D'enregistrement optique de l'activité neuronale supraliminaire avec une résolution à cellule unique et un seul pic

L’objectif global de l’expérience FollowMe est d’enregistrer l’activité de pic neuronal d’un grand nombre de neurones. Ceci est réalisé en observant l’augmentation de la concentration de calcium intracellulaire dans un soma neuronal associé à chaque potentiel d’action à l’aide de la microscopie à fluorescence dans la première étape. L’excitation à deux photons et un principe de balayage à accès aléatoire sont utilisés pour enregistrer des signaux fluorescents calciques de 40 neurones somato avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

Dans un deuxième temps, les temps de pointe précis sont extraits des signaux fluorescents à l’aide d’un algorithme de déconvolution. Cette technique peut être utilisée pour enregistrer l’activité de pointe de dizaines de neurones. Les données de dopage peuvent ensuite être utilisées pour mesurer l’information mutuelle, la propagation du signal entre les populations neuronales ou les corrélations neurologiques.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’enregistrement à micro-électrodes, est que l’on peut enregistrer l’activité des pics de neurones à partir d’un grand nombre de neurones d’une population locale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la fonction corticale au niveau des réseaux locaux de neurones, telles que l’importance des corrélations, de la recherche d’informations et des changements dans la dynamique des réseaux avec plasticité cortico. Pour l’excitation à deux photons, un système laser à impulsions infrarouges avec des impulsions femtosecondes est utilisé. Une puissance de sortie laser élevée est nécessaire pour compenser les pertes importantes introduites par les composants optiques du système.

Un prédicateur par système composé de deux prismes confère une dispersion de vitesse de groupe négative aux impulsions laser avant les déflecteurs optiques custo pour compenser la dispersion temporelle introduite par les AOD : deux AOD à grandes ouvertures dévient le faisceau laser en deux dimensions. Un nivellement de diffraction réfléchissant avec 100 rainures par millimètre est placé à 13 centimètres derrière les AOD pour compenser la dispersion spatiale introduite par les AOD. Lors de l’utilisation d’impulsions laser courtes, le faisceau laser est dirigé avec deux télescopes à relais dans le port de caméra d’un microscope vertical.

Les iris sont placés à intervalles réguliers pour l’alignement des composants optiques. Un séparateur de faisceau dichroïque situé devant l’objectif transmet la lumière d’excitation infrarouge à l’échantillon et réfléchit la lumière de fluorescence de l’échantillon sur un détecteur. Les détecteurs de fluorescence épi et trans collectent le signal de fluorescence à travers l’objectif et les filtres en verre coloré du condenseur sont placés devant les détecteurs pour empêcher la lumière d’excitation d’atteindre les détecteurs.

Les angles de déviation A OD sont contrôlés par un ordinateur équipé d’une carte de conversion analogique numérique, qui à son tour pilote des oscillateurs contrôlés en tension. Le signal des photomultiplicateurs est relayé par un filtre passe-bas Butterworth avec une fréquence de coupure de 100 kilohertz et est numérisé par un convertisseur analogique numérique à une fréquence d’horloge de 156,25 kilohertz avant d’être stocké sur un ordinateur pour analyse, alignement et le bruit électrique sont testés en enregistrant la distribution des signaux fluorescents avec et sans lumière laser à faible et fort gain des photomultiplicateurs, Ainsi qu’avec et sans indicateur, le balayage à accès aléatoire repose sur la détection d’augmentations intracellulaires du calcium. La première étape du protocole consiste à colorer un grand nombre de neurones avec la forme Esther d’un indicateur de calcium par injection de bolus.

Ensuite, enregistrez l’activité du soma au niveau de chaque neurone à quatre endroits pendant 6,4 microsecondes à chaque endroit. Pour sélectionner les neurones d’intérêt, procurez-vous un plein format composé de 256 par 256 pixels. Sélectionnez ensuite manuellement les centres des neurones à enregistrer dans cette image.

Trois points à deux microns de distance autour de chaque centre sont automatiquement ajoutés par le logiciel de contrôle à chaque cycle. Le signal fluorescent est enregistré à partir des quatre emplacements dans les 40 neurones. L’enregistrement de tous les neurones en un seul cycle nécessite 1,536 milliseconde.

Répétez cet enregistrement séquentiel des 40 neurones pendant cinq secondes. La détection des pointes à partir de signaux somatiques fluorescents en calcium repose sur un rapport signal/bruit élevé. Un rapport signal/bruit élevé peut être obtenu en augmentant l’intensité de l’excitation.

Cependant, l’intensité de l’excitation ne peut être augmentée qu’à une certaine limite en raison des dommages causés par les photos. Il n’y a qu’une très petite fenêtre d’intensité d’excitation où les dommages photologiques sont faibles et le rapport signal/bruit est suffisant pour détecter des pics uniques afin de s’assurer que les signaux enregistrés se trouvent dans la fenêtre de détection des pics élevés. Au cours d’une expérience, un certain nombre de logiciels d’analyse en ligne développés par notre laboratoire sont utilisés.

Ensuite, calculez le taux de photons approximatif par neurone à partir d’une courte fenêtre de temps de bruit de base d’environ 100 à 200 millisecondes. Le nombre de photons et le taux de photons sont calculés à partir des valeurs de fluorescence en ajustant la distribution des changements de fluorescence relatifs avec cette équation, puis calculent la fluorescence de base à partir de la même fenêtre temporelle et la tracent en fonction du temps ou des essais. Maintenez la baisse moyenne de la ligne de base en dessous de 0,0002 par seconde en ajustant la puissance du laser.

En effet, la détection des pointes diminue rapidement lorsque cette limite est dépassée. Après cela, vérifiez les positions somatiques des neurones toutes les 10 à 20 minutes en acquérant une image plein format. Ajustez les emplacements d’enregistrement si nécessaire.

Les signaux fluorescents résultant de l’activité neuronale mangeaient souvent dans le temps en raison de la longue décomposition du calcium transitoire. Dans cette procédure, une méthode de déconvolution est utilisée pour les pics et les timings de pics à partir des signaux fluorescents. Ici, nous utilisons un algorithme génétique pour déterminer le modèle de train de pointes le plus probable qui correspond au signal fluorescent enregistré.

À chaque itération de l’algorithme, le maximum de vraisemblance se rapproche asymptotiquement de son maximum donné par le bruit des enregistrements de fluorescence. Dans les populations homogènes de neurones, le signal calcique évoqué par le pic peut varier entre les neurones. Pour l’analyse non supervisée de grands ensembles de données, nous avons conçu un algorithme qui prend en compte la variation du signal calcique évoqué par le pic d’un neurone à l’autre afin d’éviter un grand nombre de détections de faux positifs.

La distribution conjointe de l’amplitude et de la constante de temps de décroissance des transitoires calciques évoqués à un seul pic est enregistrée dans une série distincte d’expériences à partir du même type de neurones dans les mêmes conditions expérimentales. Pour tenir compte de la lenteur des changements de ligne de base et pour réduire les coûts de calcul de la déconvolution, les enregistrements plus longs sont divisés en plusieurs traces plus courtes d’une à cinq secondes pour chaque neurone dans chaque enregistrement, l’algorithme de déconvolution peut tester un grand nombre de modèles jusqu’à 1 million de modèles différents ou plus pour accélérer la déconvolution une expérience est déconvolutée sur un maximum de 10 ordinateurs différents. En parallèle.

Après la déconvolution, les données de pointe sont analysées et inspectées. Le temps péri-stimulus, l’histogramme, la probabilité de pic et le taux de décharge des neurones sont calculés de manière automatisée. Voici les exemples d’un signal fluorescent enregistré à un taux d’excitation très faible et l’autre à un taux d’excitation très élevé dans la fenêtre de détection.

Notez que chaque exemple montre la réponse à un pic. On voit ici une photomicrographie d’une tranche de cerveau aiguë et deux pipettes de stimulation placées dans la même colonne corticale. Dans la couche quatre, ceux-ci montrent les réponses neuronales pour les stimuli répétitifs, et ce graphique montre les informations mutuelles de Shannon signalées par la population de neurones enregistrée.

Voici la mesure de la propagation de l’activité de super-seuil entre différentes populations de neurones corticaux. Ce sont les pointes détectées dans les neurones corticaux, en réponse à la stimulation électrique des fibres corticales thal. Lors de l’enregistrement de l’activité neuronale à l’aide du balayage à accès aléatoire, il est très important d’enregistrer dans la fenêtre de détection.

Sinon, il est très facile de se retrouver avec des ensembles de données inutilisables. La détection optique des pointes en est encore à ses balbutiements. Il y a beaucoup de place pour l’amélioration.

Avec quelques améliorations, nous enregistrons à partir d’encore plus de neurones. Avec d’autres améliorations, nous serons même en mesure d’enregistrer les animaux éveillés et en bonne santé.