Visualisation des Caenorhabditis elegans Utilisation du colorant lipophile Vital, Dii

L’objectif global de cette procédure est de visualiser la cuticule dans une élégance marine vivante transparente à l’aide de l’œil à colorant lipophile fluorescent rouge. Ceci est accompli en préparant une population de nématodes pour la coloration. Ensuite, un œil de colorant dilué est ajouté à la population et on les laisse incuber.

Ensuite, les animaux sont récupérés de la solution de coloration. L’imagerie par fluorescence de la cuticule colorée au Dai montre des détails à la surface, y compris les structures reproductrices de l’œil d’Ailey et d’Ann et d’autres caractéristiques morphologiques externes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes de visualisation de la cuticule dans cet organisme transparent comme l’imagerie directe, la fluorescence, l’expression de transgènes, la coloration par anticorps, la microscopie électronique et l’agglutinine de germe de blé marquée est que cette technique est facile à réaliser, relativement rapide et peu coûteuse, et donne une belle résolution des structures cuticulaires chez les animaux vivants.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans de nombreux domaines qui utilisent le système de modèle d’élégance marine et sa cuticule, tels que la sécrétion cellulaire et l’organisation des cuticules, le développement des cellules épidermiques, les voies génétiques hétérochroniques, l’immunité innée, le développement des traits morphologiques et l’évolution des nématodes. Robbie Schultz, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Lorsque vous travaillez avec D Eye, gardez à l’esprit qu’il est sensible à la lumière.

Protégez toujours D eye de la lumière en l’enveloppant dans du papier d’aluminium. Portez également des gants et une blouse de laboratoire car le DMF est toxique et le DAI est une voiture. Le cyanure Dai est très puissant.

Une dilution de travail standard est de 30 microgrammes par millilitre de DII dans M neuf, et une seule population n’a besoin que de 400 microlitres de dilution de travail. Commencez avec une plaque de 60 millimètres peuplée de nématodes non contaminés. Lavez les animaux de l’assiette dans 1,5 millilitres de 0,5 % Triton X 100.

Dans le tampon M nine, faites tourner doucement le liquide en mouvements circulaires pour détacher tous les animaux larvaires et adultes, puis transférez le lavage dans un tube de 1,5 millilitre. Faites immédiatement tourner les animaux à 2000 RRP M pendant 30 secondes pour collecter les animaux au fond du tube. Jetez autant de surnageant que possible sans déranger les animaux.

Soyez prudent, pas gourmand. Lavez les animaux avec un millilitre de M neuf. Tournez vers le bas et retirez le surnageant.

Répétez le lavage. Tournez à nouveau vers le bas et retirez le surnageant. Ensuite, à 400 microlitres de 30 microgrammes par millilitre de Dai dans M neuf au tube.

Faites tourbillonner brièvement le tube pour remettre les animaux en suspension. Ensuite, secouez le tube à 20 degrés Celsius en position horizontale pendant trois à 16 heures à 350 RP M dans un environnement protégé de la lumière. Le moment choisi pour ces dernières étapes est important.

Tout d’abord, le Triton X doit être lavé avant d’éliminer les lipides que le dai lie. Deuxièmement, les animaux doivent être colorés dans une solution de colorant pour les yeux suffisamment longtemps pour permettre à la cuticule d’être uniformément colorée. Un peu plus tard, il faut laisser les animaux se rétablir avec de la nourriture suffisamment longtemps pour enlever l’œil délié.

À la fin de la coloration, faites tourner les animaux et retirez la solution de colorant. Lavez les animaux avec un millilitre de M neuf. Pour enlever le colorant non lié, faites tourner les animaux et retirez le surnageant.

Mettez les animaux en suspension dans 400 microlitres de tampon M nine et versez-les sur une portion exempte de bactéries d’une microplaque NGM. Ensemencer avec OP 50 E Coli permet aux animaux de récupérer dans l’obscurité pendant au moins 30 minutes, mais pas plus d’une journée car la fluorescence du colorant s’estompe pendant le temps de récupération. Les animaux doivent ramper pour s’éloigner du liquide colorant et se retrouver sur la nourriture.

Ces animaux sont plus faciles à imager car ils ont moins de fluorescence de fond de l’œil à colorant libre. Commencez par préparer un tampon agricole sur une diapositive pour assurer une épaisseur uniforme du tampon agricole utilisé. Deux entretoises.

Un intercalaire est fabriqué en superposant deux morceaux de ruban adhésif de laboratoire sur une lame de verre. Les entretoises peuvent être utilisées indéfiniment. Ensuite, disposez une lame de verre propre dans le sens de la longueur entre deux lames d’espacement, pipetez environ 150 microlitres de gélose fondue.

Au centre de la glissière en verre propre. Couvrez rapidement l’URAE fondu à l’aide d’une glissière supplémentaire placée perpendiculairement sur l’URAE et les deux entretoises pour former un tampon gélospé. Faites glisser délicatement la glissière du couvercle, en gardant le tampon centré sur le haut de la glissière de montage.

Maintenant, pipetez cinq microlitres d’anesthésique contre les nématodes sur le tampon, montez huit à 12 animaux dans l’anesthésique et recouvrez doucement avec une lamelle de microscope. Observez les animaux à l’aide d’un microscope composé ou confocal équipé d’un objectif d’au moins 40 x et d’un filtre trissy ou d’un autre filtre compatible. Le maximum d’excitation fluorescente de l’œil à colorant est de 549 nanomètres et son maximum d’émission est de 565 nanomètres.

Pour les matrices liées, l’imagerie est la partie la plus difficile de ce protocole. Nous montrons comment monter des animaux pour l’imagerie, mais vous devez être correctement formé sur le composé, ou le télescope confocal que vous utiliserez. Nous avons constaté que l’utilisation d’un objectif avec un grossissement d’au moins 60 x est préférable pour résoudre les détails éclairés par la méthode de coloration.

Chacune des images de cette section a été prise à l’aide d’un objectif 63 x en affiche d’élégance de sceau embryonnaire. La surface de la cuticule contient chaque année des sillons circonférentiels séparés par des sillons circonférentiels et, à certains stades, des crêtes longitudinales appelées ailey. Chacune des images de cette section a été prise avec un objectif 63 x en élégance C post-embryonnaire.

La surface de la cuticule contient des sillons annualisés séparés par des sillons circonférentiels et, à certains stades, des crêtes longitudinales appelées aley. Chaque stade de développement a des structures cuticulaires avec des compositions et des motifs distincts, des crêtes ou des sillons de coloration fluorescente et aly. En fonction de la composition de la surface.

À tous les stades larvaires et adultes utilisant cette méthode de teinture, ils restent visibles jusqu’à un jour après leur rétablissement. Des taches fluorescentes de fond sont parfois observées, mais pas régulièrement. Il s’agit de la cuticule des animaux mutants adultes présentant des défauts modérés d’organisation de la cuticule.

Les crêtes d’Ailey sont discontinues et surnuméraires. Les crêtes d’Ailey sont soudées et ramifiées ou bifurquées, un marqueur transgénique commun. Un rouleau dominant à six allèles provoque une torsion de la cuticule, qui peut être vue dans l’ailey et peut provoquer un motif irrégulier des anneaux.

Le Dai tache également d’autres structures de cuticules externes, y compris l’hermaphrodite adulte, la vulve et l’élévation de la queue du mâle adulte et le fan dai peut également mettre en évidence des défauts subtils dans la morphologie externe comme cette queue fourchue, coloration insuffisante. Par exemple, une coloration de deux heures conduit à une coloration cuticulaire inégale, bien que les neurones exposés à l’environnement puissent se colorer Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures, sans compter l’imagerie si elle est effectuée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de teindre l’élégance de la mer avec l’œil pour l’observation de la cuticule et d’autres structures morphologiques externes.