Name: Visualisation des bactéries dans nématodes en utilisant la microscopie à fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Découvrez la visualisation de bactéries fluorescentes dans les nématodes Steinernema par microscopie à fluorescence. Cette méthode permet d'étudier la localisation des symbiontes Xenorhabdus et leur distribution au sein des populations hôtes.

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Les auteurs tiennent à remercier Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby sucre, Eric Stabb, et Todd Ciche pour leurs contributions à l&#39;élaboration de ce protocole et les outils utilisés. KEM et JMC ont été pris en charge par National Institutes of Health (NIH) Prix National Research Service T32 (AI55397 &quot;Microbes en matière de santé et de la maladie&quot;). JMC a été soutenue par un National Science Foundation (NSF) Bourse de recherche doctorale. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation (IOS-0920631-0950873 et IOS).

<ol><li>Holterman, M., van der Wurff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylum-wide+analysis+of+SSU+rDNA+reveals+deep+phylogenetic+relationships+among+nematodes+and+accelerated+evolution+toward+crown+clades%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades.</a> Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).</li>
<li>Lambshead, P. J. D., Boucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+nematode+deep-sea+biodiversity+-+hyperdiverse+or+hype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biogeogr%22%5BJournal%5D)">Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype.</a> J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).</li>
<li>Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Achromobacter+nematophilus+Poinar+and+Thomas+%28Achromobacteraceae%3A+Eubacteriales%29+in+the+development+of+the+nematode%2C+DD-136+%28Neoaplectana+sp.+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae).</a> Parasitol. 56, 385-390 (1966).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Bird, A. F., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+the+intestinal+vesicle+in+nematodes+of+the+family+Steinernematidae%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae.</a> Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).</li>
<li>Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Steinernema+carpocapsae+intestinal+vesicle+contains+a+subcellular+structure+with+which+Xenorhabdus+nematophila+associates+during+colonization+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation.</a> Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).</li>
<li>Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+colonization+and+release+process+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host%2C+Steinernema+carpocapsae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).</li>
<li>Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insect+pathogenic+symbiosis+between+a+Caenorhabditis+and+Serratia%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia.</a> Virulence. 2, 158-161 (2011).</li>
<li>Abebe, E., Jumba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+Caenorhabditis+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae.</a> J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).</li>
<li>Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+entomopathogenicity+and+bacterial+associates+of+the+nematode+Oscheius+carolinensis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Control%22%5BJournal%5D)">Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis.</a> Biol. Control. 59, 123-129 (2011).</li>
<li>Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscheius+carolinensis+n.+sp+%28Nematoda%3A+Rhabditidae%29%2C+a+potential+entomopathogenic+nematode+from+vermicompost%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost.</a> Nematology. 12, 121-135 (2010).</li>
<li>Zhang, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterorhabditidoides+chongmingensis+gen.+nov.%2C+sp.+nov.+%28Rhabditida%3A+Rhabditidae%29%2C+a+novel+member+of+the+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes.</a> J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).</li>
<li>Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+colonization+events+in+the+mutualistic+association+between+Steinernema+carpocapsae+nematodes+and+Xenorhabdus+nematophila+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria.</a> J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen%2C+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+and+matricide+during+Photorhabdus+luminescens+transmission+by+Heterorhabditis+bacteriophora+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).</li>
<li>Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+the+mutualistic+colonization+of+the+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora+by+the+bacterium+Photorhabdus+luminescens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens.</a> BMC Microbiol. 10, 45(2010).</li>
<li>Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorhabdus+phase+variants+express+a+novel+fimbrial+locus%2C+mad%2C+essential+for+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis.</a> Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).</li>
<li>Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Xenorhabdus+nematophila+metabolic+mutants+yields+insight+into+stages+of+Steinernema+carpocapsae+nematode+intestinal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization.</a> Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).</li>
<li>Sugar, D. R., Murfin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+and+host+interactions+of+Xenorhabdus+bovienii+SS-2004%2C+the+entomopathogenic+symbiont+of+Steinernema+jollieti+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes.</a> Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).</li>
<li>Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenorhabdus+nematophila+nilABC+genes+confer+the+ability+of+Xenorhabdus+spp.+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).</li>
<li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).</li>
<li>Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+PixA+inclusion+body+protein+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila.</a> J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).</li>
<li>Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Analyses+Reveal+Overall+Topology+and+Functional+Regions+of+NilB%2C+a+Bacterial+Outer+Membrane+Protein+Required+for+Host+Association+in+a+Model+of+Animal-Microbe+Mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism.</a> J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).</li>
<li>Ciche, T. A., Goffredi, S. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCiche%2C+TA+%22Methods+in+General+and+Molecular+Microbiology%22">Methods in General and Molecular Microbiology</a>. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).</li>
<li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodrich-Blair%2C+H+%22Insect+Pathogens%2C+Molecular+Approaches+and+Techniques%22">Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques</a>. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).</li>
<li>Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophila+requires+an+intact+iscRSUA-hscBA-fdx+locus+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).</li>
<li>Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophilus+as+a+model+for+host-bacterium+interactions%3A+rpoS+is+necessary+for+mutualism+with+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes.</a> J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).</li>
<li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Sicard, M., Brun, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+native+Xenorhabdus+on+the+fitness+of+their+Steinernema+hosts%3A+contrasting+types+of+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction.</a> Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).</li>
<li>Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-Tn7+transposons+for+site-specific+tagging+of+bacteria+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins.</a> Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).</li>
<li>Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+gfp+and+inaZ+broad-host-range+promoter-probe+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Int%22%5BJournal%5D)">Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors.</a> Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).</li>
<li>Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiometabolic+stratification+of+Shewanella+oneidensis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).</li>
<li>Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Tn7-based+system+for+the+single-copy+insertion+of+cloned+genes+into+chromosomes+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria.</a> Gene. 109, 167-168 (1991).</li>
<li>Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoodring%2C+JL+%22Southern+Cooperative+Series+Bulletin+331%22">Southern Cooperative Series Bulletin 331</a>. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le protocole décrit ici fournit une méthode pour la détection optique de bactéries dans un hôte de nématodes (Figure 1). Cette méthode tire avantage de la transparence optique des nématodes et la capacité de bactéries étiquettes par fluorescence, permettant l&#39;analyse in vivo des bactéries à l&#39;intérieur de l&#39;hôte de nématodes (Figure 3). Plus précisément, cette approche identifie la localisation bactérienne au sein de son hôte. En comptant une population de ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Agar lipides (Stérile) </td><td></td><td></td><td> 8 grammes de bouillon de nutriment, 15 grammes d&#39;agar, 5 grammes d&#39;extrait de levure, 890 ml d&#39;eau, 10 ml 0,2 g / ml de MgCl2. 6H 2 0, 96 ml d&#39;une solution de sirop de maïs *, 4 * ml d&#39;huile de maïs Incorporer les médias, tout en versant des plaques * Ajouter ingrédient stérile après autoclavage </td></tr><tr><td> Solution de sirop de maïs (Stérile) </td><td></td><td></td><td> 7 ml de sirop de maïs, 89 ml d&#39;eau mélange à l&#39;autoclave </td></tr><tr><td> Solution Egg </td><td></td><td></td><td> 16,6 ml d&#39;hypochlorite de sodium à 12%, 5 ml de KOH 5M, 80 ml d&#39;eau </td></tr><tr><td> Lysogénie Bouillon (Stérile) </td><td></td><td></td><td> 5 grammes d&#39;extrait de levure, 10 g de tryptone, 5 grammes de sel, 1 L d&#39;eau mélange à l&#39;autoclave </td></tr><tr><td> Micro centrifuger </td><td> Pêcheur </td><td> 13-100-675 </td><td> Toute microcentrifugeuse qui détient microtubes travaillera </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Beckman </td><td> 366802 </td><td> Grande centrifugeuse de table qui contient 15 ml et 50 ml tubes coniques </td></tr><tr><td> Stérile 60 mm X 15 mm Boîte de Pétri </td><td> Pêcheur </td><td> 0875713 </td><td></td></tr><tr><td> 50 tubes à centrifuger ml </td><td> Pêcheur </td><td> 05-539-6 </td><td></td></tr><tr><td> 15 tubes à centrifuger ml </td><td> Pêcheur </td><td> 05-531-6 </td><td></td></tr><tr><td> Stérile 100 mm X 20 mm Boîte de Pétri </td><td> Pêcheur </td><td> 0875711Z </td><td> Plus profond que des boîtes de Petri standard de </td></tr><tr><td> Plaque de 24 puits </td><td> Greiner Bio-One &lt;/ Td&gt; <td> 662000-06 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope </td><td></td><td></td><td> Le microscope a besoin de capacités fluorescentes compatible avec votre fluorophore </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> PBS (Stérile) </td><td></td><td></td><td> 8 g de NaCl 0,2 g de KCl 1,44 g de Na 2 HPO 4 0,24 g KH 2 PO 4 1 L d&#39;eau Ajuster à un pH de 7,4 et d&#39;eau pour 1 L et autoclave </td></tr><tr><td> Microtubes </td><td> Pêcheur </td><td> 05-408-138 </td><td> 2 ml ou 1,5 ml tubes </td></tr><tr><td> Shaker </td><td></td><td></td><td> Toute agitation que provoque le liquide à déplacer doucement travaillera </td></tr><tr><td> L&#39;acide diaminopimélique </td><td> Sigma </td><td&gt; D-1377 </td><td> Si nécessaire, compléter des médias à une concentration ou 1 mM </td></tr></tbody></table>

visualisation des bactéries dans nématodes en utilisant la microscopie à fluorescence

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, le vivre ensemble de deux ou plusieurs organismes, sont répandues dans tous les règnes du vivant. Comme deux des organismes les plus répandus sur la terre, les nématodes et les bactéries forment un large éventail d&#39;associations symbiotiques qui vont de bénéfique pour les pathogènes 1-3. Une telle association est la relation mutuellement bénéfique entre les bactéries et nématodes Steinernema Xenorhabdus, qui a émergé en tant que système modèle de symbiose 4. Nématodes entomopathogènes Steinernema sont, en utilisant leur symbiote bactérien pour tuer les insectes 5. Pour la transmission entre les hôtes d&#39;insectes, les bactéries colonisent l&#39;intestin de l&#39;étape du nématode infectieux juvénile 6-8. Récemment, plusieurs autres espèces de nématodes a été démontré que les bactéries utilisent pour tuer les insectes 9-13, et les enquêtes ont commencé à étudier les interactions entre les nématodes et les bactéries dans ces systèmes &lt;sup&gt; 9. Nous décrivons une méthode pour la visualisation d&#39;un symbiote bactérien dans ou sur un hôte de nématodes, profitant de la transparence optique de nématodes lorsqu&#39;ils sont vus au microscope. Les bactéries sont modifiées pour exprimer une protéine fluorescente, ce qui permet leur visualisation par microscopie de fluorescence. Il existe de nombreux plasmides qui portent des gènes codant pour des protéines qui sont fluorescents à différentes longueurs d&#39;onde (c.-vert ou rouge), et la conjugaison des plasmides provenant d&#39;une souche d&#39;Escherichia coli donateurs dans un symbiote bactérien destinataire est positive pour une large gamme de bactéries. Les méthodes décrites ont été développés pour étudier l&#39;association entre Steinernema carpocapsae et Xenorhabdus nematophila 14. Des méthodes similaires ont été utilisées pour étudier d&#39;autres nématodes bactérie associations 9, 15-18 et l&#39;approche est donc généralement applicable. Le rencontréhod permet de caractériser la présence de bactéries et de localisation au sein de nématodes à des stades de développement différents, donnant un aperçu de la nature de l&#39;association et le processus de la colonisation 14, 16, 19. L&#39;analyse microscopique révèle la fréquence de colonisation à l&#39;intérieur d&#39;une population et la localisation des bactéries aux tissus de l&#39;hôte 14, 16, 19-21. Il s&#39;agit d&#39;un avantage sur les autres méthodes de surveillance des bactéries au sein des populations de nématodes, tels que la sonication 22 ou meulage 23, qui peuvent fournir des niveaux moyens de la colonisation, mais ne peut pas, par exemple, distinguer les populations avec une fréquence élevée de faibles charges symbiotes des populations une basse fréquence de charges élevées symbiotes. Discriminer la fréquence et la charge de bactéries colonisant peut être particulièrement important lors du dépistage ou de caractérisation de mutants bactériens des phénotypes colonisation 21, 24. En effet, la microscopie à fluorescence a été utilisé dans criblage à haut débit de mutants bactériens pour les défauts de la colonisation 17, 18, ​​et est moins pénible que les autres méthodes, y compris sonication 22, 25-27 et dissection des nématodes individuelle 28, 29.

Pour étudier le mutualisme entre<em&gt; Xenorhabdus</em&gt; Les bactéries et<em&gt; Steinernema</emNématodes&gt;, des méthodes ont été développées pour contrôler la présence de bactéries et nématodes emplacement à l&#39;intérieur. L&#39;approche expérimentale, qui peut être appliquée à d&#39;autres systèmes, ingénierie implique bactéries pour exprimer la protéine fluorescente verte et de visualisation, en utilisant des bactéries de microscopie par fluorescence dans le nématode transparent.

Visualisation des bactéries dans nématodes en utilisant la microscopie à fluorescence

Les symbioses, soit la cohabitation de deux organismes ou plus, sont répandues dans tous les règnes du vivant. En tant que deux des organismes les plus ubiquitaires sur...

L'objectif général de cette procédure est d'observer des symbiotes bactériens marqués par fluorescence au sein de leur hôte nématode. Cela est réalisé en marquant d'abord les bactéries avec une protéine fluorescente par conjugaison. La deuxième étape consiste à isoler les nématodes AIC en récoltant les œufs.Ensuite, les nématodes AIC sont cultivés en association avec leur symbionte bactérien marqué par fluorescence afin de permettre une association naturelle et, en fin de compte, la localisation du symbionte bactérien à l'intérieur de l'hôte nématode. La fréquence de cette association au sein de la population de nématodes peut être déterminée par microscopie à fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine des symbioses, telles que : où les bactéries se localisent-elles au sein de leur hôte, et quelle est la distribution du portage bactérien au sein d'une population hôte ?Après une croissance nocturne des souches bactériennes, réaliser une sous-culture des souches donneur, receveur et auxiliaire dans un milieu de croissance riche en nutriments et dépourvu d'antibiotiques, selon un rapport de un à 100 entre la culture et le milieu, puis faire croître les cultures à la température appropriée pour chaque souche jusqu'à ce qu'elles atteignent une phase de croissance logarithmique moyenne. Ensuite, mélanger les souches dans un seul tube de microcentrifugeuse et centrifuger les cultures mixtes pendant deux minutes à 17 900 ×g, décantation du surnageant et resuspension du culot dans 30 microlitres de milieu frais. Puis déposer la suspension sur une boîte de milieu riche en nutriments sans antibiotiques, et laisser la goutte sécher une fois que la suspension est sèche.Incubez la boîte renversée toute la nuit à une température optimale pour la bactérie réceptrice et compatible avec le donneur et l'aide si applicable. Prélèvez ensuite la tache et réalisez un isolement par stries sur une boîte contenant un antibiotique sélectif afin d'obtenir une culture pure de bactéries, sous forme d'une colonie isolée. Enfin, vérifiez que les colonies obtenues correspondent bien au symbiote récepteur et non à la souche donneuse.En recherchant la présence de phénotypes spécifiques au receveur. Par exemple, les bactéries cino abdi peuvent être distinguées d’E. coli en effectuant un test au catalase, puis en recherchant la présence du plasmide en confirmant la fluorescence sous la longueur d’onde correspondant à la protéine plasmidique fluorescente. Après avoir fait croître le symbiote bactérien naturel pendant la nuit, déposer 600 microlitres de la culture bactérienne sur huit à dix aérosols lipidiques de 10 millimètres, puis incuber les boîtes à l’obscurité et sans humidité à 25 degrés Celsius.Après deux jours, ajoutez 5 000 nématodes juvéniles infectieux dans 500 microlitres de milieu sur les pelouses bactériennes. Après avoir incubé les boîtes à 25 degrés Celsius pendant trois jours supplémentaires, déposez 20 microlitres d'eau sur une lame de microscope. Ensuite, utilisez un bâtonnet stérile pour prélever une petite quantité de nématodes à partir de la pelouse bactérienne.Placer le morceau dans l'eau pour permettre aux nématodes de nager hors du tissu. Observer cette lame en faible grossissement. Si des œufs et des femelles sont visibles, poursuivre : lorsque les femelles contiennent des œufs, ajouter quelques millilitres d'eau sur la surface des boîtes, agiter doucement les boîtes, puis verser l'eau dans un tube conique de 50 millilitres.Les nématodes doivent se détacher des boîtes et ne plus être visibles à la surface de la boîte. Laisser les nématodes se déposer au fond du tube, puis prélever l'excès d'eau à la pipette depuis le haut du tube et remplir à nouveau le tube avec de l'eau propre. Après avoir laissé les nématodes adultes se déposer et avoir retiré l'excès d'eau une fois de plus à la pipette, remplir les tubes coniques avec la solution d'œufs.Ensuite, mélanger les tubes par retournement doux pendant exactement 10 minutes à température ambiante. Après agitation, centrifuger immédiatement les tubes coniques pendant exactement 10 minutes à 1 250 G et à température ambiante, avec le frein activé. Puis décantation rapide du surnageant, resuspension du culot dans la solution d'œufs par pipetage et remplissage du tube conique avec de la solution d'œufs fraîche.Mélanger soigneusement la suspension d'œufs en retournant le tube trois à cinq fois, puis, immédiatement après, centrifuger les œufs et décanté le surnageant comme vient de l'être montré. Resuspendre le culot dans du milieu misogène, du bouillon ou du LB à l’aide d’une pipette, puis transférer la suspension d’œufs dans un tube conique de 15 millilitres. Remplir maintenant le tube de 15 millilitres avec du LB, laver les œufs trois fois dans le bouillon en utilisant la même technique rapide que celle qui vient d’être démontrée, puis diluer les œufs de P. nematode resuspendus à au moins 10 œufs par microlitre.Transférez les œufs dans une boîte de Pétri de six centimètres contenant cinq millilitres de LB et des antibiotiques contre les bactéries colonisatrices. La boîte peut être conservée enveloppée dans du perfil jusqu'à quatre jours après la croissance nocturne et la sélection des bactéries fluorescentes. Utilisez un bâtonnet stérile pour étaler 600 microlitres de la culture bactérienne sur des aérateurs lipidiques de 10 millimètres, puis incubez la culture à 25 degrés Celsius.Après deux jours, déposer de 500 à 5 000 œufs de nématodes sur chaque plaque lipidique. Si la plaque a été stockée, rincer les œufs dans 15 millilitres de LB comme vient d'être montré, au moins une fois avant d'ensemencer les œufs sur les pelotons bactériens préparés précédemment. Incuber ensuite les cocultures de nématodes et de bactéries à l'obscurité, sans humidité, à 25 degrés Celsius, jusqu'à l'apparition de jeunes infectieux sous forme d'un anneau blanc flou au bord de la plaque.Lorsque les juvéniles infectieux ont été observés, retirez le couvercle de la boîte de Pétri contenant l'agar lipidique et placez le fond de cette boîte dans le fond d'une autre boîte de Pétri vide de 100 millimètres par 20 millimètres. Ensuite, remplissez la boîte de Pétri avec suffisamment d'eau pour atteindre environ la moitié de la hauteur de la boîte plus petite, puis incubez le piège à eau jusqu'à ce que les juvéniles infectieux descendants soient sortis dans l'eau.Après avoir collecté les nématodes dans l'eau ou au stade de développement souhaité à partir de la pelouse bactérienne appropriée, dissolvez quelques grains d'ole dans 30 microlitres d'eau, puis ajoutez un à deux microlitres de cet agent paralysant pour chaque 50 microlitres d'échantillon de nématodes. Transférez ensuite environ 20 à 30 microlitres de l'échantillon de nématodes paralysés sur une lame de microscope et placez une lamelle au-dessus de l'échantillon. Observez les nématodes au microscope optique afin de vous assurer qu'ils se trouvent dans le champ de vision.Pour identifier la localisation bactérienne, photographiez les nématodes en microscopie à fluorescence ainsi qu'en microscopie optique, puis superposez les images. Il peut être nécessaire d'essayer plusieurs grossissements et différents champs de vue du nématode afin de localiser les bactéries.Une population de nématodes provenant de deux milieux a été comptée et évaluée pour la colonisation par le symbiote bactérien. Pour des statistiques robustes, il est préférable de compter au moins 100 nématodes par échantillon, avec au moins 30 appartenant à chaque catégorie, comme indiqué dans le tableau. Ces nématodes sont colonisés à un niveau d’environ 14,6 % lorsqu’ils sont cultivés sur gélose lipidique et à 68,6 % lorsqu’ils sont cultivés sur gélose au foie et aux reins.On a observé que d'autres espèces de nématodes et de bactéries présentaient des niveaux de colonisation différents. Ce schéma illustre l'aspect général des femelles Steiner NEMA. L'encart montre l'image en contraste interférentiel différentiel d'une femelle S fot graphic à un grossissement de 20 x.La flèche noire dans l'encart indique la vulve, tandis que les flèches blanches indiquent les œufs visibles. Cette image montre un œuf de nématode volt développé mais non éclos à un grossissement de 40 x, et ces œufs isolés de nématodes s Volta ont été observés à un grossissement de 10 x. Ici, des images microscopiques représentatives de nématodes Steiner Nima associés à des bactéries Xeno aptus sont présentées dans cette première image.Les nématodes d'Alvin étaient associés à leur symbiote bactérien exprimant la GFP afin de produire cette image composite. Une image en contraste de phase a été superposée à une image fluorescente. La flèche indique la présence de bactéries à l'intérieur du nématode juvénile infectieux.Cette image montre un nématode juvénile de S carpa capsi portant des bactéries X nla exprimant la GFP. L'image a été réalisée de manière similaire à l'image précédente et représente le nématode juvénile avec des bactéries marquées par la protéine fluorescente verte, visibles sous forme de bâtonnets verts localisés dans toute la lumière intestinale du nématode. En complément de la procédure décrite, d'autres méthodes, telles que la manipulation génétique du symbiote bactérien avant son association avec l'hôte nématode, peuvent être intégrées afin de répondre à d'autres questions, comme quelles sont les mécanismes moléculaires nécessaires à l'association hôte-microbe.

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