Comparaison de trois différentes méthodes pour la détermination de la prolifération cellulaire dans des lignées cellulaires de cancer du sein

L’objectif global de cette démonstration est de comparer trois tests de prolifération cellulaire différents et de présenter les avantages et les inconvénients de chaque méthode. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer, telles que l’utilisation de la méthode de prolifération cellulaire la plus appropriée. La préparation de cette méthode est essentielle, car les étapes de l’imageur cellulaire sont difficiles à apprendre.

Ils vous obligent à vous concentrer sur les cellules avant d’appliquer le masque de comptage cellulaire approprié. Pour commencer cette procédure, cultivez deux lignées cellulaires MCF-7 pendant trois jours jusqu’à une confluence de 75 à 80 % dans les flacons de culture tissulaire de 75 centimètres carrés en utilisant du DMEM sans rouge de phénol. Après trois jours, retirez les cellules des flacons en versant le milieu dans un conteneur à déchets.

Ensuite, lavez immédiatement la couche cellulaire avec deux millilitres de trypsine préchauffée deux fois. Aspirez la trypsine et ajoutez deux autres millilitres de trypsine préchauffée à la couche cellulaire avant de la placer dans un incubateur. Une fois que les cellules se sont détachées, lavez-les avec 10 millilitres de DMEM frais et supplémenté réchauffé.

Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile de 15 millilitres et centrifugez-la pendant cinq minutes à température ambiante. Après cinq minutes, aspirez et jetez soigneusement le surnageant. Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de DMEM fraîchement supplémenté.

Pour effectuer une numération cellulaire, diluez 100 microlitres de suspension cellulaire dans 900 microlitres d’une fois DPBS. Ensuite, placez un nouveau capteur de 60 micromètres sur le compteur de cellules automatisé. Maintenez le piston enfoncé et immergez le capteur dans la suspension de cellules diluées.

Relâchez lentement le piston sur le compteur de cellules. Ensuite, retirez le capteur du compteur de cellules une fois terminé. Ensemencez les cellules dans un volume final de 100 microlitres dans une plaque de 96 puits à environ 20 % de confluence pour laisser de la place pour la croissance cellulaire et la mesure de la prolifération sur trois à cinq jours.

Pour déterminer le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre, préchauffez le milieu et la trypsine à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire, un four ou un bain-marie. Ensuite, aspirez le milieu des cellules dans un conteneur à déchets. Ensuite, lavez-les une fois avec 30 microlitres de deux fois trypsine et aspirez à nouveau le milieu dans le conteneur à déchets.

Ensuite, lavez à nouveau les cellules avec 30 microlitres de trypsine deux fois et incubez-les pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Tapotez doucement le bord de la plaque pour déloger les cellules. Par la suite, ajoutez 50 microlitres de DMEM supplémenté et mélangez les cellules par pipetage jusqu’à ce qu’une suspension unicellulaire se forme.

Placez la lamelle en verre sur les chambres de comptage et fixez-la jusqu’à ce que les anneaux de réfraction de Newton soient visibles entre les bords de la lamelle et l’hélocytomètre. Ensuite, pipetez doucement 20 microlitres de la suspension cellulaire sous la lamelle et laissez la chambre de comptage être remplie par mouvement capillaire. Par la suite, visualisez les chambres de comptage dans la disposition de la grille sous un grossissement de 10x.

Dans cette procédure, décongelez le réactif de luminescence dans un bain-marie à 22 degrés Celsius pendant 30 minutes. Retournez délicatement le flacon pour obtenir un mélange homogène. Ensuite, équilibrez une plaque de cellules ensemencées à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de réactif de luminescence dans chaque puits. Mélangez le contenu sur un agitateur orbital pendant deux minutes. Ensuite, laissez la plaque incuber pendant 10 minutes à température ambiante.

Pour configurer une expérience de luminescence à l’aide du logiciel de lecture de plaques multimode, allumez le lecteur de plaques multimode et ouvrez le logiciel. Dans le Gestionnaire des tâches, sélectionnez Expériences et Créer. Ensuite, sélectionnez Fichier dans la barre d’outils latérale, puis sous l’onglet Protocole, sélectionnez Procédure.

Ensuite, sélectionnez Greiner 96 flat bottom comme type de plaque et cochez la case Utiliser le couvercle. Sélectionnez l’action Lecture dans la zone Méthode de lecture. Ensuite, sélectionnez Luminescence comme méthode de détection et cliquez OK.In la case Étape de lecture, sélectionnez les puits à analyser sous l’onglet Plaque complète et sélectionnez les puits qui agiront comme des puits vides.

Définissez le filtre défini sur Filtre vide. Réglez le gain sur 135, avec un temps d’intégration de 5 secondes par puits et une hauteur de lecture de 6,5 millimètres. Cliquez sur OK pour enregistrer les paramètres de luminescence lus.

Pour effectuer une lecture de luminescence, éjectez le support de plaque en sélectionnant l’onglet Contrôle de l’instrument et cliquez sur Sortie de plaque. Placez la plaque à 96 puits sur le support de plaque, en vous assurant que le couvercle est en place. Fermez le support de plaque en cliquant sur Entrée de la plaque sous l’onglet Contrôle de l’instrument.

Ensuite, cliquez sur Lire maintenant dans la barre d’outils pour effectuer une lecture luminescente. Après cela, exportez les mesures RLU de chaque puits vers une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie. Pour configurer une expérience d’imagerie cellulaire, allumez l’imageur cellulaire multimode et ouvrez le logiciel.

Dans le Gestionnaire des tâches, sélectionnez l’onglet Expériences et Créez-en un. Dans la barre d’outils Fichier, cliquez sur l’onglet Protocole, puis sur l’onglet Procédure. Sélectionnez l’action Régler la température.

Réglez l’incubateur sur On et réglez la température sur 37 degrés Celsius. Cochez Préchauffage, puis cliquez sur OK pour enregistrer les paramètres. Ensuite, sélectionnez l’action Lire.

Cliquez sur Image comme méthode de détection. Ensuite, sélectionnez le type de lecture Point de terminaison/cinétique et le type d’optique Filtres, puis cliquez sur OK. Après cela, cliquez sur l’onglet Plaque complète et sélectionnez les puits de la plaque à imager. Cliquez sur OK pour enregistrer les paramètres.

Maintenant, sélectionnez l’objectif 2,5 fois dans l’option déroulante Objectifs. Sous l’onglet Canaux, sélectionnez GFP 469.525 et Fond clair. Vérifiez l’exposition automatique pour les deux canaux et sélectionnez correctement l’exposition automatique.

Pour déterminer les paramètres de mise au point automatique, cliquez sur Options. Pour les options de mise au point automatique, sélectionnez la méthode Balayer, puis Mise au point automatique. Cliquez sur OK pour enregistrer les paramètres.

Après cela, réglez le décalage horizontal et vertical par rapport au centre du puits à zéro. Sélectionnez cette option pour numériser plusieurs images par puits dans un montage trois par deux. Cliquez ensuite sur OK pour enregistrer les paramètres de la procédure.

Pour lire l’expérience sur la plaque sélectionnée, cliquez sur l’onglet Contrôle de l’instrument et sélectionnez la fonction Plate Out. Placez une plaque à 96 puits sur le support de plaque, en vous assurant que le couvercle est en place. Sous l’onglet Contrôle de l’instrument, sélectionnez la fonction Entrée de la plaque.

Ensuite, sélectionnez Lire maintenant dans l’onglet de la plaque et répétez la lecture toutes les 24 heures, jusqu’à 96 heures après l’ensemencement. Pour analyser une image, cliquez sur l’onglet Données de la plaque imagée et sélectionnez Image GFP 469, 525 plus Fond clair. Ensuite, double-cliquez sur le puits imagé.

Maintenant, cliquez sur une image chargée. Sélectionnez Analyser, puis sélectionnez l’image unique du montage à analyser. Ensuite, cliquez sur OK. Ensuite, vérifiez uniquement le canal GFP et définissez les paramètres comme indiqué dans le Tableau 3.

Après cela, cliquez sur Démarrer pour appliquer les paramètres aux cellules imagées. Observez le masque de comptage de cellules placé sur les cellules imagées, qui est utilisé pour déterminer le nombre de cellules par image. Cliquez sur Appliquer les modifications et conservez ces paramètres pour chaque plaque imagée tout au long de l’expérience.

Dans cette figure, une analyse de régression linéaire a été réalisée pour comparer les relations corrélatives entre les différentes méthodes examinées pour mesurer la prolifération cellulaire dans les cellules MCF-7-LeGO et les cellules MCF-7-delta 40p53. Un coefficient de corrélation de Pearson a été calculé, et la signification a été déterminée entre les différentes méthodes de mesure de la prolifération cellulaire. La corrélation la plus forte a été observée entre la comparaison du test basé sur la luminescence et l’imageur cellulaire.

Voici les images représentatives des cellules cancéreuses du sein MCF-7-LeGO et MCF-7-delta 40p53 positives à la GFP capturées à l’aide de l’imageur cellulaire toutes les 24 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent près de 100 % de confluence. Cette méthode fournit des informations cellulaires utiles, notamment la possibilité de surveiller visuellement la croissance cellulaire sur plusieurs jours et de comparer la taille et la morphologie des cellules entre différentes lignées cellulaires. On trouvera ici un résumé des avantages et des inconvénients de chaque méthode testée, ce qui démontre la polyvalence de chacune des méthodes et aidera les lecteurs à choisir la méthode la plus appropriée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de trois tests de prolifération cellulaire différents et être en mesure de déterminer celui qui convient le mieux à votre propre conception expérimentale.