Name: Visualisation des Caenorhabditis elegans Utilisation du colorant lipophile Vital, Dii (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Découvrez une méthode de coloration de la cuticule chez Caenorhabditis elegans vivant utilisant le colorant lipophile fluorescent DiI. Cette technique simple et économique permet d'observer les structures annulaires et les alae avec une haute résolution.

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Nous tenons à remercier S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, et HC. Hsiao pour les discussions utiles. Ce travail a été financé par des fonds de démarrage du ministère TAMHSC de médecine moléculaire et cellulaire. Le champ composé et disque rotatif ont été achetés avec des fonds fournis par le ministère et le Bureau du doyen TAMHSC. Certaines souches ont été fournis par le Centre de Génétique Caenorhabditis, qui est financé par le National Center for Research Resources. pRF4 (rol-6 (su1006)) a été un don de feu A..

1. Préparation de DiI tache <ol><li> Préparer une solution stock de 20 mg / mL DII (Biotium, Inc, Hayward, CA) dans le DMF. Dii est sensible à la lumière, afin de protéger de la lumière DiI en enveloppant dans du papier. </li><li> Créer une dilution de travail de DiI en ajoutant 0,6 uL DiI stocks d'399,4 uL M9 pour chaque population. Cela devrait donner une dilution finale de travail de 30 ug / ml dans le DiI M9. Cela peut être étendu pour la coloration des populations multiples simultanément. Bouclier DiI de la lumière en enveloppant le tube (s) au fleuret. </li></ol> 2. Préparation de nématodes <ol><li> Utilisez une plaque de 60 mm contenant une population de nématodes non contaminée. Lavez les animaux de la plaque en utilisant une solution de 0,5% de Triton X-100 dans le tampon M9 en remuant doucement de liquide dans un mouvement circulaire sur la surface de la plaque à desserrer tous les animaux larvaire et adulte. Transfert de lavage dans une stérile de 1,5 ml tube. </li><li> Immédiatement spin-down des animaux à 2000 rpm pendant 30 sec. Retirez et jetez autant soutenirernatant que possible sans déranger la masse des animaux au fond du tube. </li><li> Afin de réduire résiduelle de Triton X-100, rincez les animaux en utilisant M9 tampon, spin, et enlever le surnageant. Répétez cette étape une fois. </li><li> Ajouter 400 ul de solution de travail dans DiI M9 dans le tube et brièvement au vortex pour remettre les animaux dans la solution. </li><li> Agiter le tube à 20 ° C à l'horizontale pendant 3 heures à 350 rpm dans un environnement lumineux protégé. Si désiré, les animaux peuvent être mis à incuber jusqu'à 16 heures pour la coloration. </li><li> Pour réduire la quantité de colorant non lié, ralentit les animaux à 2000 rpm pendant 20 sec. Retirez et jetez autant que possible le surnageant sans déranger la masse des animaux. </li><li> Remettre en suspension dans 400 animaux M9 pi de tampon et de verser le liquide sur une partie libre de bactéries d'une plaque de gélose ensemencés avec NGM OP50 E. coli. Permettre aux animaux de récupérer au moins 30 minutes. Pendant le temps de récupération, les animaux doivent ramper dans le liquide coloration DII et sur les aliments. Cette étaperéduit la fluorescence de fond auprès de DII libre. </li></ol> 3. Montage et l'observation des spécimens <ol><li> Faire fondre la gélose de 4% dans de l'eau en utilisant un autoclave ou un four micro-ondes. </li><li> Créer entretoises réutilisable, qui peut être utilisé pour assurer une épaisseur uniforme de la plaquette de gélose, par superposition de deux morceaux de ruban de laboratoire sur une lame de verre. Faites deux diapositives entretoise total. </li><li> Convenir d'une lame de verre propre entre deux lames d'espacement. Pipeter environ 150 uL (quatre gouttes) de 4% agar fondu sur le centre de la lame de verre propre. Couvrir rapidement l'agar fondu en utilisant une lame supplémentaire pour former un coussin d'agar. Retirez délicatement la lamelle, en gardant le pad centrée sur le haut de la montage des diapositives. </li><li> Pipeter environ 5 pi de nématodes anesthésie (100 uM - 1 lévamisole mM, par exemple) sur le pavé. </li><li> Mont de 8 à 12 animaux dans l'anesthésie et couvrir avec une lamelle de microscope. </li><li> Observez les animaux en utilisant un microscope confocal composé ou équipés d'au moins une l'objectivation 40x ve et une DsRed / TRITC (ou autre compatible) filtre. Le maximum d'excitation de fluorescence de Dii est 549 nm et son émission maximum est de 565 nm pour le colorant lié (Biotium, Inc, Hayward, CA). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Taches DiI la cuticule de type sauvage et mutant C. elegans. La surface cuticulaire contient anneaux séparés par des sillons circonférentielle et, dans certains stades, des crêtes longitudinales appelées ailes. Chaque phase de développement a des structures cuticulaires avec des compositions distinctes 2. Crêtes ou sillons des deux ailes du nez et anneaux fluorescence tache, selon la composition de surface, à travers les stades larvaire et adulte et reste visible jusqu'à une journée après la récupération en utilisant cette méthode. Taches de fond fluorescents sont parfois observées (figures 2F, G), mais pas systématiquement (Figure 1, Figure 2A-E, H, I). Toutes les images ont été prises avec disque rotatif confocale ou, lorsqu'il est apposé, à la microscopie à champ large composé (WF). ent "&gt; <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. DiI taches cuticules et les neurones écologiquement exposés. Bête de scène L2. Un grossissement de 630x. Parties d'image mosaïque ont été capturées à l'aide iVision-logiciels Mac (Technologies de BioVision, Exton, PA). Les images ont été jointes à l'aide d'Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc, San Jose, CA). Barre d'échelle = 10 um. DiI aussi par fluorescence des taches et des amphid phasmide neurones sensoriels de la tête et la queue, respectivement (flèches indiquent certains). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. DiI fluorescence des taches C. cuticules elegans à toutes les étapes du développement post-embryonnaire. Un grossissement de 630x. Barre d'échelle = 10 um. Coloration des animaux de type sauvage dans une L1); B) L2; C) Dauer; D) L3, E) L4 et F) stades adultes. Les arêtes du nez et annulaire sont tachés par fluorescence chez les animaux L1 et Dauer (A, C). DiI taches nervures annulaires chez les animaux L2(B). Annulaire sillons tache dans L3 et L4 animaux (D, E). Les sillons des ailes et des anneaux sont colorées chez les animaux adultes (FH). Alae sont composées de deux, cinq ou trois crêtes (en L1, Dauer, ou les animaux adultes, respectivement) qui courent le long de l'animal (flèches) 16. Annuli créer des arêtes circonférentielles autour de l'animal (pointes de flèches, F et J). La cuticule de l'adulte des animaux mutants affichage modérée défauts organisation cuticulaires (GH). G) Ridges des ailes sont discontinus (WF). H) arêtes du nez surnuméraires sont fondus et ramifiés ou bifurquée (WF). Mutants du gène du collagène présentent ailes et les défauts de l'organisation annulaire (IJ). I) Chez les animaux transgéniques surexprimant pRF4 (rol-6 (su1006)), les crêtes du mensonge ailes à un angle à la longueur de l'animal. J) anneaux au transgéniques surexprimant pRF4 animaux (rol-6 (su1006)) affiche un motif irrégulier. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Externestructures morphologiques al sont illuminés par coloration DII. grossissement de 630x. Barres d'échelle = 10 um. DiI souligne également d'autres caractéristiques extérieures, y compris A) pour adultes hermaphrodites vulve, B) les rayons pour adultes queue du mâle et de ventilateur, et C) hermaphrodites queue pointe (fourchue dans ce contexte mutant). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Cuticule Figure 4. Prend plus de tache avec DiI que les neurones écologiquement exposés. Un grossissement de 630x. Barre d'échelle = 10 um. Après deux heures de coloration, amphid (non représenté) et phasmide neurones sensoriels (flèches) sont suffisamment colorés. En revanche, la cuticule des animaux plus jeunes n'est que partiellement teinté en plaques (tête de flèche). <table border="1"><tbody><tr><td> Laver </td><td> Solution de coloration (+ DII) </td><td> Le temps d'incubation </td><td> Tachés cuticules </td></tr><tr><td> M9 + 0,5% TrIton X-100 </td><td> M9 + 0,5% de Triton X-100 </td><td> 2 heures </td><td> pas </td></tr><tr><td> M9 + 0,5% de Triton X-100 </td><td> M9 + 0,5% de Triton X-100 </td><td> 3 heures </td><td> pas </td></tr><tr><td> M9 + 0,5% de Triton X-100 </td><td> M9 </td><td> 2 heures </td><td> partielle </td></tr><tr><td> M9 + 0,5% de Triton X-100 </td><td> M9 </td><td> 3 heures </td><td> oui </td></tr><tr><td> M9 + 0,5% de Triton X-100 </td><td> H 2 0 </td><td> 2 heures </td><td> partielle </td></tr><tr><td> M9 + 0,5% de Triton X-100 </td><td> H 2 0 </td><td> 3 heures </td><td> oui </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Coloration cuticulaire dans des conditions différentes. Différentes solutions d'incubation et les délais ont été testés afin d'optimiser coloration cuticulaires chez les animaux. H 2 0, l'eau distillée stérile. Coloration partielle indique coloration inégale de la cuticule larvaire (figure 4), bien que les taches de la cuticule adulte consistently.

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</ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

La méthode de coloration DiI présenté ici permet d&#39;une façon relativement rapide et pratique pour visualiser la cuticule chez C. elegans. En réorientation et l&#39;optimisation d&#39;une méthode couramment utilisée pour l&#39;image écologiquement exposés neurones sensoriels 15,17, Dii peut être utilisé pour fluorescence tache deux ailes du nez et des structures annulaires (figures 1 et 2), ainsi que la vulve, queue du mâle, et la queue hermaphrodites pic (Figure 3). Nous avons trouvé que la solut...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Synonymes </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DiI </td><td> 1,1 &#39;-dioctadécyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate </td><td> Biotium, Inc </td><td> 60010 </td><td> Dilution de stock: 20 mg / ml dans le DMF dilution de travail: 30 mg / ml </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Diméthylformamide </td><td> Sigma-Aldrich, Inc </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Octylphénoxypolyéthoxyéthanol </td><td> VWR International, LLC. </td><td> EM-9410 </td><td></td></tr><tr><td> M9 </td><td> 22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 86mm de NaCl, 1 mM MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NGM &lt;/ Td&gt; <td> Milieu de croissance des nématodes </td><td> IPM Scientific, Inc </td><td> 11006-501 </td><td> Peut être préparé en suivant le protocole de gélose NGM 18 </td></tr><tr><td> L&#39;agar-agar </td><td></td><td> EMD Chemicals, Inc </td><td> 1,01614 </td><td> 4% dans de l&#39;eau </td></tr><tr><td> Lévamisole </td><td> Chlorhydrate de lévamisole </td><td> Sigma-Aldrich, Inc </td><td> 31742 </td><td> 100 M - 1 mM lévamisole tel que requis </td></tr><tr><td> Lames de microscope </td><td></td><td> VWR International, LLC. </td><td> 16005-106 </td><td></td></tr><tr><td> Lamelles de microscope </td><td></td><td> VWR International, LLC. </td><td> 16004-302 </td><td></td></tr><tr><td> Champ composé </td><td></td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> A1m </td><td> Utiliser des objectifs pour répondre aux besoins de l&#39;expérience </td></tr><tr><td> TRITC ou autre filtre compatibles </td><td> &amp;nbsp; </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> 49005 </td><td> HE - DsRed (TRITC/Cy3) a des ratés ensemble de filtres </td></tr></tbody></table>

visualisation des caenorhabditis elegans</emouvrages cuticules> utilisation du colorant lipophile vital, dii

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

La cuticule de C. elegans est une structure hautement résistante qui entoure l&#39;extérieur de 1-4 animaux. La cuticule protège non seulement l&#39;animal de l&#39;environnement, mais détermine aussi la forme du corps et joue un rôle dans la motilité 4-6. Plusieurs couches sécrétées par les cellules épidermiques comprennent la cuticule, y compris une couche lipidique externe 7. Crêtes circonférentielle dans la cuticule appelé pattern anneaux de la longueur de l&#39;animal et sont présents pendant toutes les étapes du développement 8. Alae sont des crêtes longitudinales qui sont présents lors des étapes spécifiques du développement, y compris L1, Dauer, et les stades adultes 2,9. Des mutations dans les gènes qui affectent l&#39;organisation du collagène cuticulaire peut modifier la structure et la morphologie cuticulaires corps animal 5,6,10,11. Alors que l&#39;imagerie par microscopie cuticulaires composé avec l&#39;optique DIC est possible, les méthodes actuelles qui mettent en évidence les structures cuticulaires comprennent fluorescentescent l&#39;expression du transgène 12, 13 coloration des anticorps, et la microscopie électronique 1. Étiqueté de germe de blé agglutinine (WGA) a également été utilisé pour visualiser les glycoprotéines cuticulaires, mais il est limité dans la résolution plus fine des structures cuticulaires 14. Coloration de la surface de la cuticule en utilisant un colorant fluorescent a été observée, mais jamais caractérisés en détail 15. Nous présentons une méthode pour visualiser en direct la cuticule C. elegans utilisant le colorant rouge fluorescent lipophile DII (1,1 &#39;-dioctadécyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), qui est couramment utilisé en C. elegans pour visualiser les neurones écologiquement exposés. Ce protocole optimisé pour la coloration de Dii est une méthode simple et robuste pour la visualisation haute résolution fluorescentes d&#39;anneaux, du nez, vulve, queue du mâle, et la queue hermaphrodites pic en C. elegans.

Nous présentons une méthode pour visualiser les cuticules en direct<em&gt; C. elegans</em&gt; En utilisant les colorants lipophiles rouge fluorescent DII (1,1 &#39;-dioctadécyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), qui est couramment utilisé dans<em&gt; C. elegans</em&gt; Pour visualiser les neurones écologiquement exposés. Avec ce protocole optimisé, les structures des ailes du nez et annulaire cuticulaires sont colorés par DII et observées par microscopie composé.

Visualisation des Caenorhabditis elegans</emOuvrages cuticules> Utilisation du colorant lipophile Vital, Dii

La cuticule de C. elegans est une structure hautement résistante qui entoure l'extérieur de l'animal1-4. La cuticule protège l'animal non seulement contre le...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser la cuticule chez des nématodes vivants transparents à l'aide du colorant lipophile rouge fluorescent dye eye. Cela est réalisé en préparant une population de nématodes pour la coloration. Ensuite, le colorant dye eye dilué est ajouté à la population, puis celle-ci est laissée à incuber.Ensuite, les animaux sont récupérés à partir de la solution de coloration. L'imagerie en fluorescence de l'exosquelette coloré au Dai révèle des détails de surface, notamment les structures reproductrices oculaires d'Ailey et d'Ann ainsi que d'autres caractéristiques morphologiques externes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes de visualisation de l'exosquelette chez cet organisme transparent, telles que l'imagerie directe, la fluorescence, l'expression de transgènes, la coloration immuno-histochimique, la microscopie électronique et l'agglutinine de germe de blé marquée, réside dans sa facilité d'exécution, sa rapidité relative, son faible coût et sa capacité à fournir une résolution remarquable des structures cuticulaires chez des animaux vivants.Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales dans de nombreux domaines utilisant le système modèle *Caenorhabditis elegans* et son cuticule, tels que la sécrétion cellulaire et l'organisation du cuticule, le développement des cellules épidermiques, les voies génétiques hétérochroniques, l'immunité innée, le développement de traits morphologiques et l'évolution des nématodes. La procédure sera démontrée par Robbie Schultz, un étudiant diplômant de mon laboratoire. Lorsque vous travaillez avec D Eye, gardez à l'esprit qu'il est sensible à la lumière.Protégez toujours l'œil D de la lumière en l'enveloppant dans du papier d'aluminium. Portez également des gants et une blouse de laboratoire car le DMF est toxique et le DAI est un car. Le cyanure Dai est très puissant.Une dilution de travail à concentration standard correspond à 30 microgrammes par millilitre de DII dans du M nine, et une seule population nécessite 400 microlitres de cette dilution de travail. Commencez avec une plaque de 60 millimètres contenant des nématodes non contaminés. Lavez les animaux de la plaque avec 1,5 millilitre de Triton X 100 à 0,5 %.Dans du tampon M neuf, faire tourner doucement le liquide en mouvements circulaires afin de détacher tous les animaux larvaires et adultes, puis transférer le lavage dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifuger immédiatement les animaux à 2000 tr/min pendant 30 secondes pour les regrouper au fond du tube. Éliminer le surnageant en laissant aussi peu que possible, sans déranger les animaux.Sois prudent, pas avide. Lavez les animaux avec un millilitre de M neuf. Centrifugez et retirez le surnageant.Répétez le lavage. Centrifugez à nouveau et retirez le surnageant. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de Dai à 30 microgrammes par millilitre dans M9 au tube.Vortexez brièvement le tube pour resuspendre les animaux. Ensuite, agitez le tube à 20 degrés Celsius en position horizontale pendant trois à seize heures à 350 tr/min dans un environnement protégé de la lumière. La durée de ces dernières étapes est importante.Étape préalable, le Triton X doit être lavé afin d'éliminer les lipides que le dai fixe. Deuxièmement, les animaux doivent être colorés dans la solution de colorant « eye » suffisamment longtemps pour permettre une coloration uniforme de la cuticule. Un peu plus tard, les animaux doivent être laissés en récupération sur la nourriture suffisamment longtemps pour éliminer le colorant « eye » non lié.À la fin de la coloration, centrifuger les animaux et éliminer la solution de colorant. Laver les animaux avec un millilitre de milieu M neuf. Pour éliminer le colorant non lié, centrifuger les animaux et retirer le surnageant.Résuspendre les animaux dans 400 microlitres de tampon M neuf et les verser sur une portion sans bactéries d'une microplaque NGM. Ensemencée avec E. coli OP50, laisser les animaux récupérer à l'obscurité pendant au moins 30 minutes, mais pas plus d'un jour, car la fluorescence du colorant s'atténue pendant le temps de récupération. Les animaux doivent ramper hors du liquide de coloration et vers la nourriture.Ces animaux sont plus faciles à imager car ils présentent une fluorescence de fond moins importante provenant du colorant libre dans l’œil. Commencez par préparer un tampon d’agarose sur une lame afin d’assurer une épaisseur uniforme du tampon, à l’aide de deux entretoises.Un espaceur est fabriqué en superposant deux morceaux de ruban adhésif de laboratoire sur une lame de verre. Les espaceurs peuvent être utilisés indéfiniment. Ensuite, placez une lame de verre propre dans le sens de la longueur entre deux lames espaceurs, puis ajoutez environ 150 microlitres de gélose quatre fondue à l’aide d’une pipette.Au centre de la lame en verre propre. Recouvrir rapidement l'AER fondu avec une lame supplémentaire placée perpendiculairement sur l'AER et les deux entretoises afin de former un coussin d'agar. Faire glisser délicatement la lame de couverture, en maintenant le coussin centré sur la partie supérieure de la lame de montage.Prélève maintenant cinq microlitres d'anesthésique pour nématodes sur la lame, place huit à douze animaux dans l'anesthésique et recouvre délicatement avec une lamelle de microscope. Observe les animaux à l'aide d'un microscope composé ou confocal équipé d'un objectif d'au moins 40 x et d'un filtre trissy ou d'un autre filtre compatible. Le maximum d'excitation fluorescente du colorant eye est de 549 nanomètres et son maximum d'émission est de 565 nanomètres.Pour les échantillons fixés, l'imagerie constitue la partie la plus délicate de ce protocole. Nous montrons comment monter les animaux pour l'imagerie, mais vous devez être correctement formé à l'utilisation du microscope composé ou confocal que vous allez utiliser. Nous avons constaté qu'il est préférable d'utiliser un objectif d'au moins 60 x de grossissement afin de bien distinguer les détails mis en évidence par la méthode de coloration.Chacune des images de cette section a été prise à l'aide d'un objectif 63 x chez l'embryon postérieur de C. elegans. La surface de la cuticule présente des anneaux séparés annuellement par des sillons circonférentiels et, à certains stades, des crêtes longitudinales appelées ailey. Chacune des images de cette section a été prise avec un objectif 63 x chez l'embryon postérieur de C. elegans.La surface de la cuticule présente des anneaux séparés par des sillons circonférentiels et, à certains stades, des crêtes longitudinales appelées aley. Chaque stade de développement possède des structures cuticulaires aux compositions et motifs distincts, et les crêtes ou sillons des aley et Aly se colorent de manière fluorescente, selon la composition de la surface.Pendant toutes les étapes larvaires et adultes utilisant cette méthode de coloration par immersion, les animaux restent visibles jusqu'à un jour après la récupération. Des taches fluorescentes de fond sont parfois observées, mais pas de manière systématique. Il s'agit de la cuticule d'animaux adultes mutés présentant des défauts modérés d'organisation cuticulaire.Les crêtes d'Ailey sont discontinues et supplémentaires. Les crêtes d'Ailey sont fusionnées et ramifiées ou bifurquées, un marqueur transgénique courant. Un allèle dominant roll six provoque une torsion de la cuticule, qui peut être observée au niveau de l'ailey et entraîner un dessin irrégulier des annuli.Dai colore également d'autres structures du tégument externe, notamment le vulve de l'hermaphrodite adulte et la queue du mâle adulte, ainsi que le fanon ; dai peut aussi révéler des anomalies subtiles de la morphologie externe, comme cette queue fourchue, en cas de coloration insuffisante. Par exemple, une coloration de deux heures conduit à une coloration cuticulaire irrégulière, bien que les neurones exposés à l'environnement puissent être colorés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures, sans compter l'observation microscopique, si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment colorer Caenorhabditis elegans avec le colorant DAPI afin d'observer la cuticule et d'autres structures morphologiques externes.

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