Méthodologie d'essai fluorométrique multiplexés dosage immunologique et dépannage

L'objectif général de l'expérience suivante est de détecter des anticorps dirigés contre des agents infectieux adventices chez les animaux de laboratoire. Cela est réalisé en incubant le sérum test avec des microsphères revêtues d'antigène. Ensuite, le sérum est incubé avec une immunoglobuline anti-espèce spécifique marquée à la biotine, qui détecte tout complexe immunitaire antigène-anticorps.

Ensuite, une solution de streptavidine marquée FICO eryn Fluor force est ajoutée afin de détecter toute immunoglobuline biotinylée. Les résultats obtenus indiquent un statut positif ou négatif en anticorps dirigés contre des agents courants chez les rongeurs de laboratoire, selon un score net d'immunodosage par fluorescence multiplexe, ainsi que d'après les valeurs de fluorescence des échantillons. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'ELISA est que le MFIA constitue un dosage multiplexe. Cela permet à un chercheur d'analyser jusqu'à cent dosages différents lors d'un seul test.

Eh bien, cette technique réduit la quantité de sérum et de déchets jetables utilisés dans les méthodes existantes, tout en augmentant la quantité d'informations générées à partir d'un seul test. Nous avons eu pour la première fois l'idée d'utiliser cette méthode lorsque nous testions un grand nombre d'échantillons de sérums pour plusieurs agents et souhaitions réduire la main-d'œuvre ainsi que la durée des tests. La procédure sera démontrée par Donna Cohen, technologue senior de notre laboratoire. Pour commencer, préparez deux tampons nécessaires à la procédure de l'immunodosage multiplexe par fluorescence, ou MFIA.

Le premier est un diluant primaire, disponible chez Charles River et contenant des agents bloquants exclusifs destinés à réduire les interactions non spécifiques dans le tampon de lavage pour le test. Préparez une solution de PBS avec 1 % de BSA à pH 7,4 pour éliminer les particules. Filtrez le tampon à l’aide d’un filtre stérile de 0,2 micron monté sur une bouteille, puis recueillez-le dans des récipients stériles étiquetés en utilisant le tampon de lavage pour le test.

Préparez deux concentrations x d'espèces antis biotinylées, IGG ou BAG, et de streptavidine et de ficolline ou SPE, qui seront utilisées pour marquer les complexes antigène-anticorps formés lors de l'étape d'incubation avec le sérum test afin de préparer des échantillons des matériaux suivants et des dispositifs jetables : micropipettes multicanal et monocanal ainsi que leurs embouts, et des plaques microtitration à 96 puits à faible liaison aux protéines pour la dilution des protéines. Après avoir prélevé les échantillons sanguins et isolé le sérum, vortexez brièvement le sérum avant de diluer les échantillons dans un diluant primaire dans une plaque microtitration à 96 puits afin de garantir une évacuation uniforme et adéquate des puits. Humidifiez préalablement chaque puits de la plaque d'essai à 96 puits avec le tampon de lavage de l'essai, puis aspirez lentement la solution tout au long du test.

L'aspiration doit prendre de cinq à dix secondes afin d'éviter l'agrégation des billes et leur compactage dans la membrane filtrante, deux phénomènes pouvant ralentir les temps de lecture à la fin du dosage. Vérifiez que l'écoulement du liquide est arrêté en tamponnant l'envers de la plaque de test avec des essuie-tout. Il est important de tamponner la plaque de test après chaque étape de lavage afin d'empêcher le remontage capillaire hors des puits pendant l'incubation.

Pour préparer les billes, commencez par vortexer la suspension de billes couplées stock. Ensuite, soniquez-les brièvement dans un bain. Il est crucial de bien resuspendre les billes afin d'éviter la formation d'agrégats, qui peuvent entraîner des temps de lecture plus longs.

Ensuite, prélevez la suspension mère 20 x pour obtenir une solution de billes à deux fois la concentration finale dans le diluant primaire. Puis, ajoutez 50 microlitres de la suspension de billes à deux fois la concentration dans chaque puits d'analyse de la plaque d'essai préhumidifiée. Prélevez à la pipette 50 microlitres de chaque sérum témoin et de test à deux fois la concentration et ajoutez-les dans la plaque d'essai selon un schéma prédéfini de disposition des puits.

Fixer le couvercle sur la plaque. La recouvrir de papier d'aluminium et incuber la plaque de test pendant 60 minutes sur un agitateur orbital à température ambiante afin d'éviter l'évaporation des solutions, ce qui pourrait compromettre la réussite du test. Garder la plaque de test recouverte de son couvercle pendant toutes les étapes d'incubation.

En outre, l'agitation doit être effectuée à une vitesse supérieure à 400, mais inférieure à 700 tr/min afin que les billes restent en suspension et permettent aux anticorps sériques d'accéder à toutes les surfaces des antigènes couplés. Après avoir lavé la plaque lors d'incubations successives des billes avec le BAG et le SPE, laver à nouveau les échantillons. Ensuite, resuspendre les billes en ajoutant 125 microlitres de tampon de lavage pour le test et agiter pendant deux minutes afin de lire la plaque.

Placez-le dans le lecteur de test dans les 10 minutes suivant la resuspension des billes ; les billes passent une à la fois à travers un détecteur où elles sont exposées à deux lasers. Un laser excite les colorants internes qui identifient l'ensemble chromatique des billes, et l'autre excite le colorant rapporteur FICO érythrine. L'intensité de la fluorescence FICO érythrine pour un nombre prédéterminé de billes est indiquée comme mesure FM FI. Lisez le premier puits afin de vérifier que le panel de billes sélectionné correspond au profil des billes dans les puits de test.

Si des billes tombent en dehors de leur région de billes désignée sur l'affichage du protocole, une sélection incorrecte de profil a été effectuée. Les billes correctement resuspendues rempliront leurs régions spécifiées, tel qu'indiqué dans le logiciel du lecteur d'analyse. Si les billes sont agrégées, elles rempliront leurs régions à un rythme lent.

Vous pouvez retirer la plaque de test du lecteur et resuspendre manuellement les puits pour séparer les billes. Retirez la plaque de test du lecteur et, à l’aide d’une pipette multipuits, aspirez et expulsez chaque puits trois à quatre fois. Puis remettez la plaque de test dans le lecteur et continuez à examiner les résultats.

Signaler les erreurs telles qu'un nombre insuffisant de billes ou des scores de billes IgG anti-IgG faibles, et répéter le dosage pour ces échantillons. Après avoir exporté les données vers Excel et calculé la MFI nette, déterminer si l'un des contrôles du test de dosage est défaillant, à l'exception du sérum immunitaire à concentration élevée. Tout contrôle défaillant est inacceptable et le dosage doit être répété.

Ce tableau représente les données relatives au sérum témoin et aux contrôles de dosage provenant d'une plaque de dosage typique. Tous les contrôles IgG ont-ils été validés ? Les résultats de ce dosage indiquent que de nombreux échantillons contrôles réactifs aux tissus et IgG ont échoué, comme le montrent les puits orange.

A1C un et F1 indiquent un échec de réactivité du tissu TC, le score TC étant indiqué entre parenthèses ; les puits B un et E un illustrent les deux types d'échecs du contrôle interne IgG, respectivement un anticorps de test insuffisant ou des réactifs de test insuffisants, BAG ou SPE. Les résultats de la plaque de test ne sont interprétés que si le contrôle de convenance du système et le contrôle sérique satisfont aux critères d'acceptation indiqués ici. Des microsphères revêtues d'immunoglobuline anti-sérum de test spécifiques à l'espèce peuvent présenter des scores d'échec dus à l'ajout d'un échantillon insuffisant, une dilution trop élevée de l'échantillon, une espèce incorrecte, ou à l'utilisation d'un sérum provenant d'un hôte immunodéficient.

Si les résultats du contrôle du test de mise en jeu sont satisfaisants, les scores individuels du test sont classés selon ce qui suit. Après cette procédure, nous devrions utiliser des méthodes supplémentaires telles que l'ELISA, l'IFA ou le Western blot pour confirmer les résultats initiaux inattendus ou positifs. Il est essentiel de vérifier ces résultats avant de prendre toute décision concernant la gestion des animaux.

Cela peut être réalisé en utilisant différentes méthodologies sur le même échantillon ou sur des échantillons supplémentaires provenant de la même colonie. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser le test immunologique multiplex avec détection fluormétrique et interpréter les résultats obtenus dans votre laboratoire. Cela vous permettra de réduire la main-d'œuvre tout en recueillant davantage d'informations à partir de chaque puits d'échantillon testé.