Technologie de tri de cellules tumorales circulantes à haut débit et de séquençage de cellules uniques basée sur la microfluidique

Nous nous concentrons sur le développement de méthodes d’isolement et d’analyse CTC haute performance pour faire progresser l’oncologie de précision par biopsie liquide. Les plateformes d’isolation CTC commerciales actuelles ont un faible débit et une faible efficacité. Ils sont également incompatibles avec les plateformes d’analyse en aval, ce qui limite la récupération d’informations biologiques.

Cette étude utilise une plateforme d’isolation microfluidique CTC pour améliorer considérablement les taux de détection. Nous appliquons également une puce de séquençage à cellule unique rare pour une analyse plus approfondie par biopsie liquide. Pour commencer, une pipette de 25 microlitres de streptavidine lavée et resuspendue a modifié les billes magnétiques en un tube contenant un microgramme d’anticorps EpCAM biotinylé.

Incubez le mélange à température ambiante en le faisant tourner à 20 tours par minute pendant 40 minutes pour préparer les billes immunomagnétiques. À l’aide d’un support magnétique, séparez les perles du surnageant. Après avoir retiré le surnageant, resuspendez les billes dans 25 microlitres de tampon d’isolation.

Pipetez 20 microlitres de suspension à billes magnétiques en une à deux secondes, afin d’éviter l’introduction de bulles d’air. Placez immédiatement la puce verticalement sur un aimant et laissez les billes se déposer pendant cinq minutes sans être perturbées. Prélever quatre millilitres de l’échantillon de sang dans une seringue, afin d’éliminer les bulles d’air.

Scellez l’entrée et la sortie de la puce avec du liquide pour éliminer les bulles d’air, puis insérez les tubes d’entrée et de sortie de l’échantillon dans la puce. À l’aide d’une pompe à seringue, injectez l’échantillon à un débit de 1,5 millilitre par heure. Après le chargement de l’échantillon, injectez 60 microlitres de DPBS dans la puce HB à un débit de 0,2 millilitres par heure pour éliminer les cellules non liées.

Retirez l’aimant et injectez manuellement 1,5 millilitre de 5 % BSA pour laver la puce et libérer les cellules tumorales capturées. Préparez une solution à 10 % de MPTS dans de l’éthanol. Introduisez immédiatement 20 microlitres de la solution dans la puce HB et incubez à température ambiante pendant une heure.

Rincez la puce de HB une fois avec de l’éthanol anhydre, puis séchez-la à 100 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, préparez la solution GMBS dans l’éthanol à une concentration de 0,5 milligramme par millilitre. Après avoir refroidi la puce à 37 degrés Celsius, introduisez la solution GMBS et incubez.

Rincez le chip HB deux fois avec de l’eau distillée double, puis deux rinçages avec du DPBS. Ajoutez immédiatement 15 microgrammes par millilitre de streptavidine dans la puce HB et faites éclore à température ambiante pendant une heure ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, rincez la puce de HB deux fois avec du sérum physiologique DPBS.

Préparez maintenant le tampon d’anticorps CD45 en ajoutant 0,2 % de BSA et 20 microgrammes par millilitre d’anticorps biotinylé CD45 à DPBS, puis ajustez jusqu’au volume final. Injecter 20 microlitres de tampon d’anticorps CD45 dans la puce HB pour une sélection négative des globules blancs. Après une incubation d’une heure à température ambiante, rincez la puce avec du DPBS.

Ajoutez une solution de blocage contenant 3 % BSA et 0,05 % Tween 20 dans la puce HB. Aspirez l’échantillon préparé dans une seringue, en veillant à ne pas avoir de bulles d’air. Ensuite, scellez l’entrée et la sortie de la puce avec du liquide et connectez les tubes d’entrée et de sortie à la puce.

À l’aide d’une pompe à seringue, injectez l’échantillon à un débit de 0,6 millilitre par heure. Collectez les cellules tumorales purifiées à la sortie de la puce pour le comptage et le séquençage des cellules uniques. Pipette 200 microlitres de solution à 0,5 % F-68 préparés en DPBS dans l’entrée de puce.

Effectuez la sonication au bain-marie tout en tenant la puce. Lorsque les bulles sont visibles dans la région microporeuse, la sonication continue pendant 30 secondes pour retirer les bulles des puits doubles. Ensuite, injectez 200 microlitres de suspension de cellules tumorales dans la puce contenant 60 000 puits doubles.

Faites doucement une pipette sur la suspension de la cellule dans la puce deux fois. Ensuite, reposez-le à nouveau sur un shaker décolorant pendant cinq minutes pour resuspendre les cellules non capturées et les laisser se déposer à nouveau. Ajoutez maintenant 200 microlitres de DPBS et une solution à 0,5 % F-68 par l’entrée et aspirez par la sortie.

Après avoir resuspendu la suspension à billes codées à barres, injectez immédiatement 200 microlitres de suspension dans l’entrée de puce et secouez à 10 tours par minute pendant 20 secondes. Faites doucement une pipette à la suspension de billes deux fois avant de la remettre sur le shaker. Maintenant, retirez la suspension à billes codées à barres de la sortie, puis pipetez 200 microlitres de 20X Tris-EDTA et 50 millimolaires de dithiothréitol.

Retirez le liquide de la sortie. Pour la lyse cellulaire et la capture de l’ARNm, ajoutez lentement 200 microlitres de tampon de lyse cellulaire dans l’entrée de puce. Ajoutez immédiatement 200 microlitres d’huile minérale pour sceller les puits doubles.

Éliminez la solution qui s’écoule de la sortie des copeaux vers le réservoir de déchets. Ensuite, placez la puce à l’horizontale et laissez-la reposer à température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez lentement 200 microlitres de solution 6X de citrate de sodium salé dans l’entrée.

Retirez le liquide résiduel et aspirez la solution restante à la sortie de la puce. Ajoute lentement 200 microlitres de citrate de sodium salé 6X pour remplir le chip. Tenez un aimant près de la surface de la puce et déplacez-le lentement de l’entrée à la sortie pour collecter des billes codées à barres.

Aspirez rapidement la solution et perlez dans un tube centrifugeuse contenant 6 fois du citrate de sodium salin. Lavez les billes codées trois fois avec 200 microlitres de citrate de sodium salubre 6X, suivi d’une fois avec un tampon de transcription inverse. Une distribution uniforme des billes immunomagnétiques a été observée sous un champ magnétique, tandis que des billes résiduelles minimales après retrait magnétique ont confirmé une libération réussie.

La puce d’isolation CTC capturait efficacement des cellules tumorales à partir d’échantillons de 1 millilitre et de 10 millilitres. L’ajout de la puce de purification a encore augmenté la pureté des cellules tumorales. Dans les échantillons de sang périphérique avec un minimum de cellules LNCaP, le système de tri CTC maintenait une grande efficacité et pureté de capture.

La puce à code-barres à cellule unique a atteint un ratio d’occupation des billes codées à 85,6 % et 95,7 %, ce qui a donné un taux d’appariement de 81,9 %. L’augmentation du nombre de cellules chargées a amélioré le ratio d’occupation des micropuits sans réduire l’efficacité de la capture. L’isolation intégrée CTC et le séquençage à cellule unique ont produit des cellules tumorales hautement pures et ont conservé avec précision les ratios originaux des cellules tumorales. L’analyse TSNE a séparé distinctement les cellules PC3, LNCaP et Jurkat en trois groupes, chacun caractérisé par une expression unique de marqueurs.

Le groupe cellulaire de Jurkat a été identifié par une forte expression de TRBC1, IGLL1, CD1E et CD3D, confirmée par un enrichissement des voies pour l’activation des lymphocytes T. Les clusters PC3 et LNCaP ont été distingués par des gènes exprimés différenciellement, avec PC3 montrant une forte expression microséminoprotéique et LNCaP exprimant NEDD4.