Synthèse et caractérisation de 1, 2-Dithiolane modifiée Peptides auto-assemblage

Au fur et à mesure que les structures permettant d’augmenter la fonctionnalité des structures supermoléculaires se développent, cette méthode d’incorporation de groupes 1,2-dithiolane avec des peptides auto-assemblés peut aider à répondre à des questions clés sur la réactivité sur les surfaces supermoléculaires. Le principal avantage de cette technique est que le couplage et la déprotection de la molécule précurseur du 1,2-dithiolane se produisent sur la résine avec une seule étape de purification du peptide final modifié. Comme le temps nécessaire aux assemblages pour aboutir à leurs structures supermoléculaires finales varie, la démonstration visuelle des méthodes de caractérisation et des résultats des assemblages supermoléculaires est essentielle.

Pour synthétiser le précurseur du dithiolane, il faut d’abord dissoudre un gramme d’acide 3-bromo-2-proprionique dans environ quatre millilitres d’hydroxyde de sodium à une molaire dans un ballon réactionnel à fond rond de 50 millilitres à 55 degrés Celsius en agitant. Lorsque tout le réactif a été mis en suspension dans la solution, scellez le ballon de réaction avec un septa et placez le ballon sous une atmosphère d’azote. Ensuite, ajoutez 1,49 gramme de thioacétate de potassium et trois millilitres d’acide sulfurique à deux molaires à quatre millilitres d’eau déminéralisée pour créer de l’acide thioacétique in situ.

Aspirez la solution d’acide thioacétique dans une seringue en plastique jetable de 10 millilitres et équipez la seringue d’une aiguille de calibre 18, puis percez les septa avec l’aiguille pour ajouter le mélange goutte à goutte dans le ballon de réaction et poursuivez la réaction toute la nuit à 55 degrés Celsius. Le lendemain matin, surveiller la réaction par chromatographie sur couche mince sur des plaques de gel de silice 60 F254 à l’aide d’un mélange de méthanol et de dichlorométhane et visualiser la progression de la réaction par coloration au vert de bromocrésol. Lorsque la réaction terminée s’est refroidie à température ambiante, acidifiez le mélange avec de l’acide sulfurique à deux molaires à un pH de un.

Une huile jaune doit se séparer de la solution, puis extraire le produit avec trois ajouts de 40 millilitres de chloroforme froid et combiner les couches organiques pour le séchage sur du sulfate de magnésium, en éliminant le chloroforme sous pression réduite. Le produit doit être une huile jaune avec un rendement global de 83 % et peut être utilisé sans autre purification. Pour coupler le précurseur du dithiolane à l’extrémité N-terminale du peptide sur résine, ajoutez quatre équivalents du précurseur du dithiolane à cinq millilitres de diméthylformamide, quatre équivalents de HBTU et 10 équivalents de DIPEA.

Laissez le mélange de couplage se préactiver pendant 10 minutes à température ambiante avant d’ajouter l’échantillon à la seringue frittée contenant de la résine N-terminale. Agitez la réaction de couplage pendant deux heures, suivies de trois lavages de cinq millilitres dans du diméthylformamide frais et répétez la réaction de couplage et agitez toute la nuit. Après le deuxième couplage, lavez la résine avec trois lavages de diméthylformamide de cinq millilitres suivis de trois lavages de résine de dichlorométhane de cinq millilitres et transférez la résine séchée dans un tube de réaction à micro-ondes de 10 millilitres.

Ensuite, pour déprotéger le groupe thioacétate du précurseur N-terminal dithiolane, ajoutez deux millilitres de diméthylformamide dans le tube. Laissez la résine gonfler, ajoutez une petite barre d’agitation magnétique dans le récipient et remettez la résine en suspension avec une agitation magnétique à basse vitesse. Après 15 minutes, ajoutez deux millilitres d’hydroxyde d’ammonium concentré dans le tube, bouchez le récipient de réaction avec un septa en silicone et placez le récipient dans un réacteur à micro-ondes pendant 45 minutes à 75 degrés Celsius en remuant.

Lorsque la réaction par micro-ondes est terminée, transférez la résine dans une seringue frittée propre et jetable et lavez la résine avec deux lavages de diméthylformamide de cinq millilitres et deux lavages de méthanol de cinq millilitres. Après le dernier lavage, ajoutez cinq millilitres de cocktail de décolleté dans la seringue contenant de la résine pour une incubation de 1 heure et demie en secouant doucement à température ambiante. Pour préparer un millilitre de peptide brut pour la chromatographie liquide à haute performance ou la purification HPLC, ajoutez 400 microlitres de peptide concentré dans de l’acétonitrile à 600 microlitres d’eau complétée par 0,1 % d’acide trifluoroacétique et filtrez la solution à travers un filtre à seringue de 22 micromètres dans un flacon HPLC.

Pour purifier le peptide, utilisez une colonne semi-préparative en C18 à un débit de trois millilitres par minute sur un gradient linéaire de 15 à 55 % d’acétonitrile en 20 minutes avec les détecteurs UV réglés sur 222 nanomètres et 330 nanomètres. Ensuite, collectez et combinez les sommets d’intérêt. Pour la confirmation du produit peptidique par désorption/ionisation laser assistée par matrice temps de vol ou spectrométrie de masse MALDI-TOF, mélanger 0,5 microlitre du pic collecté sur une plaque de désorption/ionisation laser assistée par matrice contenant 0,5 microlitre de matrice d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque.

Pour préparer une solution d’auto-assemblage, dissolvez un milligramme de poudre de peptide lyophilisé dans un mélange de 20 % d’acétonitrile et de 10 millimolaires d’HEPES dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, puis agitez la solution d’assemblage et laissez l’échantillon s’assembler à température ambiante. Lorsque l’assemblage peptidique atteint sa maturité, séchez huit à 10 microlitres de la solution d’assemblage sous forme de film mince sur le cristal de diamant atténué à réflexion totale et surveillez la disparition d’un grand et large pic d’eau de 1640 à 1631 centimètres inverses au fur et à mesure que le film sec se forme. Acquérez des spectres d’arrière-plan et infrarouges de 1500 à 1800 centimètres inverses en moyenne sur 50 balayages avec une résolution de deux centimètres inverses, en soustrayant les balayages d’arrière-plan avant chaque balayage d’échantillon.

La signature infrarouge pour l’assemblage de la feuille bêta doit être observée comme un pic net entre 1625 et 1635 centimètres inverses. Lorsque les échantillons de peptides ont mûri en structures supermoléculaires riches en feuillets bêta, chargez 10 microlitres de la solution d’assemblage de peptides sur la surface d’une grille de carbone de microscope électronique à transmission et laissez les assemblages s’adsorber sur la surface de la grille pendant une à deux minutes. Touchez le papier filtre sur le bord de la grille pour retirer l’échantillon en excès, et ajoutez 10 microlitres de colorant d’acétate d’uranyle à 2 % fraîchement préparé à la surface de la grille pour une incubation de deux à trois minutes, puis enlevez l’excès de teinture avec du papier filtre et placez la grille dans un dessiccateur sous vide pendant la nuit avant l’imagerie du lendemain par microscopie électronique à transmission.

Mis à part la synthèse initiale en une étape de la molécule précurseur du dithiolane, le reste de la synthèse du peptide modifié au 1,2-dithiolane se produit sur un support solide. La conversion de l’acide 3-bromo-2-proprionique en acide 3-2-propanoïque, le précurseur du dithiolane, est confirmée par résonance magnétique nucléaire des protons et du carbone 13 avant qu’il ne soit couplé à l’amine N-terminale libre d’un peptide encore sur résine. Après déprotection, le peptide brut est purifié par HPLC en phase inverse et la masse du produit est confirmée par spectrométrie de masse MALDI-TOF.

La spectroscopie de dichroïsme infrarouge et circulaire à transformée de Fourier peut être utilisée pour surveiller l’auto-assemblage du peptide 1,2-dithiolane purifié en fibres amyloïdes matures afin de caractériser leur conformation en feuillet bêta étendu. Les fibres peuvent ensuite être imagées par microscopie électronique à transmission. Bien que ces méthodes puissent être utilisées pour modifier l’extrémité N-terminale de n’importe quelle séquence peptidique encore sur de la résine, il est important de se rappeler que les conditions d’auto-assemblage du peptide doivent être optimisées pour chaque peptide.

Ces techniques, qui permettent d’ajouter des groupes 1,2-dithiolane à des peptides auto-assemblés, permettront aux chercheurs dans le domaine des biomatériaux d’explorer la réactivité supermoléculaire de surface.