Name: Méthodologie dessai fluorométrique multiplexés dosage immunologique et dépannage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Découvrez le dosage immunoassai fluorométrique multiplexé (MFIA) pour la sérosurveillance des animaux de laboratoire. Cette méthode permet de détecter simultanément plusieurs anticorps infectieux tout en réduisant les volumes de sérum et le temps d'analyse.

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La recherche présentée ici a été soutenu par Charles River.

<ol><li>MFIA Rodent Methods Manual [Internet]. , Charles River. Available from:
		
	 <a target="_blank" href=" http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf"> http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf</a> (2011).</li>
<li>Rodent MFIA Validation Summary Report [Internet]. , Charles River. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf">http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf</a> (2007).</li>
<li>Jacobson, R. H., et al. Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobson%2C+RH+%22Manual+of+Standards+for+Diagnostic+Tests+and+Vaccines%22">Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines</a>. , Office International des Epizooties (OIE). France. 8-15 (1996).</li>
<li>Wright, P. F. International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWright%2C+PF+%22Rev.+sci.+tech.+Off.+int.+Epiz%22">Rev. sci. tech. Off. int. Epiz</a>. 17 (2), Office International des Epizooties (OIE). France. 527-533 (1998).</li>
<li>Pepe, M. S. The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction. , Oxford University Press. Oxford, New York. (2003).</li>
<li>Barr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+interpretation+of+diagnostic+tests+for+feline+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Comparison and interpretation of diagnostic tests for feline immunodeficiency virus infection.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 199, 1377-1381 (1991).</li>
</ol>

Tous les auteurs travaillent pour Charles River RADS, un important fournisseur de services animaliers tests sérologiques et des réactifs.

Le processus de test MFIA est très efficace, nécessitant moins de matériel et petit échantillon et des volumes de réactifs que les tests traditionnels singleplex. La fonctionnalité du système multiplex donne à l&#39;utilisateur la possibilité de filtrer simultanément pour plusieurs souches ou sérotypes d&#39;agents communs chez les rongeurs de laboratoire (c.-à-coronavirus, les parvovirus, etc.) Cela nous permet aussi, de concevoir sur mesure des panneaux de perles basée sur la zone d&#39;intérêt (c.-famille de virus spécifique) et est adaptable à d&#39;autres types de dépistage de biomolécules incluant les cytokines et autres bio-marqueurs. En outre, il nous permet d&#39;intégrer plusieurs tests de contrôle interne pour vérifier l&#39;échantillon et de l&#39;adéquation du système et ainsi assurer l&#39;exactitude des résultats. Ceux-ci incluent le contrôle des tissus et IgG anti-immunoglobuline de test espèces sérum (αIg) recouvertes de billes d&#39;évaluer l&#39;aptitude de l&#39;échantillon. Un tissu de contrôle bourrelet détecte la liaison non spécifique des immunoglobulines de sérum et le contrôle αIg bourrelet confirmeque le sérum a été ajouté et contient une concentration suffisante d&#39;immunoglobuline. Une autre perle de contrôle, recouvert d&#39;immunoglobuline sérique espèces, démontre que les réactifs marqués et un lecteur de test fonctionnent correctement. D&#39;autres tests disponibles dans le commerce format multiplex sérologiques (c.-à MicroArrays, ImmunoComb) peuvent ne pas offrir le même niveau de résultat de confirmation. La possibilité de réduire les causes possibles de l&#39;échec d&#39;essai avant de nouveaux tests peuvent aider un enquêteur économiser du temps et des matériaux. Les aspects critiques de la MFIA doit être confirmée avant de répéter un échantillon échoué. Depuis le dosage est effectué à la température ambiante, il convient de vérifier que la température du laboratoire est d&#39;environ 27 ° C ± 2 ° C, des températures plus élevées peut entraîner une baisse de scores attendus pour les contrôles et les échantillons. Laver est peut-être l&#39;étape la plus critique dans l&#39;analyse. Assurer que la plaque d&#39;essai est bien lavé, effacé et remis en suspension peut éliminerla grande majorité des erreurs d&#39;échantillonnage dues à talon faible numération (en raison de perles agrégées) ou l&#39;ajout de réactif insuffisante (perte par effet de mèche sur fond de plaque d&#39;essai du filtre). Nous avons régulièrement compte 25 perles par dosage (agent) et n&#39;ont trouvé aucune différence statistique dans les résultats en comptant plus grand nombre de billes qui aboutira également à un plus long temps de lecture de la plaque. Nous avons effectué des études de validation complets de MFIA sur plusieurs espèces d&#39;animaux de laboratoire couramment utilisés (souris, rat, hamster, cochon Guinée et le lapin) pour démontrer la précision du diagnostic, la reproductibilité et la robustesse de tester un grand nombre de positifs et négatifs connus des échantillons de sérum et comparant leur ELISA, IFI et les résultats MFIA. Les limites de détection (c.-à-immunes critères d&#39;évaluation standards de titrage du sérum) de MFIA étaient comparables, et dans certains cas dépassé, ceux de correspondant ELISA. La spécificité diagnostique, mesurée avec des rongeurs SPF sérums, a dépassé les 99%, le betwee correspondance globalen ELISA et MFIA effectuée sur sérums négatifs connus positive et connue était supérieure à 95%. En résumé, ces résultats ont prouvé que MFIA multiplex est un autre bon test ELISA singleplex, et est adapté à l&#39;usage, c&#39;est à dire prévu dans la surveillance sérologique de routine des colonies d&#39;animaux de laboratoire.

méthodologie d&#39;essai fluorométrique multiplexés dosage immunologique et dépannage

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

Pour garantir la qualité des modèles animaux utilisés en recherche biomédicale, nous avons développé un certain nombre de stratégies de tests de diagnostic et les méthodes permettant de déterminer si les animaux ont été exposés à des agents adventices infectieux (virus, les mycoplasmes et autres micro-organismes exigeants). Infections des animaux immunocompétents sont généralement transitoires, mais les réponses en anticorps sériques à l&#39;infection peuvent souvent être détectés dans les jours ou semaines et persistent pendant toute la vie de l&#39;hôte. La sérologie est la méthode de diagnostic principal par lequel les animaux de laboratoire sont surveillés. Historiquement, le-enzymatique indirecte (ELISA) a été la principale méthode de dépistage pour la surveillance sérologique. Le test ELISA est réalisé comme un singleplex, dans lequel une microbienne réaction antigène-anticorps est mesurée dans chaque puits. Dans le comparateur de MFIA est réalisée comme un essai multiplex. Depuis les microsphères venir dans 100 jeux de couleurs distinctes, pas moins de 100 différents tests peuvent être effectués simultanément dans un seul puits de microplaques. Cette innovation réduit la quantité de sérum, réactifs et consommables nécessaires pour les tests de routine, tout en augmentant la quantité d&#39;information obtenue à partir d&#39;un seul test bien. En outre, nous sommes en mesure d&#39;intégrer de multiples perles de contrôle interne pour vérifier l&#39;échantillon et de l&#39;adéquation du système et ainsi assurer l&#39;exactitude des résultats. Ceux-ci incluent le contrôle des tissus et IgG anti-immunoglobuline de test espèces sérum (αIg) recouvertes de billes d&#39;évaluer l&#39;aptitude de l&#39;échantillon. Comme dans le test ELISA et IFA, le tissu de contrôle détecte la liaison non spécifique des immunoglobulines de sérum. Le contrôle αIg (contrôle sérum) confirme que le sérum a été ajouté et contient une concentration en immunoglobuline IgG suffisante alors que le contrôle de cordon (contrôle de conformité du système), recouvert d&#39;immunoglobuline sérique espèces, démontre que les réactifs marqués et Luminex lecteur fonctionnent correctement.

Grâce à la technologie Luminex Corporation microbille xMAP, nous avons développé le test immunologique multiplexée fluorométrique (MFIA) pour la surveillance de diverses espèces d&#39;animaux de laboratoire. Le MFIA est une micropuce suspension, si l&#39;antigène, le tissu de contrôle ou d&#39;immunoglobulines sont liés de façon covalente à du polystyrène code couleur microsphères. La méthode de test MFIA ainsi que diverses rubriques de dépannage est adressée.

Méthodologie d&#39;essai fluorométrique multiplexés dosage immunologique et dépannage

Afin de garantir la qualité des modèles animaux utilisés en recherche biomédicale, nous avons développé un certain nombre de stratégies et de méthodes de tests diagnostiques pour déterminer si...

L'objectif général de l'expérience suivante est de détecter des anticorps dirigés contre des agents infectieux adventices chez les animaux de laboratoire. Cela est réalisé en incubant le sérum test avec des microsphères revêtues d'antigène. Ensuite, le sérum est incubé avec une immunoglobuline anti-espèce marquée par la biotine, qui détecte tout complexe immunitaire antigène-anticorps.Ensuite, une solution de streptavidine marquée FICO érythro Fluor est ajoutée afin de détecter tout résultat d'immunoglobuline biotinylée. Les résultats obtenus indiquent un statut positif ou négatif en anticorps pour les agents courants chez les rongeurs de laboratoire, selon un score net d'immunodosage par fluorescence multiplexe et des valeurs de fluorescence de l'échantillon. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme ELISA, est que MFIA est un dosage multiplexe. Cela permet à un chercheur d'analyser jusqu'à cent dosages différents lors d'un seul test.Eh bien, cette technique réduit la quantité de sérum et de matériel jetable utilisé dans les méthodes existantes, tout en augmentant la quantité d'informations générées à partir d'un seul test. Nous avons eu pour la première fois l'idée d'utiliser cette méthode lorsque nous testions un grand nombre d'échantillons de sérum pour plusieurs agents et souhaitions réduire la main-d'œuvre ainsi que la durée des tests. La procédure sera démontrée par Donna Cohen, technologue senior de notre laboratoire. Pour commencer, préparez deux tampons nécessaires à la procédure de dosage immuno-enzymatique multiplexe par fluorescence (MFIA).Le premier est un diluant primaire, disponible chez Charles River et contenant des agents bloquants exclusifs destinés à réduire les interactions non spécifiques dans le tampon de lavage pour le test. Préparez une solution de PBS avec 1 % de BSA à pH 7,4 pour éliminer les particules. Filtrez le tampon à l’aide d’un filtre stérile de 0,2 micron monté sur une bouteille, puis transférez-le dans des récipients stériles étiquetés en utilisant le tampon de lavage pour le test.Préparez deux concentrations x d'espèces antis biotinylées, IgG ou BAG, ainsi que de streptavidine et de FICOr tout ou SPE, qui seront utilisées pour marquer les complexes antigène-anticorps formés lors de l'étape d'incubation avec le sérum test afin de préparer des échantillons des matériaux suivants et des articles jetables : micropipettes multicanal et monocanal et leurs embouts, ainsi que des plaques microtitration à 96 puits à faible liaison aux protéines pour la dilution des protéines. Après prélèvement des échantillons sanguins et isolement du sérum, vortexez brièvement le sérum avant de diluer les échantillons dans le diluant primaire dans une plaque microtitration à 96 puits afin de garantir un vidage adéquat et uniforme des puits. Pré-humidifiez chaque puits de la plaque test à 96 puits avec le tampon de lavage du test, puis aspirez lentement la solution tout au long du test.L'aspiration doit prendre de cinq à dix secondes afin de prévenir l'agrégation des billes et leur compactage dans la membrane filtrante, deux phénomènes pouvant ralentir les temps de lecture à la fin du dosage. Vérifiez que l'écoulement du liquide est arrêté en tamponnant la face inférieure de la plaque de test avec des essuie-tout. Il est important de tamponner la plaque de test après chaque étape de lavage afin d'éviter la capillarité hors des puits pendant l'incubation.Pour préparer les billes, commencez par agiter la suspension de billes couplées en stock à l'aide d'un vortex. Ensuite, soumettez-les brièvement à une sonication en bain. Il est essentiel de bien resuspendre les billes afin d'éviter la formation d'agrégats, qui pourrait entraîner des temps de lecture plus longs.Ensuite, prélevez la suspension mère 20 x pour obtenir une solution de billes à deux fois la concentration de travail dans le diluant primaire. Puis, ajoutez 50 microlitres de la suspension de billes à deux fois la concentration dans chaque puits d'analyse de la plaque d'essai préhumidifiée. Prélevez à la pipette 50 microlitres de chaque sérum témoin et de test à deux fois la concentration et ajoutez-les dans la plaque d'essai selon un schéma prédéfini de disposition des puits.Fixer le couvercle sur la plaque. La recouvrir de papier d’aluminium et incuber la plaque de test pendant 60 minutes sur un agitateur orbital à température ambiante afin d’éviter l’évaporation des solutions, laquelle pourrait compromettre la réussite du test. Garder la plaque de test recouverte de son couvercle durant toutes les étapes d’incubation.En outre, l'agitation doit être supérieure à 400, mais inférieure à 700 tr/min afin que les billes restent en suspension et permettent aux anticorps sériques d'accéder à toutes les surfaces des antigènes couplés. Après avoir lavé la plaque par des incubations successives des billes avec le BAG et le SPE, laver à nouveau les échantillons. Ensuite, resuspendre les billes en ajoutant 125 microlitres de tampon de lavage pour le test et agiter pendant deux minutes pour lire la plaque.Placez-le dans le lecteur d'analyse dans les 10 minutes suivant la resuspension des billes ; les billes passent une par une à travers un détecteur où elles sont exposées à deux lasers. Un laser excite les colorants internes qui identifient l'ensemble de couleurs des billes, et l'autre excite le colorant rapporteur FICO érythrine. L'intensité de la fluorescence FICO érythrine pour un nombre prédéterminé de billes est rapportée comme la valeur FM FI. Lisez le premier puits pour vérifier que le panel de billes sélectionné correspond au profil de billes dans les puits de test.Si des billes tombent en dehors de leur région de billes désignée sur l'affichage du protocole, une sélection incorrecte de profil a été effectuée. Les billes correctement resuspendues rempliront leurs régions spécifiées, tel qu'indiqué dans le logiciel du lecteur d'analyse. Si les billes sont agrégées, elles rempliront leurs régions à un rythme lent.Vous pouvez retirer la plaque de test du lecteur et resuspendre manuellement les puits pour séparer les billes. Retirez la plaque de test du lecteur et, à l’aide d’une pipette multicanal, aspirez et expulsez chaque puits trois à quatre fois. Replacez ensuite la plaque de test dans le lecteur et poursuivez l’examen des résultats.Signaler les erreurs telles qu'un nombre insuffisant de billes ou des scores de billes IgG anti IgG faibles, et répéter le dosage pour ces échantillons. Après avoir exporté les données vers Excel et calculé la MFI nette, déterminer si l'un des contrôles du test de dosage est à exclure, à l'exception du sérum immunitaire à concentration élevée. Tout contrôle défaillant est inacceptable et le dosage doit être répété.Ce tableau représente les données relatives au sérum témoin et aux contrôles de dosage provenant d'une plaque de dosage typique. Tous les contrôles IgG ont-ils été validés ? Les résultats de ce dosage indiquent que de nombreux échantillons réactifs aux tissus et des échantillons contrôles IgG ont échoué, comme indiqué par les puits orange.A1C un et F1 indiquent un échec de réactivité du tissu TC, le score TC étant indiqué entre parenthèses ; les puits B un et E un illustrent les deux types d'échecs du contrôle interne IgG, à savoir une quantité insuffisante d'anticorps de test ou de réactifs de test, BAG ou SPE respectivement. Les résultats de la plaque de test ne sont interprétés que si le contrôle de validité du système et le contrôle sérique satisfont aux critères d'acceptation indiqués ici. Des microsphères revêtues d'immunoglobulines anti-sérum de test spécifiques à l'espèce peuvent présenter des scores d'échec en raison d'un ajout d'échantillon insuffisant, d'une dilution d'échantillon trop élevée, d'une espèce incorrecte ou de l'utilisation d'un sérum provenant d'un hôte immunodéficient.Si les résultats du contrôle du test de détection sont satisfaisants, les scores individuels du test sont classés selon ce qui suit. Conformément à cette procédure, nous devrions utiliser des méthodes supplémentaires telles que l'ELISA, l'IFA ou le Western blot pour confirmer les résultats initiaux inattendus ou positifs. Il est essentiel de vérifier ces résultats avant de prendre toute décision concernant la gestion des animaux.Cela peut être réalisé en utilisant différentes méthodologies sur le même échantillon ou sur des échantillons supplémentaires provenant de la même colonie. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer le test immunologique multiplex avec détection fluorométrique et d'interpréter les résultats obtenus dans votre laboratoire. Cela vous permettra de réduire la main-d'œuvre tout en recueillant davantage d'informations à partir de chaque puits d'échantillon testé.

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