Visualisation des bactéries dans nématodes en utilisant la microscopie à fluorescence

L’objectif global de cette procédure est d’observer la symbiance bactérienne marquée par fluorescence au sein de leur nématode hôte. Ceci est accompli en marquant d’abord la bactérie avec une protéine fluorescente par conjugaison. La deuxième étape consiste à isoler les nématodes AIC en récoltant des œufs.

Ensuite, les nématodes AIC sont cultivés en combinaison avec leur symbiant bactérien marqué par fluorescence pour permettre l’association naturelle finalement la localisation du symbiant bactérien dans l’hôte nématode. Et la fréquence de cette association au sein de la population de nématodes peut être déterminée par microscopie à fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la symbiose, telles que : où les bactéries se localisent-elles dans leur hôte et quelle est la distribution du port bactérien dans une population hôte ?

Après la croissance pendant la nuit des souches bactériennes, la sous-culture, le donneur receveur et l’aide des souches dans un milieu de croissance riche en nutriments dépourvu d’antibiotiques dans un rapport de un à 100 entre la culture et le milieu, puis cultivez les cultures à la température appropriée pour chaque souche jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade de croissance intermédiaire du log. Ensuite, combinez les souches dans un seul microtube de centrifugation et centrifugez les cultures mixtes pendant deux minutes À 17 900 G, décantez le surnageant et essorez la pastille dans 30 microlitres de milieu frais. Ensuite, placez la suspension sur une plaque de média riche en nutriments sans aucun antibiotique, et laissez sécher la tache lorsque la suspension a séché.

Incuber la plaque inversée pendant la nuit à une température optimale pour la bactérie réceptrice et permise pour le donneur et l’aide, le cas échéant. Maintenant, grattez l’endroit et la traînée pour des colonies uniques sur une plaque d’antibiotique sélectif pour obtenir une culture pure de traînée bactérienne, une seule colonie pour l’isolement. Enfin, assurez-vous que les colonies résultantes sont le symbiant récepteur et non la souche donneuse.

En dépistant la présence de phénotypes spécifiques au receveur. Par exemple, la bactérie cino abdi peut être distinguée d’e coli en effectuant un test de catalyseur pour détecter la présence du plasmide en confirmant la fluorescence sous la longueur d’onde correspondant à la protéine plasmidique fluorescente. Après avoir cultivé le symbiant bactérien naturel pendant la nuit, étalez 600 microlitres de la culture bactérienne sur huit à 10 hydrates lipidiques de 10 millimètres, puis incubez les plaques dans l’obscurité sans humidité à 25 degrés Celsius.

Après deux jours, ajoutez 5 000 nématodes juvéniles infectieux dans 500 microlitres de milieu aux pelouses bactériennes. Après avoir incubé les plaques à 25 degrés Celsius pendant trois jours supplémentaires, placez 20 microlitres d’eau sur une lame de microscope. Ensuite, utilisez un bâtonnet stérile pour gratter une petite quantité de nématodes de la pelouse bactérienne.

Placez le bâton dans l’eau pour permettre aux nématodes de nager. Regardez ce toboggan sous un faible grossissement. Si des œufs et des femelles sont visibles, continuez lorsque les femelles contiennent des œufs, placez quelques millilitres d’eau à la surface des plaques, faites tourner doucement les plaques, puis versez l’eau dans un tube conique de 50 millilitres.

Les nématodes doivent se détacher des plaques et ne plus être visibles à la surface de la plaque. Laissez les nématodes se déposer au fond du tube, puis versez l’excès d’eau par le haut du tube et remplissez le tube d’eau propre. Après avoir laissé les nématodes adultes s’installer et pipeté à nouveau l’excès d’eau, remplissez les tubes coniques avec la solution d’œuf.

Mélangez ensuite les tubes par inversion douce pendant exactement 10 minutes à température ambiante. Après avoir secoué, centrifugez immédiatement les tubes coniques pendant exactement 10 minutes à 1 250 G et à température ambiante avec la pause activée. Ensuite, décantez rapidement le surnageant, remettez le granulé en suspension avec la solution d’œuf par pipetage et remplissez le tube conique avec une solution d’œuf frais.

Mélangez bien la suspension d’œufs en inversant le tube trois à cinq fois, puis après avoir immédiatement granulé les œufs et décanté le surnageant comme on vient de le voir. Remettre la pastille en suspension dans la misogynie, le bouillon ou le LB par pipetage, puis transférer la suspension d’œuf dans un tube conique de 15 millilitres. Remplissez maintenant le tube de 15 millilitres avec lb, lavez les œufs trois fois dans le bouillon en utilisant la même technique d’étape rapide que celle qui vient d’être démontrée, puis diluez les œufs de nématode P remis en suspension à au moins 10 œufs par microlitre.

Transférez les œufs dans une boîte de Pétri de six centimètres contenant cinq millilitres de LB et des antibiotiques contre les bactéries colonisatrices. La plaque peut être conservée enveloppée dans du perfil jusqu’à quatre jours après la croissance pendant la nuit et la sélection des bactéries fluorescentes. À l’aide d’un bâtonnet stérile, étalez 600 microlitres de la culture bactérienne sur des aérations lipidiques de 10 millimètres et incubez la culture à 25 degrés Celsius.

Après deux jours, répartissez 500 à 5 000 œufs de nématode sur chaque plaque lipidique. Si la plaque a été conservée, lavez les œufs dans 15 millilitres de LB comme nous venons de le démontrer, au moins une fois avant d’inoculer les œufs sur les pelouses bactériennes préalablement préparées. Ensuite, incubez les bactéries nématodes dans l’obscurité sans humidité à 25 degrés Celsius jusqu’à ce que les juvéniles infectieux apparaissent sous la forme d’un anneau blanc flou sur le bord de la plaque.

Lorsque les juvéniles infectieux ont été observés. Retirez le couvercle de la plaque de gélose lipidique et placez le bas de la plaque au fond d’une boîte de Pétri vide de 100 millimètres sur 20 millimètres. Ensuite, remplissez la boîte de Pétri avec suffisamment d’eau pour atteindre environ la moitié de la hauteur de la plus petite plaque et incubez le piège à eau jusqu’à ce que les juvéniles infectieux de la progéniture aient émergé dans l’eau.

Après avoir recueilli les nématodes dans l’eau ou, au stade de vie souhaité, dans la pelouse bactérienne appropriée, dissolvez quelques grains d’olé dans 30 microlitres d’eau, et à un à deux microlitres de cet agent paralysant pour chaque 50 microlitres d’échantillon de nématodes. Transférez ensuite environ 20 à 30 microlitres de l’échantillon de nématode paralysé sur une lame de microscope et placez une lamelle sur l’échantillon. Observez les nématodes à l’aide de la microscopie optique pour vous assurer qu’ils sont dans le champ de vision.

Identifier la localisation bactérienne. Photographiez les nématodes au microscope fluorescent en plus du réglage de microscopie optique, puis superposez les images. Il peut être nécessaire d’essayer plusieurs agrandissements et vues du nématode pour trouver la bactérie.

Une population de nématodes provenant de deux milieux a été dénombrée et notée pour la colonisation par le symbiant bactérien. Pour des statistiques robustes, il est préférable de compter au moins 100 nématodes par échantillon, dont au moins 30 entrent dans chaque catégorie, comme le montre le tableau. Ces nématodes sont colonisés à un niveau d’environ 14,6 % lorsqu’ils sont cultivés sur gélose lipidique et de 68,6 % lorsqu’ils sont cultivés sur gélose hépatique, rénale.

Il a été démontré que d’autres espèces de nématodes et de bactéries ont des niveaux de colonisation différents. Ce schéma illustre l’aspect général des femelles Steiner NEMA. L’encart montre l’image de contraste interférentiel différentiel d’une femelle graphique S à un grossissement de 20 x.

La flèche noire dans l’encart indique la vulve, tandis que les flèches blanches indiquent les œufs visibles. Cette image montre un œuf de nématode Volt développé mais non éclos à un grossissement de 40 x, et ces œufs isolés des nématodes Volta ont été imagés à un grossissement de 10 x. Ici, des images microscopes représentatives des nématodes Steiner Nima associés à la bactérie Xeno aptus sont présentées dans cette première image.

Les nématodes d’Alvin ont été associés à leur exposition bactérienne symbiant exprimant la GFP pour créer cette image composite. Une image en contraste de phase a été superposée à une image fluorescente. La flèche indique la bactérie présente dans le nématode juvénile infectieux.

Cette image montre un nématode juvénile S carpa capsi avec une GFP exprimant X nla. L’image a été construite de la même manière que l’image précédente et représente le nématode juvénile avec des bactéries marquées par des protéines fluorescentes vertes, visualisées comme les bâtonnets verts localisés dans toute la lumière intestinale du nématode. En plus de la procédure décrite, d’autres méthodes telles que la manipulation génétique du symptôme bactérien avant l’association avec l’hôte nématode peuvent être incorporées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que quels sont les mécanismes moléculaires nécessaires à l’association hôte-microbe.