High Throughput unicellulaire et multiples cellules de micro-encapsulation

Les applications utilisant des cellules encapsulées dans de petites gouttes de la taille d’un picolitre ont souvent été limitées par l’incapacité de contrôler le nombre de cellules par goutte. Ce protocole démontre une méthode de contrôle de l’encapsulation des cellules en combinant deux phénomènes microfluidiques distincts, l’ordonnancement dynamique des cellules et la génération de gouttes au niveau d’une micro-buse à focalisation d’écoulement. Dans un canal en amont, un débit suffisamment élevé de solution aqueuse avec des cellules ou des particules en suspension est prévu pour provoquer la formation de trains avec un espacement égal dans la direction de l’écoulement en aval.

Une buse de génération de gouttes à focalisation d’écoulement est utilisée pour former des gouttes aqueuses à des taux de kilohertz dans un fluide porteur d’huile admissible stabilisé par tensioactif. Les trains de particules cellulaires ordonnés sont ensuite combinés à la génération de gouttes en ajustant les débits aqueux et huileux pour fournir des taux de génération de gouttes synchronisés avec l’arrivée de cellules ou de particules ordonnées longitudinalement au niveau de la buse de génération de gouttes, tandis que les particules sont utilisées comme substituts cellulaires. Pour démontrer ce protocole, les débits doivent être suffisamment faibles pour limiter le fluide.

De simples contraintes sur les cellules biologiques, le chevauchement de l’ordre des cellules, la génération de gouttes et la viabilité cellulaire. Les contraintes de débit aqueux offrent un régime opérationnel idéal pour l’encapsulation contrôlée de cellules simples et multiples. L’analyse des données de vidéomicroscopie montre que l’efficacité de l’encapsulation à une ou deux cellules ou particules surpasse l’efficacité de l’encapsulation aléatoire et réduit considérablement le nombre de gouttes, qui ne contiennent pas le nombre souhaité de cellules ou de particules.

Le confinement des cellules et des gouttes limite la dilution des sécrétions cellulaires, met en évidence l’hétérogénéité cellulaire et contrôle également les signaux intercellulaires par rapport à une suspension en vrac. Des moyens efficaces d’encapsuler ces cellules dans des gouttes constituent un outil précieux pour les chercheurs en biologie pour commencer cette procédure. Concevez un motif de microcanaux comme illustré dans cette figure dans le logiciel AutoCAD.

La section de canal long représente le canal d’ordre de l’écoulement aqueux d’une largeur de 27 microns. Le schéma de la buse agrandi montre des largeurs de canal égales de 27 microns pour le canal de commande aqueux et le canal d’huile, suivis d’une contraction de la buse de 22 microns et d’une expansion soudaine vers un canal plus large de 61 microns. La hauteur de l’appareil est de 52 microns.

Les entrées aqueuses et d’huile ont de grands filtres à débris avec des espaces de l’ordre de la largeur du canal, comme l’illustre ce schéma agrandi de l’entrée d’huile. Montré. Voici une image réelle du canal de commande et de la buse injectée de colorant. Faites appel à un fabricant tiers pour imprimer un masque de transparence haute résolution sur un film Mylar ou du quartz où les canaux sont transparents sur un fond sombre.

Par la suite, créez un maître photosensible en silicium et SU eight pour le moulage de répliques. Collez le moule maître au fond d’une boîte de Pétri pour le moulage de répliques PDMS. Une fois que le moulage de la réplique est terminé et que le contour de l’appareil a été découpé, utilisez un poinçon de biopsie de 0,75 millimètre de diamètre extérieur pour perforer les ports fluidiques dans les trois régions rondes illustrées dans cette figure un scotch cher du côté du motif du PDMS et décollez pour enlever toute poussière après la liaison plasma.

Le PDMS à une lame de microscope en verre propre. Placez l’ensemble de l’appareil dans un four et réchauffez progressivement le four jusqu’à 120 degrés Celsius. Laissez l’appareil dans le four à 120 degrés Celsius pendant la nuit pour terminer le collage et ramener le PDMS à son état hydrophobe d’origine.

Une autre méthode pour rendre la surface vitrée du canal hydrophobe consiste à injecter un revêtement tel que l’aquae dans les orifices fluidiques, puis à le purger à l’air. À l’aide d’une seringue d’un millilitre et d’une aiguille de seringue, aspirez plusieurs centaines de microlitres d’air, suivis d’une petite quantité d’aquil suffisante pour remplir uniquement l’embout métallique de la seringue, mais injectez fermement l’eau suivie de l’air de purge dans les orifices fluidiques. Sans casser le PDMS pour lier le verre de manière agressive.

Répétez la purge d’air sur tous les orifices d’entrée et de sortie tout en essuyant tout excès d’eau afin d’éviter tout dépôt qui pourrait obstruer les canaux lors du séchage. Le contrôle de la concentration cellulaire est essentiel pour obtenir le bon nombre de cellules pour le bon nombre de gouttes. Cela comporte deux éléments difficiles.

La première consiste à estimer la concentration appropriée à l’avance, et la seconde à maintenir cette concentration pendant l’expérience. Pour le dispositif particulier utilisé dans cette étude, des cellules ou des particules de huit à 15 microns doivent être correctement ordonnées pour une encapsulation contrôlée. Dans cette démonstration, des microsphères de polys de 9,9 microns seront utilisées comme substituts cellulaires pour préparer la concentration de suspension de particules aqueuses afin d’obtenir une encapsulation d’audit idéale, en commençant par une concentration de stock de microsphères de 1 % de solides en poids en utilisant les données précédentes pour une commande complète. À titre indicatif, augmentez la concentration à 1,5 % de solides en centrifusionnant doucement un millilitre de l’échantillon de stock, en éliminant 250 microlitres de liquide de supinate et en suspendant les particules par mélange vortex ou mélange plus doux.

Lors de l’utilisation de cellules, les cellules et les particules de polystyrène ont une densité supérieure à un, bien que cela ne soit pas montré dans cette vidéo. Pour les expériences à long terme d’une durée de plusieurs minutes à quelques heures, la solution peut être assortie d’une flottabilité assortie à l’ajout d’un soluté tel que le chlorure de calcium pour les particules ou l’opti prep pour les cellules. Une fois que la suspension de la cellule ou des particules est prête, préparez un échantillon de 10 millilitres de la phase huileuse fluorocarbonée continue dans un vortex de tube de centrifugation de 15 millilitres.

Mélangez le tensioactif et l’huile fluorocarbonée à environ 2,5 % en poids. Ici, nous obtenons un mélange de 2,4 poids en poids, ce qui est acceptable pour mettre en place l’expérience de micro-encapsulation. Tout d’abord, allumez l’alimentation du microscope optique inversé et de la caméra haute vitesse.

Concentrez-vous sur la couche de microcanaux et inspectez les canaux pour détecter les obstructions et les débris qui pourraient se déloger. Choisissez un canal exempt de gros débris ou de bouchons évidents. Coupez trois longueurs de tube en PVC tigon translucide pour l’entrée aqueuse de l’huile, l’entrée et la sortie de l’émulsion afin de minimiser le volume mort.

Coupez juste assez de tube pour aller des pousse-seringues au microscope. Pour faciliter l’insertion dans les orifices fluidiques, utilisez une pince à épiler pour enfoncer les extrémités du tube dans les orifices fluidiques. Ensuite, enfoncez une aiguille de seringue en acier inoxydable à embout émoussé de calibre 30 dans l’extrémité libre du tube d’entrée aqueux.

Répétez l’opération pour le tube d’entrée d’huile. Déplacez l’appareil et fixez le tube à la platine du microscope en utilisant un alignement d’objectif 20 fois et faites la mise au point sur la buse de l’appareil. Ajustez manuellement le microscope pour l’éclairage Kohler afin de fournir un éclairage optimal dans le plan focal.

À l’aide du logiciel de l’appareil photo haute vitesse, recadrez le champ de vision autour de la buse pour permettre des fréquences d’images plus élevées, puis réglez la fréquence d’images, le temps d’exposition et d’autres paramètres de l’appareil photo selon les besoins pour un enregistrement optimal. Ensuite, remplissez une seringue d’un millilitre avec la solution de phase aqueuse bien mélangée préalablement préparée. Remplissez une seringue de trois millilitres avec la solution de phase huileuse.

Inclinez l’une des seringues remplies verticalement et effleurez-la pour déplacer les bulles d’air vers la sortie de la seringue. Appuyez lentement sur le piston suffisamment longtemps pour pousser l’air vers l’extrémité de la seringue qui maintient la seringue verticalement. Connectez la seringue à l’aiguille de seringue correspondante déjà fixée à l’appareil.

Appuyez sur le piston pour forcer l’air à travers l’aiguille de la seringue, volume mort jusqu’à ce que le liquide soit poussé à travers le tube presque jusqu’à l’appareil, montez solidement la seringue sur une pompe à seringue et engagez le bloc du piston. Répétez les connexions pour la deuxième seringue et montez-la sur une deuxième pompe à seringue, mettez sous tension chaque pousse-seringue et programmez chaque pompe. À l’aide des protocoles du fabricant, réglez les débits initiaux à 50 microlitres par minute pour la phase huileuse et à cinq microlitres par minute.

Pour le démarrage de la phase aqueuse, les pompes attendent que chaque fluide pénètre dans l’appareil et remplissent les canaux en expulsant l’air mort restant. Cela peut prendre plusieurs minutes en utilisant les débits initiaux. Observez la formation de gouttes au niveau de la buse.

Augmentez lentement le débit aqueux pour observer l’ordre des particules dans le long canal de solution aqueuse. Lorsque le débit augmente, n’augmentez pas le débit au point où le jet du flux de fluide aqueux est déclenché au niveau de la buse, comme le montre cet exemple, en utilisant une note de buse de génération de goutte différente, le débit instable et la chute incohérente sont ici. Si la concentration de particules est trop faible pour fournir des trains alternatifs avec relativement peu de particules manquantes et que la flottabilité de l’échantillon n’était pas adaptée, inclinez physiquement le pousse-seringue vers la sortie de la seringue pour assurer une décantation progressive des particules vers les sorties de la seringue.

Une fois que l’ordre adéquat a été effectué, ajustez le débit d’huile pour régler la fréquence de génération et la taille des gouttes. Ajustez de manière itérative les deux débits pour obtenir les taux d’encapsulation et les volumes de chute souhaités. Une fois que l’encapsulation ordonnée stable est confirmée, déplacez le tube de sortie du réservoir de déchets dans un réservoir de collecte pour une utilisation future.

L’encapsulation de particules ou de cellules simples et doubles peut être réalisée à haut rendement. L’utilisation de ce protocole illustré ici est un résultat représentatif de l’encapsulation d’une seule particule avec un débit d’huile de 60 microlitres par minute et un débit aqueux de neuf microlitres par minute. Lambda, le nombre moyen de particules pour la goutte est de 0,95.

L’espacement des particules dans le sens de l’écoulement est d’environ 17 à 18 microns pour des particules alternées entièrement ordonnées. Le taux de génération de gouttes dans cet exemple est de 6,1 kilohertz avec une taille moyenne de goutte de 24,4 picolitres. L’histogramme compare l’efficacité de l’encapsulation des particules de l’ordre de l’encapsulation d’une seule particule avec plus.

D’après les statistiques, l’encapsulation aléatoire pour un échantillon de 517 gouttes, la fraction moyenne de gouttes contenant une particule est de 79,5 % par rapport à une fraction d’encapsulation aléatoire prédite de 36,7 %. La fraction de particules qui se retrouve dans les gouttes correctement encapsulées a été observée à 83,7 % pour une taille d’échantillon de 491 particules, alors que la fraction d’encapsulation aléatoire était de 37,3 %, l’encapsulation double est obtenue simplement en réduisant le débit d’huile à 30 microlitres par minute tout en maintenant le débit aqueux à neuf microlitres par minute. Ici, lambda, le nombre moyen de particules par goutte est de 1,8. Similaire à l’encapsulation de particules uniques.

L’espacement des particules dans le sens de l’écoulement est d’environ 17 à 18 microns pour des particules alternées entièrement ordonnées. Les plus grosses gouttes ont une taille moyenne de 39,8 picolitres et se sont formées à un taux de 3,8 kilohertz par rapport à l’encapsulation aléatoire. Pour une taille d’échantillon de 383 gouttes, la fraction moyenne de gouttes d’encapsulation ordonnée contenant deux particules est de 71,5 %, par opposition à une fraction d’encapsulation aléatoire prédite de 26,8 %. La fraction de particules qui a eu tendance à être dans les gouttes correctement encapsulées a été observée à 79,5 % pour une taille d’échantillon de 689 particules, tandis que la fraction d’encapsulation aléatoire était de 33,4 %.

Ensemble, ces résultats montrent que l’efficacité de l’encapsulation de particules simples et doubles surpasse celle de l’encapsulation aléatoire de plus d’un facteur deux et réduit considérablement le nombre de gouttes, qui ne contiennent pas le nombre souhaité de cellules ou de particules. L’importance de concentrations appropriées de particules ou de cellules pour une efficacité d’encapsulation élevée est illustrée dans cette série expérimentale. Bien que les débits d’huile et d’eau soient les mêmes que dans le cycle d’encapsulation à double particule montré précédemment, le nombre moyen de cellules par goutte lambda est réduit à 1,57.

Par conséquent, l’ordre complet ne se produit pas, et donc des trous dans les trains apparaissent, laissant les gouttes de soleil avec moins de particules que prévu. Cet histogramme montre la diminution de l’efficacité de l’encapsulation à deux particules en raison de la valeur plus faible de Lambda. Pour un échantillon de 324 gouttes, la fraction moyenne de gouttes contenant deux particules était de 55,9 %, avec presque autant de gouttes de particules simples que de gouttes de particules doubles.

Cela indique que Lambda doit être égal ou proche du nombre de cellules souhaité par goutte pour maximiser les particules ou les cellules correctement encapsulées avec la valeur exacte de lambda choisie, selon qu’il est tolérable de moins de cellules ou plus de cellules par goutte. Dans cette démonstration, nous exploitons les décalages de flottabilité pour permettre un contrôle en temps réel de la concentration pendant l’expérience. Cependant, pour des expériences à plus long terme, il peut être conseillé d’adapter la flottabilité pour obtenir des résultats plus cohérents après l’encapsulation des cellules dans des gouttes aqueuses.

Des expériences dépendantes du temps peuvent être réalisées dans un tube à centrifuger ou sous un microscope en réinjectant les gouttes dans des réseaux microfluidiques.