL).</li>
		<li>Ajouter une solution concentrée d’hydroxyde d’ammonium dans le méthanol (1:4), pour un volume total de 5 mL. Autorisation d’agiter pendant la nuit pour augmenter l’oxydation intramoléculaire du pont disulfure dans dithiolane ring.</li>
		<li>Laver la résine avec MeOH (2 x 5 mL) et de DCM (3 x 5 mL). Remarque : La résine séchée peut-être être stockée à ce stade dans un dessiccateur à vide.</li>
		<li>Ajouter le cocktail de clivage de la résine contenant la seringue en agitant doucement pendant 1,5 h. Le clivage cocktail utilisé est l’acide trifluoroacétique (TFA) de 95 %, 2,5 % triisopropylsilane (conseils) et 2,5 % d’eau à un volume total de 5 mL. ATTENTION : Travailler sous hotte chimique seulement. TFA est volatil et corrosif. Remarque : Pour la majorité des séquences de peptides et acides aminés sidechain groupes protecteurs, la solution de cocktail de clivage ci-dessus est suffisante ; Toutefois, des cocktails de clivage alternatif peuvent être nécessaire pour certaine acides aminés de la chaîne de la côté protection de groupes (en particuliers peptides contenant Cys, Met, Trp et Arg) ou autre résine chimie20.</li>
		<li>Précipiter le peptide brut dans 25 mL d’éther froid dans un tube conique de 50 mL par addition de goutte à goutte de la seringue frittée. Le peptide précipite sous forme de solide blanc. Granule le peptide par centrifugation à 1300 x g pendant 10 min. décanter soigneusement l’éther dans un récipient séparé pour la collecte des déchets.</li>
		<li>Ajouter un autre 25 mL d’éther diéthylique dans le tube conique et remettre en suspension le précipité au vortex. Répétez la centrifugation à 1300 x g pendant 10 min et éliminer l’éther diéthylique à nouveau. Sécher le culot sous vide.</li>
	</ol></li>
	<li>Purification de 1, 2-Dithiolane modifiée Peptide Remarque : Purifier le peptide brut par HPLC en phase inverse. Recueillir et combiner les pics de peptide et confirmer la masse par spectrométrie de masse MALDI-TOF.<ol>
<li>Dissoudre le culot de peptide brut dans une quantité minimale d’acétonitrile avec 0,1 % TFA. En raison d’hydrophobicité de peptide et la propension de l’agrégation, doucement chauffer l’échantillon à 40 ° C à l’aide de solubilité. Remarque : Éviter les plus élevés de températures et de sonication du peptide afin d’éviter les éventuels disulfure échange réactions21,22,23.</li>
		<li>Pour préparer 1 mL de peptide brut purification HPLC, ajouter 400 μL de stock de peptide concentré dans l’acétonitrile à 600 μL de H2O avec 0,1 % TFA et filtrer à travers un filtre de seringue 22 μm dans un flacon HPLC. L’isopropanol 5 % supplémentaires peut être ajouté pour empêcher la précipitation et l’agrégation du peptide.</li>
		<li>Purifier le peptide en utilisant la colonne semi-préparative C-18 avec un débit de 3 mL/min par rapport à un gradient linéaire de 15-55 % d’acétonitrile dans 20 min. jeu de détecteurs UV à 222 nm (dorsale de l’amide) et 330 nm (pont disulfure). Rassembler et combiner les pics d’intérêt (Figure 2 a).</li>
		<li>Confirmer la masse de produit de peptide par spectromètre de masse MALDI-TOF en mode réflectron (Figure 2 b). Pour l’analyse, mélangez 0,5 μL de peak recueillie sur la plaque MALDI avec 0,5 μL de matrice (DHB) l’acide 2, 5-dihydroxybenzoïque (10 mg/mL DHB dans 50 % d’acétonitrile, 0,1 % TFA). Remarque : Communs adduits de MALDI-TOF spectrométrie de masse incluent le sodium et sel de potassium d’adduits ([M + Na]+ et [M + K]+) pics. Dessalage de l’échantillon avant l’analyse est recommandé si les sommets de l’adduit sel suppriment le signal du pic principal [M + H]+ . En outre, un pic oxydé de [M + O]+ est également détecté dans le peptide de 1, 2-dithiolane modifiée. Un rapport sur laser induite par oxydation de l’ionisation de MALDI à l’aide de la matrice DHB suggère que les facteurs dont la concentration de l’échantillon, solvant et intensité du laser peuvent être modifiées pour limiter la MALDI induite par oxydation artefact24.</li>
		<li>Après confirmation de MALDI-TOF de la masse correcte, lyophiliser le peptide après congélation flash. Conserver la poudre lyophilisée peptide sous vide jusqu'à l’Assemblée.</li>
	</ol></li>
</ol>2. caractérisation des supramoléculaire auto-assemblage Structures
<ol><li>
Formation de fibres amyloïdes
	<ol>
<li>Pour préparer l’auto-assemblage solution, peser 1 mg de la poudre de peptide à l’aide d’une balance analytique. Dissoudre dans un mélange (pH 7.5) de 20 % d’acétonitrile et de 10 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide (HEPES) dans un tube de microtubes de 1,5 mL, à une concentration finale de 1 mg/mL peptide Assemblée du mélange. Vortex solution d’assemblage et laisser monter à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caractérisation spectroscopique des fibres amyloïdes
	<ol>
<li>Suivez le processus d’assemblage de peptide par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) tous les jours. Un pic large centré autour de 1670 cm-1 est la signature IR dus aux peptides non assemblés dans l' exemple17. Les échantillons de l’Assemblée de peptide prennent généralement une à deux semaines pour le pic large démontée à disparaître et arriver à maturation.<ol>
<li>Sécher une partie aliquote de 8-10 μL de la solution de montage comme une fine pellicule sur le cristal de diamant de RTA. Surveiller la disparition d’un pic d’eau grandes et larges de 1640 à 1630 cm-1 que les formes du feuil sec.</li>
			<li>Acquisition de spectres IR de 1500-1800 cm-1 avec une moyenne de 50 scanne avec une résolution de-1 cm 2. Acquérir et soustraire les scans de fond avant chaque analyse d’échantillon. La signature IR pour l’assemblage de feuillet β est un pic entre 1625 et 1635 cm-1 (Figure 3 a)25,26.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Caractériser l’ensemble de peptide dans des structures supramoléculaires riches feuillet β par dichroïsme circulaire (CD). Enregistrer les spectres à l’aide d’un spectropolarimètre CD avec un système de contrôle de température Peltier.<ol>
<li>Distribuer 30 μL de la solution d’assemblage dans une cuvette de longueur de chemin d’accès de 0,1 mm. Remarque : Un porte-cuve est nécessaire pour le fixer et positionner la cellule de longueur de chemin d’accès court dans l’instrument.</li>
			<li>Pour chaque gamme, définissez l’instrument CD aux paramètres suivants : analyse des longueurs d’onde de 300 nm à 180 nm, taux d’echantillonage de 100/min, largeur de bande de 1 nm, 25 ° C, en moyenne trois balayages.</li>
			<li>Recueillir un éventail de la mémoire tampon (20 % d’acétonitrile/10 mM, HEPES, pH 7,5) et soustraire de chaque analyse de l’échantillon sous forme de contrôle. La signature de CD pour les β-feuilles est qu'une ellipticité minimale centrée autour de 220 nm (Figure 3 b)27.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopie de fibres amyloïdes
	<ol>
<li>Laisser deux à trois semaines pour les échantillons de peptide à mûrir dans des structures supramoléculaires riches feuillet β. Remarque : Les assemblys peuvent être photographiées en utilisant la microscopie électronique à transmission (TEM) aux premiers stades de la procédure de l’Assemblée ainsi.<ol>
<li>Pipeter 10 μL de la solution d’assemblage de peptide à la surface de la grille de carbone TEM. Remarque : prenez soin de ne pas pour toucher le bout de la pipette à la surface de la grille. Haute précision, à fermeture automatique pinces servent à retenir la grille TEM pendant la préparation.</li>
			<li>Attendre 1-2 min pour permettre les assemblées s’adsorber sur la surface de la grille. Retirer les excès d’échantillon en touchant le papier filtre au bord de la grille.</li>
			<li>Préparer une tache 2 % de l’acétate d’uranyle en ajoutant 100 μL d’eau déionisée à la solution d’acétate d’uranyle 4 % disponibles dans le commerce. Distribuer 10 μL de la tache de l’acétate d’uranyle de 2 % sur la surface de la grille et incuber pendant 2-3 min. Après l’incubation, enlever tache excès en touchant le papier filtre au bord de la grille.</li>
			<li>Placer les grilles TEM dans un dessiccateur à vide pendant la nuit. Conserver sous vide jusqu'à l’imagerie.</li>
			<li>Les échantillons préparés avec TEM (Figure 3) de l’image. Voici les paramètres typiques pour la microscopie : images à grossissements allant de 9 300 X 23, 000 X, filament de tungstène avec une tension d’accélération de 120 kV. Remarque : ImageJ peut être utilisé pour mesurer la largeur de la fibre moyenne des structures supramoléculaires d’acquis TEM images28. ATTENTION : Veuillez consulter toutes les fiches de données de sécurité (SDS) avant utilisation. Plusieurs produits chimiques utilisés dans la synthèse, la purification, et la caractérisation des peptides auto-assemblage décrit 1, 2-dithiolane modifiée corrosifs ou toxiques et ne doit être utilisé sous une hotte chimique. Utilisez toujours l’équipement de protection individuelle approprié (y compris les lunettes de sécurité, blouse de laboratoire, pleine longueur pantalon, chaussures fermées) lorsque vous travaillez dans le laboratoire.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cet article explique les détails de la synthèse et la purification d’un peptide auto-assemblage de N-terminal 1, 2-dithiolane modifiée et la caractérisation des structures supramoléculaires qui en résulte. La synthèse du peptide 1, 2-dithiolane rapporté ici a des avantages, y compris une synthèse en une étape pour produire le précurseur dithiolane, 3-(acetylthio) -2-acide propanoïque (acetylthiomethyl) et la résine sur micro-ondes réaction de déprotection de la précurseur thioacétate de groupe pour obtenir la fraction ox...

La liaison peptidique robuste formant chimie impliquée dans la synthèse de peptide de phase solide et la possibilité de contrôler la composition et la durée d’une séquence font les peptides qui s’auto-assembler en structures supramoléculaires un champ largement documenté. Les facteurs qui contrôlent et stabilisent les structures auto-assemblées peptide, y compris la chaîne latérale stérique et interactions électrostatiques, des liaisons hydrogènes et effets hydrophobes1, constituent un ensemble de règles de conception. Comme des recherches menées sur ces règles de conception fondamentale continuent de progresser, l’étape logique suivante en peptide auto-assemblage consiste à élargir la diversité des fonctions et des structures à base de peptides. Lors de l’assemblage des peptides sont un biomatériau polyvalent qui ont été utilisés pour de nombreuses applications biomédicales en syntonisant le peptide séquence ou montage conditions2,3,4, l’élaboration de stratégies pour modifications après montage peptide nanofibres5,6,7,8,9 reste un domaine relativement inexploré.
Disulfure dynamique échange thiol chimie et à la surface des structures supramoléculaires est un secteur qui a le potentiel d’engendrer des biomatériaux nouveaux et fonctionnels. L’incorporation des portions de 1, 2-dithiolane (généralement un dérivé de l’acide lipoïque (la) ou l’acide asparagusique (aa)) ont été signalés dans un liposome systèmes10,11, copolymères de bloc12,13et en tant que ancres à surfaces14,15de l’organisation. Ici, nous rapportons la synthèse et la caractérisation d’un auto-assemblage peptide dérivé de la nucléation core du peptide Aβ associée à la maladie d’Alzheimer qui est modifiée à l’extrémité N-terminale avec un 1, 2-dithiolane groupe fonctionnel16, 17. Les fibres qui en résulte supramoléculaires servent désormais une plateforme expérimentale pour étudier la réactivité disulfure intracirconscriptions et thiols en surface des fibres amyloïdes18supramoléculaire.

<table><tbody><tr><td>Rink amide Résine MBHA, charge élevée</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>RAM-5-HL</td><td>Éviter le contact avec la peau et les yeux ; ne pas inhaler</td></tr> le <tr><td>N,N-Diméthylformamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119-4</td><td>Liquide et vapeur inflammables ; irritant pour les yeux et la peau ; Utiliser de l’équipement de protection individuelle ; tenir à l’écart des flammes nues</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-V</td><td>Porter un équipement de protection individuelle ; ne pas inhaler</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-L</td><td>Porter un équipement de protection individuelle ; ne pas inhaler</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-KBC</td><td>Porter un équipement de protection individuelle ; ne pas inhaler</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-F</td><td>Porter un équipement de protection individuelle ; ne pas inhaler</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-A</td><td>Porter un équipement de protection individuelle ; ne pas inhaler</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-QT</td><td>Porter un équipement de protection individuelle ; ne pas inhaler</td></tr><tr><td>N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tétraméthyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)hexafluorophosphate d’uronium</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>26432</td><td>Provoque une irritation de la peau, des yeux et des voies respiratoires ; ne pas inhaler ; utiliser sous la cagoule ou dans un endroit bien ventilé</td></tr><tr><td>0,4 M N-méthylmorpholine dans</td><td>DMF Gyros Protein Technologies</td><td>PS3-MM-L</td><td>hautement inflammable ; porter un équipement de protection individuelle ; tenir à l’abri de la chaleur et garder le récipient bien fermé ; ne pas inhaler ni avaler ; laver soigneusement la peau après avoir manipulé</td></tr><tr><td>de la pipéridine à 20 % dans DMF</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>PS3-PPR-L</td><td>Provoque de graves brûlures des yeux et de la peau ; Liquide et vapeur inflammables ; Ne pas inhaler le</td></tr><tr><td>dichlorométhane</td><td>Fisher Scientific</td><td>D37-4</td><td>Peut causer le cancer ; Ne pas inhaler ; Porter un équipement de protection individuelle ; à utiliser uniquement sous le capot ; en cas de contact, augmenter avec de l’eau pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux</td></tr><tr><td>acétonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td>Inflammable ; irritant pour les yeux ; Utiliser de l’équipement de protection individuelle ; Utiliser uniquement sous une hotte ; tenir à l’écart des flammes nues ou des surfaces chaudes ; en cas de contact, rincer à l’eau pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux</td></tr><tr>acide<td>trifluoroacétique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A116-50</td><td>Provoque de graves brûlures ; ne pas inhaler ; nocif pour la vie aquatique ; utiliser un équipement de protection individuelle ; utiliser uniquement sous une hotte ; en cas de contact, rincer à l’eau pendant au moins 15 minutes et obain soins médicaux immédiats</td></tr><tr><td>acétate d’uranyle à 4</td> % <td>Microscopie électronique Sciences</td><td>22400-4</td><td>Ne pas inhaler ; nocif pour la vie aquatique</td></tr><tr><td>Acide 4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique</td><td>Acros Organics</td><td>AC172571000</td><td>Ne pas inhaler ; utiliser à l’extérieur ou dans un endroit bien ventilé</td></tr><tr><td>azote Gaz</td><td>TechAir</td><td></td><td>Le contenu sous pression, peut exploser s’il est chauffé</td></tr><tr><td>Acide 3-bromo-2-(bromométhyl)propionique</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA1963014</td><td>Ne pas inhaler ; provoque une irritation de la peau et des yeux ; corrosif</td></tr><tr><td>hydroxyde de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td>Utiliser un équipement de protection individuelle ; utiliser uniquement sous une hotte ; en cas de contact, rincer la zone pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux</td></tr><tr><td>thioacétate</td><td>de potassium Acros Organics</td><td>AC221300250</td><td>Provoque une irritation de la peau et des yeux ; ne pas inhaler ; utiliser un équipement de protection individuelle</td></tr><tr><td>acide sulfurique</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA213</td><td>Provoque des brûlures ; tenir à l’écart de l’eau ; tenir à l’écart des matériaux combustibles ; ne pas inhaler ; utiliser de l’équipement de protection individuelle ; en cas de contact, rincer la zone pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux</td></tr><tr><td>chloroform-d</td><td>Acros Organics</td><td>AC320690075</td><td>Risque possible de cancer ; irritant pour la peau et les yeux ; ne pas inhaler ; Utiliser de l’équipement de protection individuelle ; Utiliser uniquement sous la hotte ; En cas de contact, rincer la zone pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux</td></tr><tr><td>chloroforme</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-4</td><td>Risque possible de cancer ; irritant pour la peau et les yeux ; ne pas inhaler ; Utiliser de l’équipement de protection individuelle ; Utiliser uniquement sous la hotte ; En cas de contact, rincer la zone pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux</td></tr><tr><td>N,N-diisopropyléthylamine</td><td>Acros Organics</td><td>AC367841000</td><td>Hautement inflammable ; nocif pour la vie aquatique ; porter un équipement de protection individuelle ; ne pas avaler</td></tr><tr><td>d’hydroxyde d’ammonium</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>Corrosif ; ne pas inhaler</td></tr><tr>de<td>méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>Liquide et vapeur inflammables ; utiliser de l’équipement de protection individuelle ; ne pas inhaler ; En cas de contact, rincer la zone pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux</td></tr>, <tr><td>triisopropylsilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781</td><td>Inflammable ; utiliser un équipement de protection personnel ; garder le récipient bien fermé</td></tr> Fisher <tr><td></td><td>Scientific</td><td>E138-1</td><td>Extrêmement inflammable ; Irritant pour la peau et les yeux ; Utiliser un équipement de protection individuelle</td></tr><tr><td>Acide 2,5-dihydroxybenzoïque</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39319-10x10MG-F</td><td>ne pas inhaler ; irritant pour la peau et les yeux</td></tr><tr><td>Acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ67635EXK</td><td></td></tr><tr><td>c18 Zip-tip</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>tris(2-carboxyéthyl) chlorhydrate de phospine</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI20490</td><td></td></tr><tr><td>gel de silice 60 F254 feuilles TLC revêtues d’aluminium</td><td>EMD Millipore</td><td>1.05549.0001</td><td></td></tr><tr><td>Tubes RMN de précision à paroi mince</td><td>Bel-Art</td><td>663000585</td><td>5mm OD</td></tr><tr><td>Seringues Norm-Ject entièrement en plastique</td> Aiguille à usage unique <td>Air Tite</td><td>AL10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD PrecisionGlide</td><td>BD 305185</td><td>aiguilles usagées sont jetées dans un conteneur à déchets tranchants</td></tr><tr><td>Seringue frittée jetable Seringue frittée</td><td>Torviq</td><td>SF1000LL</td><td>10 ml ont été utilisées dans le rapport, mais des seringues plus grandes sont disponibles si nécessaire pour une synthèse à plus grande échelle.</td></tr><tr><td>grille de carbone</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>CF200-CU</td><td>Assurez-vous de préparer les échantillons et la coloration du côté de la grille de carbone, et non du côté cuivre brillant de la pince</td></tr> à <tr><td>épiler à fermeture automatique</td> de la grille <td>Microscopie électronique Sciences</td><td>78318-3X</td><td>pointes très pointues, longueur : 120 mm</td></tr><tr><td>0,1 mm Cellule de longueur de trajet court</td><td>Starna Cells, Inc.</td><td>20/C-Q-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Fragile 10mL Vessel Caps</td><td>CEM</td><td>909210</td><td></td></tr><tr><td>10mL Pressure Vessels</td><td>CEM</td><td>908035</td><td></td></tr><tr><td>Aeris Semi-Prep HPLC</td><td>column Phenomenex</td><td>00F-4632-N0</td><td>150 x 10mm</td></tr><tr><td>support de cellules</td><td>Starna Cells, Inc.</td><td>CH-2049</td><td>Nécessaire lors de l’utilisation de cellules à court trajet</td></tr><tr><td>Synthétiseur de peptides PS3</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiscoverSP Réacteur à micro-ondes</td><td>Centrifugeuse CEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>HERMLE</td><td>Z 206 A</td><td>utilisé un rotor fixe de 6x50 mL</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Détecteur UV Shimadzu</td><td></td><td>Spectromètre à</td></tr><tr><td>résonance magnétique nucléaire</td><td>Avance, Bruker</td><td></td><td>Spectromètre</td></tr><tr><td>de masse MALDI-TOF</td> 300 MHz <td>Axima Confidence,</td> lyophilisateur Shimadzu<td></td><td></td>,</tr><tr><td></td><td>technologie Millrock</td>, <td>BT85A</td><td></td></tr><tr>,<td>spectromètre infrarouge à transformée de Fourier,</td><td>tenseur Alpha, Bruker</td><td></td><td></td>,</tr><tr><td>microscope électronique à transmission</td><td>, Tecnai Spirit, FEI</td><td></td>, <td>utilisé avec la caméra numérique CCD à fibre optique Gatan Orius. Accessible au CSCU Center for Nanotechnology</td></tr><tr><td>Circular Dichroism Spectropolarimeter</td><td>J-810, JASCO</td><td></td><td>Utilisé avec un contrôleur de température Peltier à six cellules. Consulté à l’Université Wesleyan.</td></tr></tbody></table>

synthèse et caractérisation de 1, 2-dithiolane modifiée peptides auto-assemblage

Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides

Ce rapport met l’accent sur la synthèse d’un N-terminal 1, 2-dithiolane modifiée auto-assemblage de peptide et la caractérisation du résultant self-assembled structures supramoléculaires. La voie de synthèse profite de la synthèse de peptide de phase solide avec l’accouplement sur résine de la molécule précurseur dithiolane, 3-(acetylthio) -2-acide propanoïque (acetylthiomethyl) et le thioacétate assistée par micro-ondes deprotection du peptide N-terminale avant dernier clivage de la résine pour donner le 1, 2-dithiolane modifiée peptide. Après la purification de la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) du peptide 1, 2-dithiolane, dérivé de la nucléation core du peptide Aβ associée à la maladie d’Alzheimer, le peptide est avéré s’auto-assembler en fibres amyloïdes Croix-β. Protocoles pour caractériser les fibres amyloïdes par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR), spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) et microscopie électronique à transmission (TEM) sont présentés. Les méthodes de modification de la N-terminale avec une portion de 1, 2-dithiolane aux peptides auto-assemblage bien caractérisés peuvent maintenant être explorées comme systèmes modèles pour élaborer des stratégies de modification après montage et Explorer chimie covalente dynamique sur surfaces de peptide supramoléculaire de nanofibres.

En dehors de la synthèse en une étape initiale de la molécule précurseur de dithiolane, le reste de la synthèse de peptide de 1, 2-dithiolane modifiée se produit sur un support solide (Figure 1 a). La conversion de 3-bromo - 2-(bromométhyl) propionique acide 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl), acide propanoïque, le précurseur de dithiolane, est confirmée par 1H et de 13C RMN (Figure 1 b et C</stron...

Un protocole pour la synthèse d’un 1, 2-dithiolane modifiée peptide et la caractérisation des structures supramoléculaires résultant de la peptide auto-assemblage.

Synthèse et caractérisation de 1, 2-Dithiolane modifiée Peptides auto-assemblage

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting ...

Au fur et à mesure que les structures permettant d’augmenter la fonctionnalité des structures supermoléculaires se développent, cette méthode d’incorporation de groupes 1,2-dithiolane avec des peptides auto-assemblés peut aider à répondre à des questions clés sur la réactivité sur les surfaces supermoléculaires. Le principal avantage de cette technique est que le couplage et la déprotection de la molécule précurseur du 1,2-dithiolane se produisent sur la résine avec une seule étape de purification du peptide final modifié. Comme le temps nécessaire aux assemblages pour aboutir à leurs structures supermoléculaires finales varie, la démonstration visuelle des méthodes de caractérisation et des résultats des assemblages supermoléculaires est essentielle.Pour synthétiser le précurseur du dithiolane, il faut d’abord dissoudre un gramme d’acide 3-bromo-2-proprionique dans environ quatre millilitres d’hydroxyde de sodium à une molaire dans un ballon réactionnel à fond rond de 50 millilitres à 55 degrés Celsius en agitant. Lorsque tout le réactif a été mis en suspension dans la solution, scellez le ballon de réaction avec un septa et placez le ballon sous une atmosphère d’azote. Ensuite, ajoutez 1,49 gramme de thioacétate de potassium et trois millilitres d’acide sulfurique à deux molaires à quatre millilitres d’eau déminéralisée pour créer de l’acide thioacétique in situ.Aspirez la solution d’acide thioacétique dans une seringue en plastique jetable de 10 millilitres et équipez la seringue d’une aiguille de calibre 18, puis percez les septa avec l’aiguille pour ajouter le mélange goutte à goutte dans le ballon de réaction et poursuivez la réaction toute la nuit à 55 degrés Celsius. Le lendemain matin, surveiller la réaction par chromatographie sur couche mince sur des plaques de gel de silice 60 F254 à l’aide d’un mélange de méthanol et de dichlorométhane et visualiser la progression de la réaction par coloration au vert de bromocrésol. Lorsque la réaction terminée s’est refroidie à température ambiante, acidifiez le mélange avec de l’acide sulfurique à deux molaires à un pH de un.Une huile jaune doit se séparer de la solution, puis extraire le produit avec trois ajouts de 40 millilitres de chloroforme froid et combiner les couches organiques pour le séchage sur du sulfate de magnésium, en éliminant le chloroforme sous pression réduite. Le produit doit être une huile jaune avec un rendement global de 83 % et peut être utilisé sans autre purification. Pour coupler le précurseur du dithiolane à l’extrémité N-terminale du peptide sur résine, ajoutez quatre équivalents du précurseur du dithiolane à cinq millilitres de diméthylformamide, quatre équivalents de HBTU et 10 équivalents de DIPEA.Laissez le mélange de couplage se préactiver pendant 10 minutes à température ambiante avant d’ajouter l’échantillon à la seringue frittée contenant de la résine N-terminale. Agitez la réaction de couplage pendant deux heures, suivies de trois lavages de cinq millilitres dans du diméthylformamide frais et répétez la réaction de couplage et agitez toute la nuit. Après le deuxième couplage, lavez la résine avec trois lavages de diméthylformamide de cinq millilitres suivis de trois lavages de résine de dichlorométhane de cinq millilitres et transférez la résine séchée dans un tube de réaction à micro-ondes de 10 millilitres.Ensuite, pour déprotéger le groupe thioacétate du précurseur N-terminal dithiolane, ajoutez deux millilitres de diméthylformamide dans le tube. Laissez la résine gonfler, ajoutez une petite barre d’agitation magnétique dans le récipient et remettez la résine en suspension avec une agitation magnétique à basse vitesse. Après 15 minutes, ajoutez deux millilitres d’hydroxyde d’ammonium concentré dans le tube, bouchez le récipient de réaction avec un septa en silicone et placez le récipient dans un réacteur à micro-ondes pendant 45 minutes à 75 degrés Celsius en remuant.Lorsque la réaction par micro-ondes est terminée, transférez la résine dans une seringue frittée propre et jetable et lavez la résine avec deux lavages de diméthylformamide de cinq millilitres et deux lavages de méthanol de cinq millilitres. Après le dernier lavage, ajoutez cinq millilitres de cocktail de décolleté dans la seringue contenant de la résine pour une incubation de 1 heure et demie en secouant doucement à température ambiante. Pour préparer un millilitre de peptide brut pour la chromatographie liquide à haute performance ou la purification HPLC, ajoutez 400 microlitres de peptide concentré dans de l’acétonitrile à 600 microlitres d’eau complétée par 0,1 % d’acide trifluoroacétique et filtrez la solution à travers un filtre à seringue de 22 micromètres dans un flacon HPLC.Pour purifier le peptide, utilisez une colonne semi-préparative en C18 à un débit de trois millilitres par minute sur un gradient linéaire de 15 à 55 % d’acétonitrile en 20 minutes avec les détecteurs UV réglés sur 222 nanomètres et 330 nanomètres. Ensuite, collectez et combinez les sommets d’intérêt. Pour la confirmation du produit peptidique par désorption/ionisation laser assistée par matrice temps de vol ou spectrométrie de masse MALDI-TOF, mélanger 0,5 microlitre du pic collecté sur une plaque de désorption/ionisation laser assistée par matrice contenant 0,5 microlitre de matrice d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque.Pour préparer une solution d’auto-assemblage, dissolvez un milligramme de poudre de peptide lyophilisé dans un mélange de 20 % d’acétonitrile et de 10 millimolaires d’HEPES dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, puis agitez la solution d’assemblage et laissez l’échantillon s’assembler à température ambiante. Lorsque l’assemblage peptidique atteint sa maturité, séchez huit à 10 microlitres de la solution d’assemblage sous forme de film mince sur le cristal de diamant atténué à réflexion totale et surveillez la disparition d’un grand et large pic d’eau de 1640 à 1631 centimètres inverses au fur et à mesure que le film sec se forme. Acquérez des spectres d’arrière-plan et infrarouges de 1500 à 1800 centimètres inverses en moyenne sur 50 balayages avec une résolution de deux centimètres inverses, en soustrayant les balayages d’arrière-plan avant chaque balayage d’échantillon.La signature infrarouge pour l’assemblage de la feuille bêta doit être observée comme un pic net entre 1625 et 1635 centimètres inverses. Lorsque les échantillons de peptides ont mûri en structures supermoléculaires riches en feuillets bêta, chargez 10 microlitres de la solution d’assemblage de peptides sur la surface d’une grille de carbone de microscope électronique à transmission et laissez les assemblages s’adsorber sur la surface de la grille pendant une à deux minutes. Touchez le papier filtre sur le bord de la grille pour retirer l’échantillon en excès, et ajoutez 10 microlitres de colorant d’acétate d’uranyle à 2 % fraîchement préparé à la surface de la grille pour une incubation de deux à trois minutes, puis enlevez l’excès de teinture avec du papier filtre et placez la grille dans un dessiccateur sous vide pendant la nuit avant l’imagerie du lendemain par microscopie électronique à transmission.Mis à part la synthèse initiale en une étape de la molécule précurseur du dithiolane, le reste de la synthèse du peptide modifié au 1,2-dithiolane se produit sur un support solide. La conversion de l’acide 3-bromo-2-proprionique en acide 3-2-propanoïque, le précurseur du dithiolane, est confirmée par résonance magnétique nucléaire des protons et du carbone 13 avant qu’il ne soit couplé à l’amine N-terminale libre d’un peptide encore sur résine. Après déprotection, le peptide brut est purifié par HPLC en phase inverse et la masse du produit est confirmée par spectrométrie de masse MALDI-TOF.La spectroscopie de dichroïsme infrarouge et circulaire à transformée de Fourier peut être utilisée pour surveiller l’auto-assemblage du peptide 1,2-dithiolane purifié en fibres amyloïdes matures afin de caractériser leur conformation en feuillet bêta étendu. Les fibres peuvent ensuite être imagées par microscopie électronique à transmission. Bien que ces méthodes puissent être utilisées pour modifier l’extrémité N-terminale de n’importe quelle séquence peptidique encore sur de la résine, il est important de se rappeler que les conditions d’auto-assemblage du peptide doivent être optimisées pour chaque peptide.Ces techniques, qui permettent d’ajouter des groupes 1,2-dithiolane à des peptides auto-assemblés, permettront aux chercheurs dans le domaine des biomatériaux d’explorer la réactivité supermoléculaire de surface.

synthesis-characterization-12-dithiolane-modified-self-assembling

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Un simple et générale méthode manuelle synthèse peptoïde impliquant l'équipement de base et de réactifs disponibles dans le commerce est présenté, permettant peptoïdes pour être facilement synthétisée dans la plupart des laboratoires. La synthèse, la purification et la caractérisation d'une 36mer peptoïde amphiphile est décrite, ainsi que son auto-assemblage en très ordonnée nanofeuillets.

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Cette vidéo démontre l’auto-assemblage de peptides amyloïdes en une structure supramoléculaire riche en feuillets bêta à l’aide de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier. Un faisceau infrarouge traverse un cristal à indice de réfraction élevé, et l’absorption d’énergie à travers l’interface du cristal et de l’échantillon est enregistrée. Les structures secondaires des protéines de l’échantillon sont identifiées en analysant leurs pics d’absorption caractéristiques dans des régions...

Une technique de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier pour étudier l’auto-assemblage des peptides

Ce document décrit la formation de structures à base de peptides hautement ordonnés par le processus spontané d'auto-assemblage. Le procédé utilise des peptides disponibles dans le commerce et l'équipement de laboratoire commun. Cette technique peut être appliquée à une grande variété de peptides et peut conduire à la découverte de nouveaux assemblages à base de peptides.

Formation de structures ordonnées biomoléculaires par l&#39;auto-assemblage de peptides courts

Nous présentons un protocole pour la construction des thioéthers/vinyle sulfure-tethered hélicoïdales peptides utilisant photoinduit thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

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Ce protocole décrit une méthode efficace pour synthétiser une nanoémulsion d’un conjugué de la teneur en acide oléique acids-platinum(II) stabilisé avec un tripeptide lysine-tyrosine-phénylalanine (KYF). Les formes nanoémulsion dans des conditions douces synthétiques par auto-assemblage de la KYF et le conjugué.

Une Nanoémulsion Tripeptide-stabilisé de l’acide oléique

Un protocole est présenté pour la synthèse d’oligomères peptoïdes codés par l’information et pour l’auto-assemblage séquencé de ces peptoïdes en échelles moléculaires utilisant des amines et des aldéhydes comme paires de réactifs covalentes dynamiques et Lewis acidité de la terre rare les trigoles métalliques en tant que réactifs multirôles.

Synthèse de Peptoïdes porteurs d’informations et de leur auto-assemblage dynamique covalent dirigé par séquence

Ce protocole présente la synthèse de peptides cycliques via la bisalkylation entre la cystéine et la méthionine et la réaction thiol-yne facile déclenchée par le centre propargylsulfonium.

Construction de peptides cycliques à l’aide d’un centre de sulfonium sur attache

Ce protocole vise à évaluer les peptides biofonctionnels auto-assemblés pour l’adhésion cellulaire, la morphologie des organoïdes et l’expression génique par immunomarquage. Nous utiliserons une lignée cellulaire de cancer colorectal pour fournir un moyen rentable d’obtenir des organoïdes pour des tests intensifs.

Fabrication et caractérisation d’organoïdes de cancer colorectal à partir de la lignée cellulaire SW1222 dans une matrice peptidique auto-assemblée ultracourte

Ce protocole présente trois méthodes de préparation simples et rapides qui utilisent les conditions environnementales pour déclencher l’auto-assemblage des peptides en hydrogels. De plus, la caractérisation des hydrogels peptidiques est décrite, démontrant que des hydrogels peptidiques mécaniquement stables peuvent être formés dans ces conditions simples.

Préparation d’hydrogels de peptides auto-assemblés mécaniquement stables

Peptides amides tertiaires (APE) sont une superfamille de peptidomimétiques qui incluent, mais ne sont pas limités à des peptides, des peptoïdes et les peptides N-méthylés. Nous décrivons ici une méthode synthétique qui combine à la fois divisée et-piscine et stratégies sous-monomères pour synthétiser un une bille bibliothèque d'un composé de PTA.

Split-et-piscine Synthèse et caractérisation de peptides tertiaire Amide Bibliothèque

Apprenez la synthèse de peptides modifiés par 1,2-dithiolane et la caractérisation des structures supramoléculaires auto-assemblées. Cette méthode efficace utilise un couplage sur résine avec une seule étape de purification.

Synthèse et caractérisation de 1, 2-Dithiolane modifiée Peptides auto-assemblage

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