Gradient de densité multicouche de polymérisation (DGMP): une nouvelle technique pour la création multi-compartiment, échafaudages personnalisables pour l'ingénierie tissulaire

L’objectif global de cette procédure est de créer un échafaudage de culture cellulaire à plusieurs niveaux. Cette vidéo montrera comment produire une matrice de culture cellulaire 2D, en incorporant le peptide d’adhésion RGDS en couches alternées pour séparer les régions de deux cellules C 12. Ceci est accompli en connectant d’abord le peptide RGDS à une macro acro fidèle.

La combinaison de macro-peptides est ensuite étiquetée avec le colorant LOR pour permettre la visualisation du peptide contenant des couches de gels multicouches. La deuxième étape consiste à former les moules en les découpant dans une feuille de silicium et en les prenant en sandwich entre deux lames de verre immédiatement après l’autre, en mélangeant les composants individuels de chaque couche. Les solutions de cheville di acrl et de cheville d’acrl avec PEG RGDS Alexa three 50 sont alternativement superposées à l’intérieur des moules.

Les gels sont polymérisés par irradiation UV. La dernière étape consiste à ensemencer deux cellules C 12 sur des gels multicouches 2D afin d’examiner comment la composition de la matrice affecte la croissance et la fixation des cellules. En fin de compte, la microscopie à fond clair et à fluorescence est utilisée pour visualiser la croissance sélective des cellules C deux C 12 sur les échafaudages.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’il s’agit d’une méthode simple et rentable pour créer des matrices de culture cellulaire 2D et 3D multicouches. Il ne repose pas sur la nécessité d’une instrumentation coûteuse. Alors que les interfaces entre les couches sont contiguës et structurellement intégrées.

Il n’y a pas de mélange entre les composants des couches individuelles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés telles que la façon dont les cellules migrent et se polarisent en réponse à des signaux biologiques, chimiques et mécaniques structurés. Cette méthode peut fournir un aperçu en douceur de la migration et de la différenciation cellulaires et peut être appliquée à d’autres systèmes tels que la direction de la nouvelle excroissance droite et la synaptogenèse des cellules souches neuronales.

Pour commencer cette procédure, combinez le peptide RGDS et l’ester méthylique de succinylcarbo de l’huile acro dans un rapport molaire de un à deux à un dans le DMSO sec sous Argonne. Ajoutez ensuite du NN diop, de la propylméthylamine ou du D-I-P-E-A à un rapport de deux à une molaire par rapport à l’aquilo PEG SCM pour faciliter la réaction, confirmez la conjugaison de la molécule aquilo PEG RGDS à l’aide de la spectrométrie de masse TOF moisie. Pour cela séparément, ajoutez un microlitre de la solution réactionnelle AQUILO PEG RGDS et un microlitre d’aquilo PEG SCM non réactif à différents endroits de la cible moisie.

Laissez-les sécher tous les deux. Préparez ensuite une solution saturée de matrice moisie universelle dans un vortex THF pendant une minute et ajoutez un microlitre aux deux mêmes endroits. Laissez-les sécher tous les deux.

Ensuite, chargez les échantillons. Effectuez des analyses résistantes à la moisissure avec un laser de 60 hertz à une puissance d’environ 19 % à l’aide des algorithmes de soustraction de la ligne de base SAVIS gole et de détection des pics d’OID. Le poids moléculaire de l’acro PEG RGDS doit être décalé vers la droite, correspondant à la variation de masse due au peptide lié de manière covalente.

L’étape suivante consiste à conjuguer le fluor en ajoutant une quantité équimolaire de LOR trois 50 acide carboxylique aspirent un ester médial par rapport à l’aquilo PEG SCM dissous dans un volume minimal de DMSO à la solution réactionnelle aquilo PEG RGDS Sous l’argon incuber pendant la nuit à température ambiante. Ensuite, purifiez la cheville d’huile acro RGD S3 50 en dialysant contre de l’eau de colorant à quatre degrés Celsius à l’aide d’une cassette de dialyse de coupure de poids moléculaire de 3 500 DAU. Continuez à dialyser pendant 48 heures en utilisant un rapport volumétrique de 1001, en échangeant le dialysat froid au moins deux fois par jour.

Le produit est ensuite purifié par stérilisation par filtre à travers un filtre à seringue de 0,22 micron. Enfin, dans un environnement stérile, aliquote la cheville d’huile acro purifiée stérile RGD S3 50 dans des microtubes à centrifuger stériles pré-pondérés. Scellez les microtubes de centrifugation ouverts dans le tube de reniflard stérile.

Lyophiliser les échantillons et les stocker scellés avec un film de paraffine à moins 20 degrés Celsius. Prélaver les lames dans du méthanol à 100 % et les faire sécher dans un four à 80 degrés Celsius jusqu’à ce que le liquide s’évapore. Placez ensuite un plat contenant les lames de verre dans une hotte et ajoutez 250 microlitres de couche sigma à chaque lame.

Balancez doucement les lames pendant 30 secondes afin de recouvrir toute la surface. Ensuite, rincez abondamment les lames revêtues avec du méthanol à 100 %, puis de l’eau de lavage et de l’eau distillée, en les trempant deux fois pendant cinq minutes dans au moins 10 millilitres d’eau. Une fois rincées, laissez les lames sécher à l’air libre.

Préparez des espaces en silicone de 0,8 millimètre d’épaisseur en coupant une feuille de silicone aux mêmes dimensions que les lames de verre. Ensuite, à l’aide de poinçons de biopsie, faites des trous de 10 millimètres ou huit millimètres dans le silicone pour maintenir les échafaudages à l’aide d’une lame de rasoir. Faites des canaux d’environ deux millimètres en haut du moule pour permettre l’ajout de matériau d’échafaudage.

Ensuite, autoclavez les espaces en silicone et recouche les lames de verre traitées sigma pour les stériliser. Stérilisez également les matériaux supplémentaires pour la coulée des gels, tels que les tubes einor et les pinces. Dans un filtre à capot de culture tissulaire, stérilisez une solution mère de Peg di aquil à l’aide d’une seringue stérile d’un millilitre et d’un filtre de 0,2 micron

Commencez par formuler des solutions de prépolymère PEG à 15 % de rapport poids/volume pour chaque couche respective dans des tubes de micro-déchets ambrés individuels en combinant l’acrl à 50 % de PEG D avec différentes quantités de solution mère stérile de DAL à 60 % IO PBS et de photo-initiateur pour obtenir des concentrations finales variables de 10 %, 20 %, 30 % et 40 % I, mélangez soigneusement les solutions pour préparer la solution de prépolymère PEG à 15 % marquée par fluorescence, combiner 50 % de PEG di aquil et d’aquilo PEG RGD S3 50 à une concentration finale de huit millimolaires avec une solution mère d’IO Dal PBS et un photo-initiateur dans des tubes Microview ambrés pour obtenir des concentrations de 15 %, 25 % et 35 % d’IO IAL, bien mélanger les solutions. Ensuite, assemblez le moule en plaçant une entretoise prédécoupée entre deux lames de verre traitées au sigma co et fixez-la à l’aide de pinces. Une fois le moule assemblé, coulez un gel en couches en ajoutant d’abord 10 microlitres de la solution à 40 %, puis 10 microlitres de la solution à 35 % marquée par fluorescence.

Répétez la superposition alternée pour obtenir plusieurs couches. Ensuite, irradiez le moule avec une lumière de 365 nanomètres pendant trois minutes. À l’aide d’une lampe UV portable de 9 000 pixels, laissez les hydrogels polymérisés durcir pendant cinq minutes.

Retirez ensuite les pinces et soulevez doucement la glissière supérieure en verre et le moule. Le gradient de densité stratifié. Les gels de polymérisation multicouche ou DG MP resteront sur les lames.

À l’aide d’une spatule stérile, retirez soigneusement les gels du moule et placez-les dans un tube de 50 millilitres contenant du DMEM stérile. Lavez les gels polymérisés à l’aide d’un rapport volumétrique de 1000 à un de DMEM pendant 48 heures avec deux échanges de tampon par jour. Cela supprimera toute densité, modificateur, photo-initiateur et prépolymère réactif.

Conservez ensuite les gels DGMP dans du DMEM complété par de la streptomycine à 1 % de pénicilline. Pour visualiser les couches alternées, disposez le gel DGMP le long d’une règle sur le plateau d’échantillons d’une unité de documentation sur gel. Ensuite, exposez et imagez les gels à l’aide d’Alexa : trois 50 bandes alternées sombres et bleues dans l’hydrogel DGMP démontrent la formation de couches discrètes de composition chimique distincte.

Pour préparer les gels DGMP pour la culture cellulaire, insérez-les délicatement dans les puits d’une plaque de culture cellulaire de 48 puits. À l’aide d’un grattoir cellulaire stérile et rincez-les trois fois dans un milieu de culture cellulaire. Ensuite, récoltez deux myoblastes C 12 à partir d’une plaque de culture cellulaire de 100 millimètres lorsqu’ils sont confluents à 60 %.

Pour ce faire, rincez la plaque trois fois avec du PBS préchauffé. Ajoutez ensuite un millilitre de 0,25 % de trips dans de l’EDTA et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant deux minutes. Une fois que les cellules se sont détachées, ajoutez un millilitre de milieu de culture préchauffé et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres pour la centrifugation.

Une fois que les cellules ont été granulées, enfermez-les dans un milieu de croissance et comptez les cellules vivantes en ajoutant du triam blue et en utilisant un compteur de cellules TC 10. Ensuite, ensemencez l’échafaudage DG MP avec des myoblastes C deux C 12 et incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Confirmer la fixation de deux myoblastes C 12 sur le RGDS contenant des couches de gels DGMP à l’aide de l’épifluorescence et de la microscopie à contraste de phase.

Les couches alternées de gels DGMP peuvent contenir divers peptides tels que le RGDS illustré à droite, qui soutient l’attachement et la croissance cellulaires. La couche de gauche, cependant, ne contenait aucun peptide d’attachement cellulaire et les cellules n’ont pas survécu dans cette région. IO diol peut affecter la rigidité du gel.

Ici, le module d’élasticité a été mesuré à l’aide de la microscopie à force atomique. Une augmentation de 60 % de la rigidité a été observée lors de l’utilisation de 30 % d’IAL dans cette formulation de gel, l’effet de l’IAL sur la rigidité du gel peut varier en fonction des matériaux utilisés Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler la séquence des couches. La couche contenant la plus grande quantité de null IEX sera en bas, tandis que la couche avec la quantité la plus faible de null IEX sera en haut.

N’oubliez jamais d’ajouter le photo-initiateur à la fin pour éviter la polymérisation à partir de la lumière ambiante. Avec nos collaborateurs, nous adaptons cette technique pour organiser l’excroissance des neurites en 3D. Cela permettra de comparer les cellules neuroprogénitrices dérivées d’individus en bonne santé et de patients atteints de troubles neurodéveloppementaux.

N’oubliez pas que travailler avec la lumière ultraviolette peut être dangereux. Portez des lunettes de protection UV lors de l’étape de réticulation.