Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

L'objectif général de cette méthode est d'utiliser des colorants de traçage cellulaire pour quantifier directement l'ampleur de la division cellulaire pour différents sous-ensembles de cellules immunitaires au sein de populations complexes. Cela est réalisé en marquant d'abord la population parente de cellules avec un colorant fluorescent connu pour établir une liaison stable avec les protéines cellulaires ou pour s'intercaler de manière non covalente dans les membranes cellulaires, permettant ainsi de suivre les cellules marquées au colorant qui répondent à une stimulation. Le comptage, la coloration avec des anticorps fluorescents et l'analyse par cytométrie en flux multiparamétrique permettent de détecter des réponses différenciées parmi les types de cellules immunitaires d'intérêt stimulées. Toutefois, des témoins non marqués au colorant de traçage sont utilisés pour établir l'intensité de fluorescence la plus faible des cellules filles pouvant être distinguée de l'autofluorescence. Des témoins marqués au colorant de traçage mais non stimulés sont ensuite utilisés pour déterminer l'intensité de fluorescence à laquelle les cellules non divisées seront détectées. La stimulation entraîne généralement une large gamme d'intensités, car les cellules qui prolifèrent en réponse deviennent progressivement plus faibles en intensité, contrairement aux cellules non répondeuses.

En fin de compte, l'utilisation d'un logiciel de modélisation des pics pour estimer la fréquence relative des cellules appartenant à différentes générations permet une comparaison quantitative des réponses prolifératives entre différentes populations ou stimuli, à l'aide de paramètres tels que l'indice de prolifération ou la fréquence des précurseurs. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'incorporation de thymidine tritiée ou l'expression de KI 67, réside dans le fait que la dilution du DI fournit une mesure directe de la division cellulaire, qui peut être combinée à d'autres analyses cytométriques en flux, telles que l'immunophénotypage et la production de cytokines. La démonstration visuelle de la méthode de marquage par colorant membranaire est utile, car la prise en charge du colorant par les cellules est extrêmement rapide.

Par conséquent, une bonne technique est essentielle pour obtenir une coloration intense et homogène. Après l'isolement des cellules mononucléées du sang périphérique humain, centrifuger pendant cinq minutes à 300 ×g et à température ambiante afin de minimiser la contamination par les plaquettes. Ensuite, resuspendre le culot à une concentration de 10⁷ cellules par millilitre dans du HBSS contenant 1 % de BSA, puis placer sur de la glace.

Retirez et mettez de côté 500 microlitres d'Eloqua, puis transférez un autre aliquot de 500 microlitres de cellules dans un tube conique en polypropylène de 12 sur 75 millimètres. Ajoutez 3,5 millilitres de HBSS et centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 400 × g et à température ambiante. Pendant le lavage, ajoutez 0,5 millilitre du véhicule de marquage diluant C provenant du kit PKH26 GL dans un autre tube conique en polypropylène de 12 sur 75 millimètres. Aspirez soigneusement le surnageant en laissant moins de 15 à 25 microlitres de liquide résiduel, en prenant soin de ne pas retirer de cellules. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre du véhicule de marquage diluant C au culot cellulaire et aspirez et redistribuez la solution plusieurs fois afin d'obtenir une suspension monocellulaire.

Préparez maintenant la solution mère 2 XD en ajoutant deux microlitres de PKH 26 dans le tube contenant le diluant C. Pipetez immédiatement la suspension cellulaire dans la solution fraîchement préparée de colorant 2 X PKH 26, puis aspirez et redistribuez simultanément le mélange plusieurs fois afin de disperser uniformément les cellules dans le colorant. Après une minute, ajoutez un millilitre de sérum inactivé par la chaleur pour arrêter l'incorporation du colorant dans les membranes cellulaires. Après centrifugation, aspirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot.

Ensuite, redisperser le culot dans quatre millilitres de milieu complet contenant 10 % de sérum inactivé par la chaleur, puis transférer la suspension cellulaire dans un nouveau tube en polypropylène. Laver les cellules deux fois dans du HBSS additionné de 1 % de BSA ; les cellules correctement marquées présenteront une teinte rose nette dans le culot. Après avoir resuspendu le culot cellulaire dans un millilitre de HBSS contenant 1 % de BSA, dénombrer les cellules, puis ajuster le volume afin d'obtenir une concentration finale de 10⁷ cellules par millilitre. Après coloration des cellules selon le protocole de cytométrie en flux indiqué dans le tableau, utiliser les cinq premiers tubes pour régler les paramètres de diffusion avant et de diffusion latérale ainsi que les signaux dans les quatre détecteurs de fluorescence.

En particulier pour le détecteur utilisé afin de surveiller la fluorescence du PKH 26 dans le tube deux. Vérifiez que toutes les cellules marquées au PKH 26 apparaissent à l'échelle sous forme d'un pic unique et symétrique dans la troisième à quatrième décade, avec peu ou pas de cellules dans le dernier canal. Ensuite, utilisez le logiciel de compensation de couleur et les fichiers en mode liste collectés pour les tubes un à cinq afin d'établir une matrice de recouvrement de couleur pour chaque fluorophore dans les détecteurs utilisés pour surveiller les trois autres fluorochromes.

Appliquez ensuite cette matrice au fichier en mode liste pour l'échantillon six. Vérifiez ainsi que la présence du marquage PKH26 n'altère pas la capacité à détecter les cellules positives pour sept A a D. Appliquez maintenant cette matrice de recouvrement chromatique nouvellement établie au fichier en mode liste pour le tube sept.

Identifier les populations CD3 positif CD4 négatif et CD3 positif CD4 positif sur un graphique FE versus PC. Confirmer que la présence d'anti-CD3, FE et anti-CD4 A PC n'altère pas la capacité à détecter les cellules positives pour 7AAD. Enfin, appliquer la matrice de recouvrement de couleur du tube 7 au fichier en mode liste du tube 8.

Ouvrez maintenant un programme contenant un module d'analyse de prolifération. Chargez le fichier marqué au PKH 26 stimulé provenant du jeu de données à analyser. Ensuite, sélectionnez les paramètres d'analyse, dans ce cas, le PKH 26 étant sélectionné sur les lymphocytes viables PKH 26 positifs, négatifs pour le 7-AAD et positifs pour le CD3, ainsi que la diffusion avant versus la diffusion latérale afin d'exclure les petits débris et les agrégats de grande taille.

Lors de la définition de ces régions, veillez à inclure la zone présentant une forte diffusion avant, où l'on trouve généralement les blastes. Ensuite, ouvrez l'assistant de prolifération. Cliquez sur l'onglet démarrer pour ouvrir le fichier de données, puis chargez le témoin positif non stimulé au PKH 26.

Définissez l'emplacement du pic parental correspondant aux cellules non divisées. Analysez le fichier en notant les valeurs de position et de largeur du pic parental. Si une largeur de pic fixe est souhaitée, verrouillez l'écart type, chargez le contrôle négatif P KH 26 et ajustez le nombre de générations en définissant le canal du pic pour la génération des cellules filles dimus au-dessus des cellules négatives au PKH 26.

Ceci définit le nombre de générations filles. Le modèle peut s'ajuster précisément une fois terminé. Rechargez le fichier positif PKH 26 stimulé.

Si des pics générationnels distincts sont visibles, choisissez le paramètre flottant dans l'option de modèle. Si les décadés logarithmiques ne sont pas exactement de 4,0, ajustez l'espacement générationnel comme indiqué dans l'article. Analysez maintenant l'échantillon stimulé et vérifiez que la région correspondant à la position du pic parental reste inchangée.

Enfin, sélectionnez analyser pour chaque fichier expérimental du jeu de données à appliquer. Appliquez le modèle qui vient d'être créé et enregistrez les métriques de prolifération souhaitées résultant de l'ajustement optimal pour chaque fichier expérimental du jeu de données. Cette première série de données illustre l'effet de la technique de mélange sur les distributions de fluorescence du PKH26.

Lorsqu'elles sont cultivées, les cellules myéloïdes U 9 37 ont été marquées avec le colorant de traçage cellulaire en utilisant la méthode décrite ci-dessus ; cet histogramme montre les données du témoin non marqué. Les paramètres du cytomètre ont été ajustés de manière à placer l'autofluorescence de ces cellules dans la première décade, aucune ou très peu de cellules s'accumulant dans le premier canal. Ce second histogramme illustre une bonne coloration par le PKH 26.

Le mélange rapide de deux x cellules avec deux x colorant a donné une distribution de fluorescence brillante, homogène et symétrique, mais sans aucune cellule hors échelle aux réglages instrumentaux utilisés pour l'histogramme précédent. Lorsque deux x cellules ont été ajoutées à deux x colorant sans mélange immédiat, une distribution de fluorescence plus hétérogène a été obtenue. Cette petite sous-population de cellules faiblement marquées serait interprétée de manière erronée comme des cellules filles si elle était présente à un moment ultérieur dans l'histogramme final de cette expérience. Un mauvais mélange s'est également produit lorsqu'on a ajouté accidentellement trois microlitres de solution mère concentrée de colorant éthanol directement à 0,5 millilitre de suspension de deux x cellules, produisant une distribution d'intensité de fluorescence extrêmement faible et asymétrique vers la droite.

Ici, des résultats typiques issus d'une expérience de prolifération au cours de laquelle des cellules mononucléées du sang périphérique humain marquées au PKH 20 ont été cultivées avec ou sans agents stimulateurs sont présentés. Les réactifs anti-CD3 et IL-2 ont été utilisés. Après 96 heures de culture, les cellules ont été récoltées et contre-marquées avec l'anti-CD3, l'anti-CD19 APC et le 7-AAD.

Deux stratégies de sélection différentes ont été comparées. Dans la première stratégie de sélection, un diagramme de dispersion de CD trois par rapport à sept A A D a été utilisé pour sélectionner les cellules T vivantes, négatives pour sept A A D et positives pour CD trois. Une région de diffusion avant et latérale a ensuite été utilisée pour exclure les grands agrégats tout en incluant encore les lymphocytes activés.

Les événements R1 plus R2, après sélection, pour le témoin non marqué sont représentés par l'histogramme gris, et les cellules marquées avec PKH26 mais non stimulées apparaissent en bleu. Notez la coloration vive, symétrique et homogène correspondant aux lymphocytes T viables mais non divisés dans le contrôle non stimulé. Ces données ont été sélectionnées de la même manière que sur la figure précédente, mais dans ce cas, les cellules ont été stimulées avec un anti-CD3 et de l'IL-2. L'histogramme PKH26 des événements R1 plus R2 après sélection contient désormais principalement des cellules divisées, avec une intensité réduite, illustrée par des pics colorés correspondant à chaque génération de cellules filles.

Bien que certaines cellules brillantes non divisées restent encore dans le pic parental bleu. Notez que l'intensité des cellules fortement divisées ne chevauche pas encore la région où sont mesurées les cellules non marquées, ce qui pourrait fausser l'estimation des paramètres basés sur le nombre de cellules des générations filiales de plus faible intensité ici. Les mêmes données ont été analysées que dans les deux séries précédentes de figures, mais seule la diffusion de la lumière et le CD trois ont été utilisés pour sélectionner les lymphocytes T viables.

Cette stratégie de sélection exclut de nombreuses cellules mortes, mais pas toutes, comme le montre la petite population résiduelle de sept cellules mortes positives pour l'AAD dans les dot plots de CD3 contre l'AAD. Le choix des fluorochromes utilisés pour l'immunophénotypage peut poser des problèmes de compensation difficiles lorsqu'on utilise des colorants de traçage cellulaire, car l'intensité de coloration des cellules non divisées est extrêmement élevée. Dans cette expérience, des cellules mononucléées du sang périphérique âgées de 24 heures ont été marquées avec le PKH26, puis contre-colorées avec des anticorps dirigés contre CD3 et CD4, ainsi qu'avec un colorant de viabilité.

Dans cette série de données, les cellules marquées avec deux micromolaires de PKH 26 ont été contre-colorées avec l'anticorps anti-CD3 FZ7AaD et l'anticorps anti-CD4 APC, puis analysées en utilisant la même stratégie de sélection R1 plus R2 qu'auparavant. Étant donné qu'il existe peu de recouvrement du signal PKH 26 dans le canal APC, les événements CD4 positifs et négatifs ont été clairement résolus, qu'une compensation ait été appliquée ou non. Ces données illustrent comment les lymphocytes T viables, positifs pour CD3 et CD4, sont restés bien distincts même lorsque la concentration finale de PKH 26 a été augmentée à quatre micromolaires. L'utilisation de l'anticorps anti-CD4 PerCP en combinaison avec l'anticorps anti-CD3 FE, le PKH 26 à deux micromolaires et le colorant de viabilité Pro3 a donné des résultats nettement moins satisfaisants en raison d'un recouvrement important du signal PKH 26 dans le canal PerCP.

Les cellules CD4 positives et négatives n'ont pas pu être distinguées l'une de l'autre dans les données non compensées et ne l'ont été que marginalement lorsque la compensation a été appliquée. L'augmentation de la concentration finale de PKH26 à quatre micromoles par litre a entraîné une perte totale de la capacité à distinguer les événements CD4 positifs des événements CD4 négatifs, même après application de la compensation. Remarquez comment les échantillons contenant ou ne contenant pas l'anticorps anti-CD4 perCP étaient essentiellement identiques.

Lorsqu'un profil de dilution de colorant est analysé à l'aide d'un logiciel de modélisation de pics pour estimer la fréquence des cellules dans les générations successives de cellules filles, les positions et/ou les largeurs des pics successifs des cellules filles peuvent être fixes ou variables par rapport aux valeurs du pic parental. Ces valeurs sont estimées à partir du témoin non stimulé.

Par exemple, ce profil d'intensité PKH26 provient d'une culture non stimulée de 96 heures issue d'un donneur à réponse modérée et a été utilisé pour fournir au module d'ajustement de la prolifération une première estimation de la position et de la largeur du pic représentant les cellules parentales non divisées. L'utilisation d'un paramètre fixe pour la position du pic exige que la moyenne de chaque pic générationnel soit exactement égale à la moitié de l'intensité de fluorescence du pic précédent. Un paramètre flottant pour la position du pic permet aux positions finales des pics générationnels de s'écarter des intensités attendues, selon les besoins, afin d'obtenir le meilleur ajustement possible.

De même, un réglage fixe de la largeur du pic exige que la largeur de chaque pic générationnel soit identique à celle du pic témoin parental ou non stimulé. Un réglage flottant de la largeur du pic permet de faire varier indépendamment les largeurs finales selon les besoins afin d'obtenir le meilleur ajustement dans ce tableau. Les résultats des analyses des figures précédentes pour deux donneurs différents sont présentés pour ces donneurs lorsque des pics générationnels distincts étaient visibles.

Les valeurs les plus faibles du khi-deux réduit ont été obtenues lorsque la position du pic et la largeur étaient laissées libres pour les profils de prolifération où des pics générationnels distincts ne sont pas évidents ; toutefois, un réglage fixe de la position du pic est recommandé. Ces données illustrent l'utilisation de deux colorants traceurs permettant de surveiller séparément les historiques de prolifération de différents types de cellules immunitaires dans un dosage cytométrique en flux d'immunosuppression. Les cellules T effectrices, représentées en vert, ont été marquées avec du CFSE, et les cellules T régulatrices, représentées en bleu, ont été marquées avec du cell view.

Des populations cellulaires marquées en claret ont été mélangées selon différents rapports et cultivées en présence d'anticorps anti-CD3, d'anticorps anti-CD28 et de cellules accessoires irradiées pendant 96 heures. Ensuite, les cellules ont été récoltées et marquées avec des anticorps anti-CD4, le PE Side 7 et le violet vivant-mort. Ici, des données représentatives pour un rapport Treg sur cellules T effectrices de 0,25 à 1 sont présentées après exclusion des cellules positives au violet vivant-mort.

Une fenêtre de diffusion de la lumière incluant les lymphocytes et les cellules blastiques, mais excluant les agrégats et les débris, a été appliquée, suivie d'une fenêtre permettant d'inclure les événements CD4 positifs. La coloration au claret Cell View a permis de distinguer facilement les cellules Treg viables des cellules T effectrices viables fortement proliférées, et par conséquent, les profils de prolifération CFSE DIM des cellules T effectrices CFSE positives et des cellules Treg positives au claret Cell View ont été analysés à l'aide du logiciel de modélisation de pics Mod Fit. Environ 25 000 événements ont été analysés.

Dont 48 % étaient des effecteurs T viables, 6 % des Treg viables, les autres étant des cellules mortes, des cellules accessoires et des débris. L'indice de prolifération calculé, qui reflète l'augmentation du nombre de cellules au cours de la période du test, était de 3,85 pour les effecteurs T et de 1,83 pour les Treg. Ici, l'effet de la concentration des cellules Treg sur l'indice de prolifération des cellules effectrices T, calculé à partir du profil de dilution du colorant CFSE, est présenté.

Les résultats étaient identiques, que les cellules Treg soient marquées avec le colorant Cell View Claret ou qu'elles soient laissées non colorées, ce qui indique que la fonction des Treg n'était pas modifiée par la coloration. Comme prévu avec le suivi, l'ampleur de la prolifération des T effecteurs augmentait lorsque la concentration des cellules Treg diminuait. Les indices de prolifération des cellules Treg ont également été calculés à partir des profils de dilution du colorant Cell View Claret à différents rapports Treg sur T effecteurs.

Comme prévu, les lymphocytes T régulateurs ont subi une prolifération minimale en l'absence de cellules T effectrices, et cette prolifération a augmenté parallèlement à la concentration des cellules T effectrices. Toutefois, l'ampleur de la prolifération des cellules Treg a également augmenté. Après avoir visionné la vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser efficacement les colorants de traçage cellulaire pour surveiller la prolifération cellulaire, comment choisir des fluorochromes et des contrôles de compensation de couleur appropriés, et comment sélectionner un modèle adéquat pour quantifier la division cellulaire en fonction de la dilution du colorant.

Parallèlement à cette procédure, d'autres méthodes peuvent être réalisées afin de répondre à des questions expérimentales, comme la coloration des cellules T spécifiques des antigènes ou le tri en flux pour la récupération de cellules souches quiescentes ou se divisant lentement. Merci beaucoup d'avoir regardé.