Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

L’objectif global de cette méthode est d’utiliser des colorants de suivi cellulaire pour quantifier directement l’étendue de la division cellulaire de différents sous-ensembles de cellules immunitaires au sein de populations complexes. Ceci est réalisé en marquant d’abord la population de cellules parentales avec un colorant fluorescent connu pour donner une liaison stable aux protéines cellulaires ou pour s’intercaler de manière non covalente dans les membranes cellulaires pour suivre les cellules marquées au colorant qui répondent aux compteurs de stimulation, la coloration avec des anticorps fluorescents et l’analyse à l’aide de la cytométrie en flux multiparamétrique permet de détecter les réponses différentielles entre les types de cellules immunitaires d’intérêt stimulés. Mais des contrôles non colorés sont utilisés pour établir l’intensité de fluorescence de cellule fille la plus basse qui peut être distinguée du colorant de suivi d’autofluorescence marqué, mais des contrôles non stimulés sont ensuite utilisés pour établir l’intensité de fluorescence à laquelle les cellules non divisées seront détectées. La stimulation entraîne généralement une large gamme d’intensités à mesure que les cellules qui prolifèrent en réponse deviennent progressivement plus faibles, mais pas les non-répondeurs.

En fin de compte, l’utilisation d’un logiciel de modélisation des pics pour estimer la fréquence relative des cellules dans différentes générations peut permettre une comparaison quantitative des réponses prolifératives entre différentes populations ou stimuli à l’aide de mesures telles que l’indice de prolifération ou la fréquence des précurseurs. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la tritiation, l’incorporation ou l’expression de KI 67 est que la dilution DI fournit une mesure directe de la division cellulaire qui peut être combinée avec d’autres mesures cytométriques en flux EM telles que l’immunophénotypage et la production de cytokines. La démonstration visuelle de la méthode de coloration des colorants membranaires est utile car l’absorption du colorant par les cellules est extrêmement rapide.

Par conséquent, une bonne technique est la clé pour obtenir une coloration homogène et brillante. Une fois que les cellules mononucléées du sang périphérique humain sont isolées, centrifugez pendant cinq minutes à 300 fois G et à température ambiante pour minimiser la contamination plaquettaire. Ensuite, remettez le granulé en suspension à 10 à la septième cellule par millilitre dans HBSS plus 1 % BSA, et placez-les sur de la glace.

Retirez et réservez une Eloqua de 500 microlitres, puis transférez une autre aliquote de 500 microlitres de cellules dans un tube conique en polypropylène de 12 x 75 millimètres. Ajoutez 3,5 millilitres de HBSS et faites tourner les cellules pendant cinq minutes à 400 fois G et à température ambiante pendant le lavage, ajoutez 0,5 millilitre de diluant C du kit PKH 26 GL à un autre tube conique en polypropylène de 12 x 75 millilitres, aspirez soigneusement le super natin en ne laissant pas plus de 15 à 25 microlitres de liquide résiduel et en prenant soin de ne retirer aucune cellule. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de diluant C à la pastille de cellule, puis aspirez et distribuez la solution plusieurs fois pour obtenir une suspension à cellule unique.

Préparez maintenant les deux crosses XD en ajoutant deux microlitres de PKH 26 dans le tube contenant le diluant C. Ce n’est qu’à ce moment-là qu’il suffit de pipeter immédiatement la suspension cellulaire dans une solution de deux colorants XPKH 26 fraîchement préparée, puis d’aspirer et de distribuer simultanément l’adjuvant plusieurs fois pour disperser uniformément les cellules dans tout le colorant. Après une minute, ajoutez un millilitre de sérum inactivé par la chaleur pour arrêter l’absorption du colorant dans les membranes cellulaires. Après avoir tourné vers le bas, les cellules aspirent soigneusement le surnageant sans retirer la pastille.

Ensuite, dispersez le granulé dans quatre millilitres de milieu complet contenant 10 % de sérum inactivé par la chaleur, et transférez la suspension cellulaire dans un tube de polypropylène frais. Lavez les cellules deux fois dans HBSS plus 1 % BSA Les cellules correctement colorées présenteront une teinte rose distincte dans le granulé Après avoir suspendu le granule cellulaire dans un millilitre HBSS plus 1 % BSA, comptez les cellules, puis ajustez le volume pour donner une concentration finale de 10 à la septième cellule par millilitre. Après avoir coloré les cellules selon le protocole de cytométrie en flux décrit dans le tableau, utilisez les cinq premiers tubes pour régler les paramètres de diffusion directe et latérale et les signaux dans les quatre détecteurs de fluorescence.

En particulier pour le détecteur utilisé pour surveiller la fluorescence de la PKH 26 dans le tube deux. Vérifiez que toutes les cellules colorées à la PKH 26 apparaissent sur l’échelle comme un seul pic symétrique dans la troisième à la quatrième décennie avec peu ou pas de cellules dans le dernier canal. Ensuite, utilisez le logiciel de compensation des couleurs et les fichiers de mode liste collectés pour les tubes un à cinq afin d’établir une matrice de chevauchement des couleurs pour chaque fluro dans les détecteurs utilisés pour surveiller les trois autres fluorochromes.

Appliquez ensuite cette matrice au fichier en mode liste pour l’échantillon six. Vérifier que la présence d’un marquage PKH 26 n’altère pas la capacité à détecter sept cellules A et D positives. Appliquez maintenant cette matrice de chevauchement de couleurs qui vient d’être établie au fichier en mode liste pour le tube sept.

Identifiez les populations CD trois positives, CD quatre négatives et CD trois positives, CD quatre positives, sur un graphique EF par rapport à un graphique CP. Confirmer que la présence d’un PC anti CD trois, FE et anti CD quatre A n’altère pas la capacité de détecter sept cellules A a D positives. Enfin, appliquez la matrice de chevauchement des couleurs pour le tube sept au mode liste Fichier pour le tube huit.

Ouvrez maintenant un programme contenant un module d’analyse de prolifération. Chargez le fichier coloré à la PKH 26 stimulé à partir de l’ensemble de données à analyser. Ensuite, sélectionnez les paramètres d’analyse dans ce cas, PKH 26 bloqué sur sept cd viables a a d négatifs, trois lymphocytes positifs et diffusion vers l’avant par rapport à la diffusion latérale pour l’exclusion des petits débris et des gros agrégats.

Lors de la définition de ces régions, veillez à inclure la zone de diffusion vers l’avant élevée où l’on trouve généralement des explosions. Ensuite, ouvrez l’assistant de prolifération. Cliquez sur l’onglet Démarrer pour ouvrir le fichier de données, puis chargez la commande positive PKH 26 non stimulée.

Définissez l’emplacement du pic parental correspondant aux cellules non divisées. Analysez le fichier en notant les valeurs de la position et de la largeur du pic parental. Si une largeur de crête fixe est souhaitée, cochez la case lock, SD chargez la commande négative P KH 26 et ajustez le nombre de générations en réglant le canal de crête pour la génération fille dimus au-dessus des cellules négatives PKH 26.

Cela fixe le nombre de générations filles. Le modèle peut s’adapter avec précision une fois terminé. Rechargez le fichier positif PKH 26 stimulé.

Si des pics générationnels distincts sont évidents, choisissez le paramètre flottant sous l’option modèle. Si les décennies logarithmiques ne sont pas exactement 4,0, ajustez l’espacement générationnel comme indiqué dans l’article. Maintenant, analysez l’échantillon stimulé et confirmez que la région de la position du pic parental reste inchangée.

Enfin, sélectionnez analyser pour chaque fichier expérimental de l’ensemble de données à appliquer. Le modèle vient de créer et d’enregistrer les mesures de prolifération souhaitées résultant de l’ajustement le mieux adapté à chaque fichier expérimental de l’ensemble de données. Cette première série de données illustre l’effet de la technique de mélange sur les distributions de fluorescence de PKH 26.

Lorsqu’elles ont été cultivées, les cellules myéloïdes U 9 37 ont été colorées avec le colorant de suivi cellulaire en utilisant la méthode qui vient d’être décrite. Les paramètres du cytomètre ont été ajustés pour placer l’autofluorescence de ces cellules dans la première décennie avec aucune ou très peu de cellules s’accumulant dans le premier canal. Ce deuxième histogramme illustre une bonne coloration de PKH 26.

Le mélange rapide de deux cellules x avec deux colorants x a donné une distribution de fluorescence brillante, homogène et symétrique, mais aucune cellule n’était hors échelle aux réglages de l’instrument utilisés pour l’histogramme précédent. Lorsque deux cellules x ont été ajoutées à deux colorants x sans mélange immédiat, une distribution de fluorescence plus hétérogène a été obtenue. Cette petite sous-population de cellules faiblement marquées serait interprétée à tort comme des cellules filles si elles étaient présentes à un moment ultérieur de l’histogramme final de cette expérience, un mauvais mélange s’est également produit lorsque trois microlitres de colorant éthanol concentré ont été accidentellement ajoutés directement à 0,5 millilitre de suspension de deux cellules x, produisant une distribution d’intensité de fluorescence extrêmement faible et asymétrique à droite.

Voici les résultats typiques d’une expérience de prolifération dans laquelle des cellules mononucléées du sang périphérique humain colorées à la PKH 20 ont été cultivées avec ou sans stimulation. Les réactifs Anti CD trois et IL deux sont présentés. Après 96 heures de culture, les cellules ont été récoltées et contre-colorées avec des anti CD, trois FE, anti CD, 19 A PC et sept A, a d.

Deux stratégies de contrôle différentes ont été comparées dans la première stratégie de contrôle, un diagramme à points du CD trois par rapport au sept. A, A, D a été utilisé pour sélectionner des cellules T vivantes sept, a, d, négatives, CD, trois cellules T positives. Une région de diffusion vers l’avant et sur les côtés a ensuite été utilisée pour éliminer de gros agrégats tout en incluant des lymphocytes explosifs.

Les événements R un plus R deux pour le témoin non coloré sont représentés par l’histogramme gris et les cellules colorées PKH 26, mais non stimulées sont en bleu, la coloration homogène symétrique brillante pour les cellules T viables mais non divisées dans le contrôle non stimulé. Ces données ont été contrôlées de la même manière que la figure précédente, mais dans ce cas, les cellules ont été stimulées avec l’anti CD trois et l’IL deux. L’histogramme PKH 26 pour les événements R un plus R deux contient désormais principalement des cellules divisées avec une intensité réduite représentée par des pics colorés pour chaque génération fille.

Bien que certaines cellules non divisées brillantes restent encore dans le pic parental bleu. Notez que l’intensité des cellules fortement divisées ne chevauche pas encore la région où les cellules non colorées sont mesurées, ce qui confondrait l’estimation des paramètres basés sur le nombre de cellules dans les générations filles de plus faible intensité ici. Les mêmes données ont été analysées que les deux séries de figures précédentes, mais seules la diffusion de la lumière et le CD trois ont été utilisés pour sélectionner des lymphocytes T viables.

Cette stratégie de contrôle exclut un grand nombre de cellules mortes, mais pas toutes, comme le démontre la petite population résiduelle de sept cellules mortes A a D positives restant dans les diagrammes de points CD trois contre sept A A D. Le choix des fluorochromes utilisés pour l’immunophénotypage peut créer des problèmes de compensation difficiles lors de l’utilisation de matrices de suivi cellulaire, car l’intensité de coloration des cellules non divisées est extrêmement brillante. Dans cette expérience, des cellules mononucléées du sang périphérique âgées de 24 heures ont été marquées avec de la PKH 26, puis contre-colorées avec des anticorps contre le CD trois et le CD quatre plus un colorant de viabilité.

Dans cette série de données, les cellules marquées avec deux micromolaires PKH 26 ont été contre-colorées avec l’anti CD trois FZ sept A a D, et l’anti CD quatre A PC, puis analysées en utilisant la même stratégie de porte R un plus R deux que précédemment, car il y a peu de chevauchement de PKH 26 dans le canal A PC, Les événements positifs et négatifs de la quatrième circonscription ont été clairement résolus, qu’une compensation ait été appliquée ou non. Ces données illustrent comment les lymphocytes T CD, trois positifs pour CD et quatre positifs, viables, sont restés bien résolus, même lorsque la concentration finale de PKH 26 a été augmentée à quatre micromolaires. L’utilisation de l’anti-CD quatre par CP en combinaison avec l’anti CD trois FE deux micromolaires PKH 26 et la matrice de viabilité à pro trois a donné des résultats beaucoup plus médiocres en raison d’un chevauchement significatif de PKH 26 dans le canal par CP.

Les cellules positives et négatives du CD quatre n’ont pas pu être résolues l’une de l’autre dans les données non compensées et n’ont été résolues que marginalement lorsque la compensation a été appliquée. L’augmentation de la concentration finale de PKH 26 à quatre micromolaires a entraîné une perte complète de la capacité de résoudre les événements positifs pour les CD quatre négatifs, même après l’application d’une compensation. Notez comment les échantillons incluant ou manquant d’anti CD quatre par CP étaient essentiellement identiques.

Lorsqu’un profil de dilution de colorant est analysé à l’aide d’un logiciel de modélisation de pics pour estimer la fréquence des cellules dans les générations filles successives, les positions et/ou les largeurs des pics filles successifs peuvent être fixes ou flottantes. En ce qui concerne les valeurs pour le pic parental. Ces valeurs sont estimées à partir du témoin non stimulé.

Par exemple, ce profil d’intensité PKH 26 provient d’une culture non stimulée de 96 heures provenant d’un répondeur modéré et a été utilisé pour fournir à l’assistant de prolifération de l’ajustement mod la première estimation de la position et de la largeur du pic représentant les cellules parentales non divisées. L’utilisation d’un réglage fixe pour la position du pic exige que la moyenne de chaque pic générationnel soit exactement la moitié de l’intensité de fluorescence du pic précédent. Un réglage flottant pour la position du pic permet aux positions finales des pics générationnels de varier par rapport aux intensités attendues selon les besoins pour obtenir le meilleur ajustement.

De même, un réglage fixe de la largeur du pic exige que la largeur de chaque pic générationnel soit la même que celle du pic parental ou du pic de contrôle non stimulé. Un réglage flottant pour la largeur maximale permet de varier indépendamment les largeurs finales selon les besoins pour obtenir le meilleur ajustement dans ce tableau. Les résultats de l’analyse des chiffres précédents pour deux donateurs différents sont présentés pour ces donateurs où des pics générationnels distincts étaient évidents.

Les meilleures valeurs du chi carré réduit ont été obtenues lorsque la position du pic et la largeur ont été laissées flotter pour les profils de prolifération où les pics générationnels distincts ne sont pas évidents, un réglage fixe pour la position du pic est recommandé. Ces données illustrent l’utilisation de deux colorants de suivi pour surveiller séparément les antécédents de prolifération de différents types de cellules immunitaires dans un essai d’immunosuppression par cytométrie en flux. Les cellules T effectrices indiquées en vert ont été marquées avec CFSE et les cellules T régulatrices indiquées en bleu ont été étiquetées avec une vue cellulaire.

Des populations de cellules marquées au Claret ont été mélangées dans des proportions variables et cultivées en présence de cellules accessoires anti CD trois, anti CD 28 et irradiées pendant 96 heures. Par la suite, des cellules ont été récoltées et colorées avec de l’anti CD quatre, de la taille sept du PE et du violet mort vivant. Ici. Des données représentatives pour un rapport treg/effecteur T de 0,25 pour un sont présentées après l’élimination des cellules violettes mortes vivantes.

Une porte de diffusion de la lumière qui incluait les lymphocytes et les blastes, mais excluait les agrégats et les débris a été appliquée, suivie d’une porte pour inclure les événements positifs au CD quatre. La coloration Claret en vue cellulaire a permis de distinguer facilement les cellules Treg viables des cellules effectrices T viables qui étaient fortement proliférées et, par conséquent, les profils de prolifération CFSE DIM pour les cellules effectrices T positives CFSE et les cellules Treg positives en vue cellulaire Claret ont été analysés à l’aide d’un logiciel de modélisation de pic mod fit. Environ 25 000 événements ont été analysés.

Parmi ceux-ci, 48 % étaient des effecteurs T viables, 6 % étaient des T regs viables, le reste étant des cellules mortes, des cellules accessoires et des débris. L’indice de prolifération calculé, qui reflète l’augmentation du nombre de cellules au cours de la période de test, était de 3,85 pour les effecteurs T et de 1,83 pour les Tregs. Ici, l’effet de la concentration des cellules Tregs sur l’indice de prolifération des cellules effectrices T calculé à partir du profil de dilution du colorant CFSE est montré.

Les résultats étaient les mêmes, que les cellules Treg aient été marquées avec une vue cellulaire claret ou qu’elles aient été laissées non colorées, indiquant que la fonction Treg n’a pas été altérée par la coloration. Avec un suivi comme prévu, l’étendue de la prolifération des tectors a augmenté à mesure que la concentration de cellules treg a diminué. Les indices de prolifération cellulaire Treg ont également été calculés à partir des profils de dilution du colorant claret en vue cellulaire à différents rapports effecteurs Treg à T.

Comme prévu, les Tregs ont subi une prolifération minimale en l’absence de cellules effectrices T à mesure que la concentration de cellules effectrices T augmentait. Cependant, l’étendue de la prolifération des cellules Treg a également augmenté. Après avoir regardé la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser avec succès les colorants de suivi cellulaire pour surveiller la prolifération cellulaire, comment choisir les fluorochromes appropriés et les commandes de compensation de couleur, et comment sélectionner un modèle approprié pour quantifier la division cellulaire en fonction de la dilution du colorant.

Parallèlement à cette procédure, d’autres méthodes peuvent être mises en œuvre pour répondre à des questions expérimentales telles que la coloration des cellules T spécifiques de l’antigène ou le tri du flux pour la récupération des cellules souches quiescentes ou qui se divisent lentement. Merci beaucoup d’avoir regardé.