Méthodologie d'essai fluorométrique multiplexés dosage immunologique et dépannage

L’objectif général de l’expérience suivante est de détecter des anticorps contre des agents infectieux adventices chez des animaux de laboratoire. Ceci est réalisé en incubant un sérum de test avec des microsphères enrobées d’antigène. Ensuite, le sérum est incubé avec une anti-immunoglobuline spécifique de l’espèce biotinylée, qui détecte tout complexe immunitaire d’anticorps antigène.

Ensuite, une solution de force de fluor FICO eryn marquée à la streptavidine est ajoutée afin de détecter les résultats d’immunoglobulines biotinylées obtenus qui montrent un statut d’anticorps positif ou négatif pour les agents courants chez les rongeurs de laboratoire sur la base de la fluorescence multiplex, du score net d’immunoessai, des valeurs d’échantillon fluorescent. Le principal avantage de l’utilisation de cette technique par rapport à la méthode existante comme Eliza, est que le MFIA est un test multiplex. Cela permet à un chercheur de passer au crible jusqu’à cent tests différents en un seul test.

Eh bien, cette technique diminue la quantité de régions sériques et de produits jetables utilisés dans les méthodes existantes tout en augmentant la quantité d’informations générées à partir d’un seul test. Eh bien, nous avons eu l’idée d’utiliser cette méthode pour la première fois lorsque nous testions un grand nombre d’échantillons de Sera pour plusieurs agents et que nous voulions réduire la main-d’œuvre ainsi que le temps de test. La démonstration de la procédure sera faite par Donna Cohen, une technologue principale de notre laboratoire. Pour commencer, préparez deux tampons nécessaires à la procédure de multiplexage, de fluorescence, d’immunodosage ou de MFIA.

Le premier est un diluant primaire, qui est disponible à Charles River et qui contient des agents bloquants exclusifs pour réduire les interactions non spécifiques pour le tampon de lavage de test. Préparez une solution de PBS avec 1 % BSA pH 7,4 pour éliminer les particules. Filtrez le tampon à travers une unité de remplissage de bouteille de 0,2 micron dans des récipients étiquetés stériles à l’aide d’un tampon de lavage de dosage.

Préparez deux concentrations x d’anti-espèces biotinylées, IGG ou BAG et streptocoque AVID et FICO érything ou SPE, qui seront utilisés pour marquer les complexes d’antigènes et d’anticorps formés au cours de l’étape d’incubation du sérum d’essai afin de préparer des échantillons des matériaux et des jetables suivants assemblés à plusieurs et monocanaux et des pointes, et des plaques de microtitration à faible liaison protéique à 96 puits pour la dilution des protéines. Après avoir prélevé des échantillons de sang et isolé le sérum vortex brièvement avant de diluer les échantillons dans un diluant primaire dans une plaque de microtitration de 96 puits pour assurer une évacuation correcte et uniforme du puits avant de mouiller. Chaque puits de la plaque d’essai de 96 puits avec tampon de lavage de test aspire lentement la solution tout au long du test.

L’aspiration doit prendre de cinq à 10 secondes pour éviter l’agrégation des billes et le compactage des billes dans la membrane filtrante, ce qui peut ralentir les temps de lecture à la fin du test. Vérifiez que l’écoulement du liquide a cessé en épongeant le dessous de la plaque de test avec des serviettes en papier. Il est important d’éponger la plaque d’essai après chaque étape de lavage pour éviter que l’évacuation de l’eau ne s’échappe des puits pendant l’incubation.

Pour préparer les billes, commencez par vortex la suspension de talon couplée à la crosse. Ensuite, sionicez-les brièvement dans un bain. Il est essentiel de remettre correctement les billes en suspension pour éviter les grappes de billes agrégées, ce qui peut entraîner des temps de lecture plus longs.

Ensuite, versez la suspension de crosse 20 x dans une solution de bille de travail deux x dans un diluant primaire. Ensuite, versez 50 microlitres de la suspension de deux billes x dans chaque puits de dosage de la plaque de test pré-humidifiée. Pipette 50 microlitres de chaque sérum de test et de contrôle sur la plaque de test sur la base d’une carte de plaque prédéfinie.

Fixez le couvercle à la plaque. Couvrez-le d’une feuille d’aluminium et incubez la plaque de test pendant 60 minutes sur un agitateur orbital à température ambiante pour éviter l’évaporation des solutions qui peut empêcher le succès du test. Gardez la plaque d’essai recouverte avec le couvercle de la plaque pendant toutes les étapes d’incubation.

De plus, l’agitation de la vitesse doit être supérieure à 400, mais inférieure à 700 tr/min afin que les billes restent en suspension pour permettre aux anticorps sériques d’accéder à toutes les surfaces des antigènes couplés. Après avoir lavé la plaque dans des incubations séquentielles des billes avec BAG et SPE, lavez à nouveau les échantillons. Ensuite, mettez les billes en suspension en ajoutant 125 microlitres de dosage, lavez, tamponnez et secouez pendant deux minutes pour lire la plaque.

Placez-le dans le lecteur de test dans les 10 minutes suivant la suspension des billes, les billes passent une par une à travers un détecteur où elles sont exposées à deux lasers. Un laser excite les colorants internes qui identifient le jeu de couleur des billes et l’autre excite le colorant rapporteur d’érything FICO. L’intensité de la fluorescence de la FICO pour un nombre prédéterminé de billes est signalée lorsque l’IF FM lit le premier puits pour vérifier que le panneau de billes sélectionné correspond au profil de la bille dans les puits d’essai.

S’il y a des billes tombant en dehors de leur zone de talon désignée sur l’affichage du protocole, une sélection de profil incorrecte a été effectuée. Les billes qui ont été correctement remises en suspension rempliront les régions spécifiées comme indiqué dans le logiciel du lecteur de dosage. Si les billes sont agrégées, elles rempliront leurs régions à un rythme lent.

Vous pouvez retirer la plaque de test du lecteur et remettre manuellement les puits en suspension pour séparer les billes. Retirez la plaque de test du lecteur et, à l’aide d’un pipeteur multicanaux, tri rate chaque puits trois à quatre fois. Remettez ensuite la plaque de test dans le lecteur et continuez à examiner les résultats.

Signalez les erreurs telles qu’un nombre insuffisant de billes ou une baisse des scores de billes IgG anti-IgG, et répétez le test pour ces échantillons. Après avoir exporté les données vers Excel et calculé l’IMF net, déterminez si l’un des tests de jeu contrôle à l’exclusion du sérum immunitaire de haut niveau. Tout contrôle échoué est inacceptable et le test doit être répété.

Ce tableau présente les données pour les tests de sérum et les contrôles de dosage à partir d’une plaque de test typique. Tous les contrôles IgG ont-ils été réussis. Les résultats des tests pour ce jeu indiquent que de nombreux échantillons de tissus réactifs et de contrôle IgG ont échoué, comme on l’a vu dans les puits orange.

A1C un et F1 indiquent une défaillance réactive tissulaire CT où le score TC est représenté entre parenthèses, Wells B un et E un illustrent les deux types de défaillances du contrôle interne IgG, anticorps de test insuffisants ou réactifs de test, BAG ou SPE respectivement. Les résultats de la plaque de test ne sont interprétés que si le contrôle d’adéquation du système et le contrôle sérique répondent aux critères d’acceptation indiqués ici. Les microsphères recouvertes d’immunoglobuline sérique anti-test spécifique à l’espèce peuvent présenter des scores d’échec en raison de l’ajout d’un échantillon insuffisant trop élevé, d’une dilution d’échantillon, d’une espèce incorrecte ou d’un sérum de test provenant d’un hôte immunodéficient.

Si les résultats du contrôle du test play sont satisfaisants, les scores de test individuels sont classés selon ce qui suit. Après cette procédure, nous devons utiliser des méthodes supplémentaires telles que Eliza, IFA et/ou Western blot pour confirmer les premiers résultats inattendus ou positifs. Il est crucial de vérifier ces résultats avant de prendre toute décision de gestion animale.

Cela peut se faire en utilisant différentes méthodologies sur le même échantillon ou des échantillons supplémentaires de la même colonie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer le fluorodosage multiplexe, l’immunodosage métrique, et d’interpréter les résultats obtenus dans votre établissement. Cela vous permettra de réduire la main-d’œuvre tout en recueillant plus d’informations sur chaque échantillon de test.