Conversion d'un test ELISA de capture à un test Luminex xMAP utilisant une méthode de dépistage d'anticorps Multiplex

L’objectif global de l’expérience suivante est de convertir un test Eliza pré-optimisé pour la cytokine TNF Alpha à la plateforme Xap tout en évaluant d’autres paires d’anticorps. Ceci est réalisé en couplant l’anticorps de capture du kit ELIZA, ainsi que trois autres anticorps de capture candidats à quatre microsphères ou ensembles de billes différents lorsqu’ils sont mélangés ensemble. Ces quatre ensembles permettent de tester simultanément les quatre candidats avec quatre anticorps de détection distincts afin de déterminer la meilleure paire d’anticorps.

Ensuite, les deux tests Xap sont construits avec les deux paires d’anticorps les plus optimales. Les performances des tests sont ensuite comparées à celles du test EISA original en ce qui concerne l’intensité du signal, la plage dynamique et la sensibilité. Les résultats montrent que des anticorps similaires peuvent se comporter très différemment dans les mêmes conditions et que plusieurs anticorps peuvent être criblés simultanément à l’aide du test Luminex Xap, révélant que le test a une sensibilité et une plage dynamique accrues par rapport à EISA.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’EIS A est que les immunoessais basés sur le xap permettent au chercheur de tester plusieurs cibles, ou comme dans ce cas, de tester plusieurs anticorps simultanément. Identifier le meilleur anticorps démontré. La procédure sera Erica Lopez, scientifique associée chez Luminex Corporation.

Commencer ce protocole par la sélection et la préparation de quatre anticorps de capture et de quatre anticorps de détection spécifiques du TNF alpha humain, comme décrit dans le protocole écrit. Préparez également un anticorps de confirmation spécifique pour l’espèce hôte des anticorps de capture. Amenez les réactifs du kit de couplage d’anticorps à température ambiante.

Étiquetez quatre tubes de réaction avec les numéros de région de cordon sélectionnés pour la réaction de couplage. Transférez le contenu des quatre flacons de microsphères mag plex dans les quatre tubes de réaction étiquetés. Lavez chacun des ensembles de billes deux fois dans 500 microlitres de tampon d’activation et activez chaque ensemble de billes avec les solutions de sulf ONHS et EDC comme décrit dans le kit de couplage d’anticorps.

Manuel d’utilisation Après une incubation de 20 minutes sur un rotateur, répétez l’étape de lavage précédente avec les billes maintenant activées au total trois fois avec 500 microlitres de tampon d’activation. Pour chaque lavage, préparez quatre solutions distinctes de 500 microlitres. Chacun contenant 7,5 microgrammes de tampon d’inactivation des anticorps de capture.

Ajoutez ces quatre solutions d’anticorps de capture dans leurs tubes de réaction respectifs. Vortex chaque tube immédiatement et incuber pendant deux heures sur un rotateur. Répétez l’étape de lavage avec les billes maintenant accouplées trois fois au total avec 500 microlitres du tampon de lavage inclus avec le kit de couplage d’anticorps.

Après l’étape finale de lavage, ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage dans chaque tube de réaction pour obtenir une concentration finale de 5 millions de billes couplées aux anticorps par millilitre de vortex, puis sonicez les tubes de réaction pour disperser les billes. Comptez le nombre de billes récupérées après la réaction de couplage à l’aide d’un compteur de cellules ou d’un hémocytomètre. Le taux de récupération de la réaction de couplage est généralement supérieur à 90 %Confirmez que la réaction de couplage a réussi en préparant des solutions d’essai des stocks de billes couplées pour chaque ensemble avec une concentration finale de 100 billes par microlitre dans le tampon de dosage, préparez la dilution de l’érything FICO étiqueté antis-espèces.

Anticorps de confirmation IgG à quatre microgrammes par millilitre dans le tampon de dosage, aliquote de 50 microlitres de chaque solution d’essai dans quatre puits d’une plaque à fond rond de 96 puits, pour un total de 16 puits. Ajoutez ensuite 50 microlitres de tampon de test dans huit des puits pour mesurer le bruit de fond et 50 microlitres d’anticorps de confirmation dilué dans les huit puits restants. Mélangez doucement les réactions en pipetant plusieurs fois de haut en bas avec un pipeteur multicanaux.

Couvrir l’assiette et laisser incuber pendant 30 minutes à température ambiante sur un agitateur. Placez la plaque sur un séparateur de plaques magnétique pendant une à deux minutes pour extraire les billes de la solution. Ensuite, retirez le liquide en inversant avec force la plaque sur le séparateur au-dessus d’un récipient à déchets.

Lavez chaque puits deux fois en ajoutant 100 microlitres de tampon de dosage et en retirant le SANE de la plaque de la même manière. À l’aide du séparateur à plaques magnétiques, remettez les billes en suspension dans 100 microlitres de tampon de dosage en pipetant doucement de haut en bas cinq fois avec un pipeteur multicanaux. Analysez sur un instrument luminex xap tel que l’instrument magix.

L’intensité du signal fluorescent de cette réaction est directement proportionnelle à la quantité de protéines à la surface des billes, ce qui permet une évaluation rapide de la quantité relative de protéines couplées aux billes. Pour déterminer la paire d’anticorps la plus efficace dans le test xap, préparez un mélange initial des quatre ensembles de billes en ajoutant 10 microlitres de chacun à 0,96 millilitre de tampon de dosage. Préparez les solutions d’anticorps de détection en diluant chaque anticorps à un microgramme par millilitre dans un tampon de dosage.

Également un tampon de dosage. Préparez l’étalon de protéine TNF alpha des systèmes r et d à 2000 picogrammes par millilitre et diluez l’éryn Streptavidin R FICO à huit microgrammes par millilitre. Ajoutez 50 microlitres du mélange de billes couplées aux anticorps dans chacun des 16 puits d’une plaque CoStar à fond rond à 96 puits pour le test de dépistage.

Ajoutez ensuite 50 microlitres de tampon d’analyse à huit des 16 puits pour mesurer le bruit de fond. Ensuite, pipetez 50 microlitres de l’étalon TNF alpha vers les huit autres puits pour mesurer la réponse. Incuber pendant une heure à température ambiante à l’abri de la lumière tout en secouant sur une plaque de dosage.

Ajoutez ensuite 50 microlitres de chacun des quatre anticorps de détection dans quatre puits, dont deux sont des puits de fond et deux sont des puits de réponse. Incuber pendant 30 minutes dans les mêmes conditions suite à l’ajout de 50 microlitres du réactif SAPE dans tous les puits. Incuber à nouveau pendant 15 minutes dans les mêmes conditions.

Placez la plaque sur un séparateur de plaques magnétique pendant une minute. Ensuite, retirez le liquide en inversant avec force la plaque sur le séparateur au-dessus d’un récipient à déchets. Pipette de 100 microlitres de tampon de dosage dans chacun des 16 puits.

Retirez ensuite le liquide des billes à l’aide d’une séparation magnétique. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de dosage dans chacun des 16 puits. Lisez la plaque avec l’instrument de médiators magnétiques Luminex en vous référant au manuel d’utilisation pour un bon fonctionnement.

Sélectionnez une paire d’anticorps qui répond à l’intensité du signal souhaitée. Après avoir sélectionné le meilleur anticorps pour capturer, diluez 100 microlitres de ce stock de battage couplé à 10 millilitres avec un tampon de dosage. Ajoutez 50 microlitres de billes diluées dans 78 puits de deux plaques CoStar à fond rond à 96 puits.

Chaque plaque sera utilisée pour évaluer la performance d’un anticorps de détection différent. Ensuite, préparez une courbe standard de 12 points commençant à 8 000 picogrammes par millilitre et se terminant à quatre picogrammes par millilitre. Avec les systèmes r et d.

L’étalon TNF Alpha ajoute six répétitions de 50 microlitres de chaque dilution à chacune des plaques, ainsi que six puits avec 50 microlitres de tampon de dosage chacun comme arrière-plan, pour un total de 78 puits par plaque. Incuber les plaques pendant une heure à température ambiante à l’abri de la lumière tout en les secouant sur un agitateur de plaques de dosage. Ajoutez ensuite 50 microlitres de l’anticorps de première détection dans les 78 puits de la première plaque.

Répétez l’opération pour le deuxième anticorps de détection sur la deuxième plaque. Incuber les plaques pendant 30 minutes dans les mêmes conditions. Ajoutez ensuite les 50 microlitres de réactif SAPE dans tous les puits de chaque plaque.

Après avoir secoué les deux plaques pendant 15 minutes à l’abri de la lumière, placez les plaques sur des séparateurs de plaques magnétiques pendant une minute. Retirez le liquide en retournant avec force la plaque pendant qu’elle se trouve sur le séparateur au-dessus d’un récipient à déchets. Ensuite, pipetez 100 microlitres de tampon de dosage dans chacun des 78 puits sur les plaques avant de retirer le liquide des billes magnétiques.

Après avoir ajouté cent microlitres de tampon de dosage aux billes dans chacun des 78 puits sur les plaques, analysez les plaques sur l’instrument mag picks en vous référant au manuel d’utilisation pour un bon fonctionnement. En suivant les instructions fournies avec les systèmes r et d, l’homme TNF Alpha T NF SF one a DUO set ELI A kit. Mesurez la réponse générée par la norme fournie avec le kit r et d.

Répétez le test ELI a trois fois de plus, en remplaçant les anticorps de capture et de détection des systèmes R et D par les anticorps des autres fournisseurs. Pour plus de simplicité, appariez les anticorps par fournisseur, évaluez chaque paire indépendamment comme l’exige le format EISA avec chacun des trois étalons de protéine TNF Alpha. Les tests Luminex Xap ont été réalisés en multiplex pour évaluer les quatre anticorps de capture en tant que mélange en combinant quatre ensembles d’anticorps anti-TNF alpha couplés à des microsphères Mag PLX, les anticorps de capture ont été évalués avec chacun des quatre anticorps de détection biotinylés individuellement, de sorte que l’interaction d’un anticorps de détection avec chacun des quatre anticorps de capture a pu être déterminée simultanément.

Les résultats ont indiqué que la paire d’anticorps des systèmes DUO r et d a donné les meilleurs résultats, avec une réponse résultante à 6 183 unités médianes d’intensité de fluorescence ou MFI. Il a également été observé que les anticorps de détection de Millipore et d’ABAM fournissaient une réponse raisonnable dans le test XAP lorsqu’ils étaient combinés avec les anticorps de capture des systèmes RD, les anticorps de capture de Millipore, ACAM et Novus produisaient une réponse moins souhaitable dans le test XAP. Le protocole DUO set des systèmes r et d a été utilisé pour comparer les quatre paires d’anticorps dans un format EISA.

Le protocole des systèmes R et D a été utilisé avec toutes les paires d’anticorps parce qu’il reflète les protocoles EIA typiques largement utilisés aujourd’hui, et il est analogue aux protocoles utilisés avec la technologie xap. Les tests EISA ont montré que la paire d’anticorps des systèmes R et D donnait à nouveau les meilleurs résultats. La paire d’anticorps d’Acam n’a produit aucune réponse, et les paires d’anticorps de Millipore et de Novas ont produit des réponses modestes afin d’évaluer toute variation de la réactivité des anticorps.

Avec l’étalon, les quatre paires d’anticorps ont été testées avec trois étalons différents de protéine alpha recombinante du TNF provenant de trois fournisseurs différents. Les données montrent que les étalons de la protéine alpha du TNF recombinant des trois fournisseurs ont donné des résultats équivalents. La protéine alpha TNF des systèmes r et d a été utilisée pour générer des courbes standard avec les tests ELSA et XAP.

Alors que le test ELI A a été effectué avec la paire d’anticorps des systèmes r et d, les tests xap ont utilisé l’anticorps de capture du système r et d et soit l’anticorps de détection des systèmes r et d, soit Millipore. La protéine alpha du TNF provenant des systèmes r et d a été diluée pour produire une gamme de concentrations allant de 8 000 à quatre picogrammes par millilitre seulement. La paire d’anticorps des systèmes r et d a produit le résultat attendu dans le test Xap avec une réponse supérieure à 20 000 MFI, comme indiqué.

Lorsque l’anticorps de détection de Millipore a été utilisé avec le test Xap à la place de l’anticorps de détection des systèmes r et d, la réponse était d’environ 30 % de la réponse obtenue avec l’anticorps de détection des systèmes RD. La ligne verte sur ce graphique représente la courbe standard de l’ELA, dont la plage d’alpha TNF recommandée par le fabricant était de 16 à 1000 picogrammes par millilitre. En raison de la limite du spectrophotomètre, il n’a pas été possible d’augmenter la portée du test Eliza.

De plus, la plage dynamique et la sensibilité des deux méthodes sont mieux illustrées lorsqu’elles sont tracées sur une échelle logarithmique. Une distinction claire entre la pente de la réponse EISA et les réponses des tests xap peut être observée, ce qui indique en outre une capacité plus limitative pour la détection du TNF alpha avec l’EL iza à des concentrations plus élevées et plus faibles. Les limites de détection ou LOD pour les deux dosages fonctionnels du TNF alpha xap ont été estimées en identifiant la concentration la plus faible de TNF alpha avec un niveau de réponse observé supérieur au niveau de fond, plus trois fois son écart-type ou ET à partir de six répétitions.

Ici, on peut observer que lors de l’utilisation de la paire des systèmes r et d, la concentration la plus faible de TNF alpha à 3,91 picogrammes par millilitre a produit une réponse de 66 MFI, ce qui est supérieur à la réponse pour la réunion de fond plus trois écarts types. Ce critère. Lorsque l’anticorps de détection millipore a été utilisé avec l’anticorps de capture des systèmes r et d, la limite de détection était inférieure à 7,81 picogrammes par millilitre.

Dans ce cas, la deuxième concentration la plus faible de TNF alpha a produit une réponse acceptable de 17 MFI supérieure à la réponse de la plus faible concentration de TNF alpha plus trois fois son écart-type. De même, la limite de détection pour les systèmes duo r et d Eliza a été estimée entre 63 et 31 picogrammes par millilitre. Suite à cette procédure, d’autres étapes telles que des tests, diverses matrices d’échantillons ou des concentrations d’anticorps dans le rapporteur peuvent être effectuées afin d’optimiser davantage le dosage xap.