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Prenez une plaque de dosage contenant un mélange de microsphères de polystyrène magnétiques teintées à l’intérieur avec des fluorophores spectralement différents.
Chaque ensemble de microsphères est couplé de manière covalente à des anticorps de capture spécifiques aux bactéries pathogènes distinctes.
Ajouter un mélange de bactéries pathogènes tué par la chaleur. Couver.
Les anticorps de capture se lient aux antigènes bactériens cibles, formant des complexes microsphères-bactéries.
Utilisez un séparateur magnétique pour décanter les complexes. Jetez les bactéries non liées et lavez avec un tampon.
Ajoutez des anticorps de détection tampons et biotinylés, qui se lient spécifiquement aux bactéries liées aux microsphères.
Séparez magnétiquement les complexes et lavez-les avec un tampon.
Remettre les complexes en suspension dans le tampon. Molécules rapporteures de pipette comprenant de la streptavidine couplée à des fluorophores, qui se lient aux anticorps de détection biotinylés.
Séparez et lavez magnétiquement les complexes. Suspendre à nouveau dans la mémoire tampon.
Au cours de l’analyse basée sur l’écoulement, le premier laser excite les fluorophores internes de la microsphère, générant des signatures spectrales uniques et identifiant des ensembles de microsphères uniques.
Le deuxième laser excite les rapporteurs de fluorophores liés aux bactéries sur les microsphères, quantifiant les bactéries sur divers ensembles de microsphères, permettant une détection bactérienne quantitative multiplexée.
Pour la capture d’échantillons, commencez par ajouter cinquante microlitres de microsphères, ou billes conjuguées pour capturer les anticorps dans une plaque de 96 puits. Ensuite, ajoutez cinquante microlitres de bactéries pathogènes suivis de cinquante microlitres de PBS-TBN dans des puits de fond.
Couvrez la plaque avec un sceau de plaque d’aluminium et incubez sur un agitateur à plaques à huit cents tr/min pendant une heure.
Ensuite, placez la plaque sur le séparateur magnétique pendant 1 minute pour séparer les billes. Évacuez la solution restante, tout en maintenant la plaque sur le séparateur de plaques magnétiques. Ensuite, tapotez pour sécher sur des serviettes en papier de laboratoire trois à quatre fois. Lavez soigneusement les puits avec PBS-TBN deux fois.
Pour la détection de l’échantillon, ajoutez cinquante microlitres de tampon de dosage suivis de cinquante microlitres d’anticorps de détection biotinylés à une concentration de quatre microgrammes par millilitre dans les puits.
Incuber la plaque dans l’obscurité pendant une heure pour permettre une interaction efficace entre les bactéries et les anticorps de détection. Ensuite, séparez les billes à l’aide du séparateur magnétique et lavez-les avec du PBS-TBN, comme démontré précédemment.
Remettez les billes en suspension dans cinquante microlitres de tampon de dosage et ajoutez cinquante microlitres de streptavidine-R-phycoérythrine ou SAPE, une molécule rapporteure fluorescente. Couvrez la plaque avec un sceau de plaque d’aluminium et incubez sur le shaker pendant 30 minutes.
Une fois les puits lavés, remettre les billes en suspension dans 100 microlitres de PBS-TBN et charger la plaque sur l’analyseur basé sur le flux.
Enregistrez les relevés à l’aide d’un logiciel approprié. Les valeurs médianes nettes d’intensité de fluorescence pour chaque organisme peuvent être évaluées à l’aide d’une courbe standard pour déterminer la charge bactérienne présente dans l’échantillon.