Name: Conversion dun test ELISA de capture à un test Luminex xMAP utilisant une méthode de dépistage danticorps Multiplex (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Apprenez à convertir un test ELISA de capture en test Luminex xMAP pour le dépistage d'anticorps multiplex. Cette méthode améliore la sensibilité et la plage dynamique pour la détection de cytokines.

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Ce travail a été financé par Luminex Corporation.

<ol><li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li>
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<li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li>
<li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li>
</ol>

Ce travail a été fait à Luminex Corporation avec du matériel fabriqué à Luminex Corporation. R &amp; D Systems &amp; EMD Millipore sont des partenaires stratégiques de Luminex Corporation; licence pour développer et commercialiser des tests multiplex xMAP base.

La conversion d&#39;un test ELISA pour la plate-forme Luminex xMAP peuvent être aussi simples que la substitution streptavidine peroxydase de raifort (SA-HRP) dans un cadre typique kit ELISA avec de la streptavidine phycoérythrine (SA-PE), et l&#39;optimisation de la performance. Pour ceux qui veulent créer un immunoessai xMAP de la terre vers le haut, ce qui peut être accompli avec un protocole simple qui permet également l&#39;évaluation multiplex rapide, des paires d&#39;anticorps. Les réactifs pour le dosage xMAP ont été facilement préparés en utilisant le kit Anticorps xMAP couplage pour coupler les anticorps de capture désignés pour MagPlex faible concentration des microsphères. L&#39;utilisation d&#39;une faible concentration microsphères réduit le coût de l&#39;élaboration de tests, tout en offrant la performance de dosage même de concentration plus élevée des microsphères. Le montant de temps requis pour préparer couplé MagPlex microsphères est d&#39;environ 3 heures, ce qui est beaucoup plus rapide que les 22 - 24 heures nécessaires pour recouvrir le puits d&#39;une plaque ELISA, suivie d&#39;un traitementdes puits revêtus. La performance du test xMAP est également supérieure à la technique ELISA en termes de limite de détection (&lt;4 pg / ml vs&gt; 31 pg / mL) et dynamique large (&lt;4 pg / mL à&gt; 8000 pg / ml contre 16 pg / ml à 1000 pg / mL). Lecteurs de plaques ont une gamme limitée DO qui est soit 3 ou 4 DO, limitant la limite supérieure de la plage dynamique pour un dosage. Sans doute, tous les anticorps travailler dans un format ELISA et tous les anticorps qui fonctionnent bien dans un test ELISA sont facilement transférables au format de dosage xMAP. Toutefois, étant donné que des dosages xMAP peuvent être multiplexés (c&#39;est à dire, fonctionner simultanément), il est possible d&#39;évaluer la capture de plusieurs combinaisons et détection des anticorps en même temps d&#39;identifier la meilleure paire à utiliser pour un essai. Ce processus permet d&#39;économiser beaucoup de temps et réactifs par rapport à la procédure d&#39;élaboration ELISA, qui se limite à l&#39;évaluation d&#39;une paire à la fois. Si deux ou plusieurs paires d&#39;anticorps effectuer équivalente; d&#39;autres paramètres de l&#39;essai peutêtre considéré pour déterminer l&#39;aptitude de la paire (par exemple, disponibilité, coût, etc.) En plus de la performance du test et une flexibilité améliorées avec le dosage xMAP, il ya aussi d&#39;importantes économies. La quantité recommandée d&#39;anticorps nécessaire pour enrober un seul puits d&#39;une plaque ELISA est 400ng, alors que la quantité requise pour les billes utilisées dans un puits d&#39;un dosage xMAP est d&#39;environ 7,5 ng. Ainsi, la quantité d&#39;anticorps nécessaire pour un ELISA ainsi fournira plus de 50 résultats des tests, si elle est utilisée dans un test xMAP. Pour les applications impliquant des échantillons précieux, xMAP a également un avantage significatif. Le volume de l&#39;échantillon recommandé pour le test ELISA est de 100 pi tandis que le volume requis pour le dosage xMAP peuvent être la moitié de ce que, ou moins. En résumé, la conversion d&#39;un test ELISA pour la plate-forme Luminex xMAP est simple, efficace et économique, tout en produisant un essai avec une gamme dynamique supérieure et de la sensibilité.

<table border="1"><tbody><tr><td> Description </td><td> Vendeur </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet kit ELISA </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Comprend monoclonaux et de la biotine couplés des anticorps polyclonaux et recombinant standards protéine TNF-α </td></tr><tr><td> Anticorps monoclonal anti-TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> Anticorps de capture, clone CH8820 </td></tr><tr><td> Anticorps monoclonal anti-TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Anticorps Biotine détection couplé, clone AS1 </td></tr><tr><td> TNF alpha protéines </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> Recombinant norme protéine TNF-α </td></tr><tr><td> Anticorps monoclonal anti-TNF-α </td><td> Novus </td><td> NBP1-50115 </td><td> Anticorps de capture, clone 4H31 </td></tr><tr><td> Anticorps monoclonal anti-TNF-α </td><td> Novus </td><td> NB100-78162 </td><td> Anticorps Biotine détection couplé, clone MAb11 </td></tr><tr><td> TNF alpha protéines </td><td> Novus </td><td> NBC1-18460 </td><td> Recombinant norme protéine TNF-α </td></tr><tr><td> Anticorps monoclonal anti-TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Anticorps de capture, cloner 3C7.2 </td></tr><tr><td> Anticorps polyclonaux anti-TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> Anticorps polyclonal de lapin de détection </td></tr><tr><td> Streptavidine-phycoérythrine </td><td> Mousse </td><td> SAPE-001 </td><td> Réactif fluorescent pour reporter test Luminex xMAP </td></tr><tr><td> MAGPIX w / Software XPONENT </td><td> Luminex Corporation </td><td> MAGPIX-XPONENT </td><td> Instrument Luminex </td></tr><tr><td> xMAP Anticorps Coupling (ABC) Kit </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> Comprend réactif EDC, sulfo-NHS réactif, tampon d&#39;activation, tampon de lavage, des tubes de 1,5 mL de réaction, et les pipettes jetables </td></tr><tr><td> MagPlex microsphères, à faible concentration </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Perles à faible concentration (@ 2,5 x 10 6 billes / mL) </td></tr><tr><td> EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotine </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21335 </td><td> Kit de détection des anticorps pour Biotinylation non modifiée </td></tr><tr><td> Tecan Infini F200 Lecteur </td><td> Tecan </td><td></td><td> Lecteur de plaque ELISA </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% du PBS-BSATampon de dosage, </td></tr><tr><td> Une pinte-Cleaner Compact ultrasons, 115 VAC </td><td> Cole-Parmer </td><td> WU-08849-00 </td><td> Produire une fréquence de fonctionnement effective de 55 kHz </td></tr><tr><td> Séparateur magnétique Tube </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288-01 </td><td> Pour la séparation seul tube de 1,5 ml magnétique dans les étapes de lavage de couplage </td></tr><tr><td> Séparateur plaque magnétique </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269-01 </td><td> Pour 96-ainsi la séparation plaque magnétique dans les étapes de lavage de dosage </td></tr></tbody></table>

conversion d&#39;un test elisa de capture à un test luminex xmap utilisant une méthode de dépistage d&#39;anticorps multiplex

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Le dosage immuno-enzymatique (ELISA) a longtemps été le principal outil pour la détection d&#39;analytes d&#39;intérêt dans des échantillons biologiques pour la recherche à la fois sciences de la vie et les diagnostics cliniques. Cependant, le test ELISA a ses limites. Il est généralement réalisé dans une microplaque de 96 puits, et les puits sont recouverts d&#39;anticorps de capture, ce qui nécessite une quantité relativement importante de l&#39;échantillon pour capturer un antigène d&#39;intérêt. La grande surface des puits et la liaison hydrophobe de l&#39;anticorps de capture peut également conduire à fond non spécifique contraignante et plus. En outre, la plupart des tests ELISA compter sur l&#39;intermédiaire d&#39;enzyme amplification du signal afin d&#39;obtenir une sensibilité raisonnable. D&#39;amplification telle n&#39;est pas toujours linéaire et peut fausser les résultats ainsi. Au cours des 15 dernières années, une nouvelle technologie a vu le jour qui offre les avantages de la technique ELISA, mais aussi permet un débit plus élevé, une plus grande souplesse, volume de l&#39;échantillon réduit, et à moindre coût, avec un wo similairerkflow 1, 2. Luminex xMAP de la technologie est une plate-forme de réseau de microsphères (billes) permettant à la fois monoplex et essais multiplex qui peuvent être appliquées à la fois des protéines et acides nucléiques applications 3-5. Les billes ont l&#39;anticorps de capture immobilisé de façon covalente sur une surface plus petite, ce qui nécessite moins anticorps de capture et les volumes d&#39;échantillons plus petites, par rapport à ELISA, et la liaison non spécifique est réduite de manière significative. Volumes d&#39;échantillons plus petits sont importantes lorsque l&#39;on travaille avec des échantillons limitant tels que le liquide céphalo-rachidien, du liquide synovial, etc 6. Multiplexage le dosage réduit encore le volume d&#39;échantillon exigences, permettant plusieurs résultats à partir d&#39;un seul échantillon. Les récentes améliorations de Luminex comprennent: le nouveau système MAGPIX, une plus petite, moins coûteuse, plus facile à utiliser l&#39;analyseur; faible concentration magnétique MagPlex microsphères qui éliminent le besoin de coûteux plaques filtrantes et viennent dans une concentration de travail mieux adapté pour le développement de tests et defaible débit demandes, et l&#39;anticorps xMAP accouplement (ABC) du kit qui comprend un protocole, les réactifs et produits consommables nécessaires pour coupler billes à l&#39;anticorps de capture d&#39;intérêt. (Voir la section Matériaux pour une liste détaillée du contenu du kit.) Dans cette expérience, nous convertissons un test pré-optimisée ELISA pour la cytokine TNF-alpha à ​​la plate-forme xMAP et comparer la performance des deux méthodes 7-11. TNF-alpha est un biomarqueur utilisé dans la mesure des réponses inflammatoires chez les patients souffrant de troubles auto-immunes. Nous commençons par le couplage quatre anticorps de capture candidats à quatre ensembles de microsphères ou des régions différentes. Lorsque mélangés, ces quatre ensembles de permettre l&#39;analyse simultanée de tous les quatre candidats ayant quatre anticorps de détection distinctes afin de déterminer la meilleure paire d&#39;anticorps, les réactifs d&#39;épargne, de l&#39;échantillon et le temps. Deux dosages xMAP sont ensuite construits avec les deux paires d&#39;anticorps les plus optimales et leur performance estpar rapport à celle du dosage ELISA originale en ce qui concerne la puissance du signal, la gamme dynamique, et la sensibilité.

Un test ELISA peut être facilement converti en un dosage Luminex xMAP et, grâce aux bienfaits de multiplexage, plusieurs anticorps peuvent être projetés simultanément pour identifier une paire d&#39;anticorps optimal, ce qui entraîne une sensibilité accrue et une gamme dynamique, tout en réduisant les coûts du test.

Conversion d&#39;un test ELISA de capture à un test Luminex xMAP utilisant une méthode de dépistage d&#39;anticorps Multiplex

Le dosage d'immunosorption enzymatique (ELISA) est depuis longtemps l'outil principal de détection d'analytes d'intérêt dans des échantillons biologiques, tant pour les sciences de la vie...

L'objectif général de l'expérience suivante est de convertir un dosage Eliza préalablement optimisé pour la cytokine TNF Alpha vers la plateforme Xap tout en évaluant des paires d'anticorps alternatives. Cette conversion est réalisée en couplant l'anticorps de capture du kit ELIZA, ainsi que trois autres anticorps de capture candidats, à quatre jeux différents de microsphères ou de billes mélangés ensemble. Ces quatre jeux permettent de tester simultanément les quatre candidats avec quatre anticorps de détection distincts afin de déterminer la meilleure paire d'anticorps.Deux nouveaux dosages Xap sont réalisés à l'aide des deux paires d'anticorps les plus optimales. Les performances des dosages sont ensuite comparées à celles du dosage EISA d'origine en ce qui concerne l'intensité du signal, la gamme dynamique et la sensibilité. Les résultats montrent que des anticorps similaires peuvent avoir des comportements très différents dans les mêmes conditions et que plusieurs anticorps peuvent être criblés simultanément à l'aide du dosage Xap Luminex, révélant ainsi que ce dosage présente une sensibilité et une gamme dynamique accrues par rapport au dosage EISA.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le test ELISA est que les immunodosages basés sur le xap permettent au chercheur de tester plusieurs cibles, ou, comme dans ce cas, de tester plusieurs anticorps simultanément. Pour identifier le meilleur anticorps démontré. La procédure sera réalisée par Erica Lopez, scientifique associée chez Luminex Corporation.Commencez ce protocole par la sélection et la préparation de quatre anticorps de capture et de quatre anticorps de détection spécifiques de la TNF alpha humaine, comme décrit dans le protocole écrit. Préparez également un anticorps de confirmation spécifique de l'espèce hôte des anticorps de capture. Portez les réactifs du kit de couplage d'anticorps à température ambiante.Étiquetez quatre tubes à réaction avec les numéros de régions des billes sélectionnés pour la réaction de couplage. Transférez le contenu des quatre flacons de microbilles MagPlex dans les quatre tubes à réaction étiquetés. Lavez chaque jeu de billes deux fois dans 500 microlitres de tampon d'activation et activez chaque jeu de billes avec les solutions de sulfONHS et d'EDC comme décrit dans le kit de couplage d'anticorps.Mode d'emploi : après une incubation de 20 minutes sur un agitateur rotatif, répéter l'étape de lavage précédente avec les billes maintenant activées, pour un total de trois fois, en utilisant 500 microlitres de tampon d'activation. Pour chaque lavage, préparer quatre solutions séparées de 500 microlitres, chacune contenant 7,5 microgrammes d'anticorps de capture dans du tampon d'inactivation.Ajoutez ces quatre solutions d'anticorps de capture à leurs tubes à réaction respectifs. Vortexez immédiatement chaque tube et incubez pendant deux heures sur un agitateur rotatif. Répétez l'étape de lavage avec les billes maintenant couplées un total de trois fois avec 500 microlitres du tampon de lavage fourni avec le kit de couplage d'anticorps.Après la dernière étape de lavage, ajouter 500 microlitres de tampon de lavage dans chaque tube à réaction afin d'obtenir une concentration finale de 5 millions de billes couplées à l'anticorps par millilitre, puis vortexer et soniquer les tubes à réaction pour disperser les billes. Compter le nombre de billes récupérées après la réaction de couplage à l’aide d’un compteur de cellules ou d’un hémocytomètre. Le rendement de la réaction de couplage est généralement supérieur à 90 %. Confirmer la réussite de la réaction de couplage en préparant des solutions témoins des stocks de billes couplées pour chaque série, avec une concentration finale de 100 billes par microlitre dans le tampon d’essai, et en préparant une dilution de l’espèce antisérique marquée au FICO érythrine.Anticorps de confirmation IgG à quatre microgrammes par millilitre dans du tampon de dosage. Aliquoter 50 microlitres de chaque solution test dans quatre puits d'une plaque 96 puits à fond rond, pour un total de 16 puits. Ajouter ensuite 50 microlitres de tampon de dosage dans huit des puits pour mesurer le fond et 50 microlitres d'anticorps de confirmation dilué dans les huit puits restants. Mélanger délicatement les réactions en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas à l’aide d’une pipette multicanal.Couvrez la plaque et incubez pendant 30 minutes à température ambiante sur un agitateur de plaque. Placez la plaque sur un séparateur magnétique pendant une à deux minutes afin d’attirer les billes hors de la solution. Ensuite, éliminez le liquide en retournant énergiquement la plaque, toujours placée sur le séparateur, au-dessus d’un récipient de déchets.Lavez chaque puits deux fois en ajoutant 100 microlitres de tampon de dosage et en éliminant le SANE de la plaque de la même manière. À l’aide du séparateur magnétique pour plaque, resuspendez les billes dans 100 microlitres de tampon de dosage en pipetant doucement cinq fois de haut en bas avec un pipeteur multicanal. Analysez à l’aide d’un appareil Luminex xap, tel que l’appareil magix.L'intensité du signal fluorescent de cette réaction est directement proportionnelle à la quantité de protéine à la surface des billes, ce qui permet une évaluation rapide de la quantité relative de protéine couplée aux billes. Pour déterminer la paire d'anticorps la plus efficace dans le test xap, préparez un mélange initial des quatre jeux de billes en ajoutant 10 microlitres de chacun à 0,96 millilitre de tampon de dosage. Préparez les solutions d'anticorps de détection en diluant chaque anticorps à une concentration d'un microgramme par millilitre dans le tampon de dosage.Aussi un tampon d'essai. Préparez l'étalon protéique TNF alpha des systèmes r et d à 2000 picogrammes par millilitre et diluez la streptavidine R FICO érythrine à huit microgrammes par millilitre. Ajoutez 50 microlitres du mélange de billes couplées à l'anticorps dans chacun des 16 puits d'une plaque 96 puits CoStar à fond rond pour l'essai de criblage.Ensuite, ajoutez 50 microlitres de tampon de dosage à huit des 16 puits pour mesurer le fond. Puis pipetez 50 microlitres de l'étalon de TNF alpha dans les huit autres puits afin de mesurer la réponse. Incubez pendant une heure à température ambiante, à l’abri de la lumière, tout en agitant sur un agitateur pour plaque de dosage.Ensuite, ajouter 50 microlitres de chacun des quatre anticorps de détection à quatre puits, dont deux sont des puits de fond et deux des puits de réponse. Incuber pendant 30 minutes dans les mêmes conditions après l'ajout de 50 microlitres du réactif SAPE dans tous les puits. Incuber à nouveau pendant 15 minutes dans les mêmes conditions.Placer la plaque sur un séparateur magnétique pendant une minute. Ensuite, éliminer le liquide en retournant vigoureusement la plaque, toujours placée sur le séparateur, au-dessus d'un récipient de déchets. Ajouter 100 microlitres de tampon de dosage dans chacun des 16 puits à l’aide d’une pipette.Ensuite, retirez le liquide des billes à l'aide d'une séparation magnétique. Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon d'essai dans chacun des 16 puits. Lisez la plaque à l'aide de l'instrument Luminex mag picks en vous référant au mode d'emploi pour une utilisation correcte.Sélectionnez une paire d'anticorps qui répond à l'intensité de signal souhaitée. Après avoir choisi le meilleur anticorps de capture, diluez 100 microlitres de la solution mère d'anticorps couplés à des billes à 10 millilitres avec du tampon d'analyse. Ajoutez 50 microlitres des billes diluées dans 78 puits de deux plaques 96 puits CoStar à fond rond.Chaque plaque servira à évaluer la performance d'un anticorps de détection différent. Préparez ensuite une courbe standard à 12 points, commençant à 8 000 picogrammes par millilitre et se terminant à quatre picogrammes par millilitre. Avec les systèmes r et d.Ajouter six réplicats de 50 microlitres de chaque dilution de l'étalon TNF Alpha à chacune des plaques, ainsi que six puits contenant chacun 50 microlitres de tampon de dosage, servant de fond pour un total de 78 puits par plaque. Incuber les plaques pendant une heure à température ambiante, à l'abri de la lumière, tout en agitant sur un agitateur pour plaque de dosage. Ensuite, ajouter 50 microlitres du premier anticorps de détection dans les 78 puits de la première plaque.Répétez pour le deuxième anticorps de détection sur la deuxième plaque. Incubez les plaques pendant 30 minutes dans les mêmes conditions. Ensuite, ajoutez 50 microlitres du réactif SAPE dans tous les puits de chaque plaque.Après avoir agité les deux plaques pendant 15 minutes à l'abri de la lumière, placez les plaques sur des séparateurs magnétiques pendant une minute. Éliminez le liquide en retournant brusquement la plaque au-dessus d'un récipient de déchets, tout en la maintenant sur le séparateur. Ensuite, pipetez 100 microlitres de tampon de dosage dans chacun des 78 puits des plaques, avant d'éliminer le liquide des billes magnétiques comme précédemment.Après avoir ajouté cent microlitres de tampon de dosage sur les billes dans chacun des 78 puits des plaques, analyser les plaques à l’aide de l’instrument mag picks en vous référant au manuel d’utilisation pour le fonctionnement adéquat. Suivre les instructions fournies avec le kit ELISA DUOset TNF Alpha humain T NF SF 1a de R & D Systems. Mesurer la réponse générée par l’étalon fourni avec le kit R & D.Répétez le test ELIa trois fois supplémentaires en remplaçant les anticorps de capture et de détection des systèmes r et d par les anticorps des autres fournisseurs. Par souci de simplicité, associez les anticorps par fournisseur et évaluez chaque paire indépendamment, comme requis par le format EISA, avec chacun des trois standards protéiques de TNF Alpha. Les tests Luminex Xap ont été réalisés en multiplex afin d'évaluer simultanément les quatre anticorps de capture sous forme de mélange, en combinant quatre jeux d'anticorps anti-TNF alpha couplés à des microsphères Mag PLX ; les anticorps de capture ont été évalués avec chacun des quatre anticorps de détection biotinylés individuellement, de sorte que l'interaction d'un anticorps de détection donné avec chacun des quatre anticorps de capture puisse être déterminée simultanément.Les résultats ont indiqué que la paire d'anticorps provenant du jeu DUO des systèmes r et d avait donné les meilleurs résultats, avec une réponse atteignant 6 183 unités d'intensité de fluorescence médiane ou MFI. On a également observé que les anticorps de détection de Millipore et ABAM produisaient une réponse raisonnable dans le test XAP lorsqu'ils étaient associés à l'anticorps de capture des systèmes RD, tandis que les anticorps de capture de Millipore, ACAM et Novus produisaient une réponse moins satisfaisante dans le test XAP. Le protocole du jeu DUO des systèmes r et d a été utilisé pour comparer les quatre paires d'anticorps dans un format EISA.Le protocole des systèmes r et d a été utilisé avec toutes les paires d'anticorps car il reflète les protocoles EIA typiques largement utilisés aujourd'hui, et il est analogue aux protocoles utilisés avec la technologie xap. Les tests EISA ont montré que la paire d'anticorps des systèmes r et d donnait à nouveau les meilleurs résultats. La paire d'anticorps d'Acam n'a produit aucune réponse, et les paires d'anticorps de Millipore et de Novas ont produit des réponses modestes afin d'évaluer toute variation de la réactivité des anticorps.Avec l'étalon, les quatre paires d'anticorps ont été testées avec trois étalons protéiques recombinants de TNF alpha provenant de trois fournisseurs différents. Les données montrent que les étalons protéiques recombinants de TNF alpha des trois fournisseurs ont donné des résultats équivalents. La protéine TNF alpha des systèmes r et d a été utilisée pour générer des courbes d'étalonnage avec les tests ELSA et XAP.Bien que le test ELI A ait été réalisé avec la paire d'anticorps du système r et d, les tests Xap ont utilisé l'anticorps de capture du système r et d et, comme anticorps de détection, soit celui des systèmes r et d, soit celui de Millipore. La protéine TNF alpha des systèmes r et d a été diluée pour produire une gamme de concentrations allant de 8 000 à quatre picogrammes par millilitre uniquement. La paire d'anticorps des systèmes r et d a donné le résultat attendu dans le test Xap, avec une réponse supérieure à 20 000 MFI, comme indiqué.Lorsque l'anticorps de détection de Millipore a été utilisé avec le test Xap à la place de l'anticorps de détection des systèmes r et d, la réponse était d'environ 30 % de celle obtenue avec l'anticorps de détection de RD Systems. La ligne verte sur ce graphique représente la courbe standard de l'ELA, dont la gamme recommandée de TNF alpha par le fabricant était de 16 à 1000 picogrammes par millilitre. En raison de la limite du spectrophotomètre, il n'a pas été possible d'augmenter la gamme du test Eliza.En outre, la plage dynamique et la sensibilité des deux méthodes sont mieux illustrées lorsqu'elles sont représentées sur une échelle logarithmique. Une distinction nette entre la pente de la réponse EISA et les réponses des tests xap peut être observée, ce qui indique davantage une capacité plus limitée de détection du TNF alpha avec l'EL iza, tant à des concentrations élevées qu'à des concentrations faibles. Les limites de détection, ou LOD, des deux tests fonctionnels xap du TNF alpha ont été estimées en identifiant la concentration la plus faible de TNF alpha produisant un niveau de réponse observé supérieur au bruit de fond, augmenté de trois fois son écart-type (SD) calculé à partir de six réplicats.Ici, on peut observer que lorsqu'on utilise la paire de systèmes r et d, la concentration la plus faible de TNF alpha, soit 3,91 picogrammes par millilitre, a produit une réponse de 66 MFI, supérieure à la réponse correspondant au fond plus trois écarts-types. Ce critère est ainsi satisfait. Lorsque l'anticorps de détection Millipore a été utilisé avec l'anticorps de capture du système r et d, la limite de détection était inférieure à 7,81 picogrammes par millilitre.Dans ce cas, la deuxième concentration la plus faible de TNF alpha a produit une réponse acceptable de 17 UFM, supérieure de trois fois l'écart type à la réponse obtenue avec la concentration la plus faible de TNF alpha. De même, la limite de détection pour le jeu double système r et d par Eliza a été estimée entre 63 et 31 picogrammes par millilitre. Suite à cette procédure, d'autres étapes telles que les tests, l'utilisation de différentes matrices d'échantillons ou des concentrations variables d'anticorps dans le système rapporteur peuvent être réalisées afin d'optimiser davantage le test xap.

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