Name: Construction de feuilles dhydrogel modulaire pour micropatterned macro-échelle 3D Cellular architecture (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-11T10:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Découvrez la fabrication de feuilles d'hydrogel modulaires pour créer des architectures cellulaires 3D macro-échelle en ingénierie tissulaire. Cette méthode permet de générer des microenvironnements cellulaires contrôlés sans coût élevé.

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Cette recherche a été soutenue par un programme national de laboratoire de recherche de premier plan (subvention NRF-2013R1A2A1A05006378) par l’intermédiaire de la Fondation nationale de recherche de Corée financé par le ministère des Sciences, des TIC et de la Planification future. Les auteurs reconnaissent également un programme de soins de santé KAIST Systems.

1. Préparation des moules microélectrodes et Hydrogels <ol><li> Produire des motifs à petite échelle souhaités en utilisant SU-8 sur la surface d&#39;une tranche de silicium par l&#39;intermédiaire d&#39;un en deux étapes de photolithographie 15,17 technique standard pour la coulée des moules en PDMS. L&#39;exemple représenté utilise un maillage du foie lobule-like (Figure 1). </li><li> Peser PDMS et d&#39;une solution d&#39;agent de durcissement avec un rapport de 1: 5 (à savoir, 12,5 g de PDMS et 2,5 g d&#39;agent de durcissement). </li><li> Mélanger les 15 g de la solution soigneusement, dégazer les bulles dans une chambre à vide, puis la solution mixte se répandre sur une surface à motif fin de la tranche de silicium de manière homogène dans un plat feuille de coulée. </li><li> Placer la tranche de silicium sur une plaque chauffée à 65 ° C pendant 90 min sur une surface plane pour traiter les PDMS. </li><li> Retirer les PDMS durcis de la boîte de coulée et la plaque de silicium. </li><li> Coupez les bords des PDMS et le placer sur une boîte de Pétri de 100 mm de diamètre avecmicroélectrodes le côté vers le haut. </li><li> Laver les PDMS durcis microélectrodes sur la boîte de Pétri en utilisant 70% d&#39;éthanol et d&#39;eau distillée pour la stérilisation primaire. Ensuite, séchez-les complètement pendant 10 min dans un four à 65 ° C. </li><li> Dissoudre et mélanger O / N 3 g de tensioactif non-ionique en poudre a dans 100 ml d&#39;eau distillée, la création d&#39;un 3% (p / v) de solution de revêtement. </li><li> Placer les moules en PDMS microélectrodes un filtre à plasma et les nettoyer pendant 1 min (85 W, 0,73 mbar) pour créer une surface hydrophile, afin de faciliter l&#39;addition de liquides aqueux. Ensuite, enduire la surface des PDMS avec la solution 100 ml de tensioactif pendant au moins 3 h (ORO / N) à l&#39;aide d&#39;une bascule de laboratoire. </li><li> Laver la solution d&#39;agent tensio-actif des moules PDMS et les sécher complètement dans un four à 65 ° C pendant 10 min. Ensuite, chaque moule microélectrodes stériliser par exposition à un rayonnement ultraviolet (UV) pendant 30 min. </li></ol> 2. Préparer la suspension de cellules dans un hydrogel Précurseur <ol><li> Àpréparer précurseur d&#39;hydrogel, dissoudre 0,1 g de poudre d&#39;alginate de sodium dans 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), la création d&#39;une 1% (p / v) d&#39;alginate précurseur. Pour dissoudre la poudre complètement, incuber et les mélanger O / N. </li><li> Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 um reliée à une seringue de 1 ml. </li><li> Culture des cellules HepG2 dans du milieu d&#39;Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine sur une boîte de culture tissulaire classique jusqu&#39;à ce que 70% - 80% de confluence dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 à 37 ° C . </li><li> Laver les cellules une fois à l&#39;aide de PBS, puis les trypsiniser en ajoutant 1 ml de 0,05% de trypsine-EDTA pendant 4 min dans un incubateur à CO2 humidifié à 5% à 37 ° C. Centrifuger les cellules récoltées à partir de la boîte de culture à 250 g pendant 3 min et remettre en suspension en utilisant 1 ml de PBS ci-après élimination du surnageant. </li><li> Comptez le nombre de cellules réparties simples dans PBS en utilisant une cellule automatiséecompteur. </li><li> Après centrifugation à 250 g pendant 3 min et l&#39;enlèvement du PBS, ajouter 1 ml de 1% (p / v) de solution d&#39;alginate de sodium pour le culot cellulaire restant et mélanger doucement en utilisant les pipetage. La densité d&#39;ensemencement des cellules finale doit être de 5 x 10 6 - 10 7 cellules / ml. Incuber la suspension de cellules / hydrogel dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2 à 37 ° C. </li></ol> 3. Chargement et la réticulation de Cell / hydrogel Suspension <ol><li> Dissoudre 1,47 g de chlorure de calcium dihydraté dans 100 ml d&#39;ddH 2 O pour produire un réactif de reticulation (par exemple, 100 mM de CaCl 2 · 2H 2 O dans ddH 2 O). </li><li> Rincez l&#39;intérieur d&#39;un humidificateur avec transducteur ultrasonique en utilisant 70% d&#39;éthanol, et le remplir avec 200 ml de réactif de réticulation. L&#39;humidificateur est de 110 mm de large, 300 mm de long et 170 mm de profondeur (par exemple, 110 mm x 300 mm x 170 mm (L x H x D)). </li><li> Placez les PDMS micropatternedmoules dans un nettoyeur à plasma et les nettoyer pendant 1 min à 85 W pour créer une surface hydrophile. </li><li> Charger régulièrement 7,2 pi de la suspension de cellules / hydrogel bien mélangé au bord de la micromotif dans le moule. L&#39;exemple représenté utilise un maillage du foie lobule-like (Figure 1). Le volume de la suspension dépend du modèle topographique. </li><li> Pour atteindre la gélification de la suspension de cellules / hydrogel, allumer l&#39;humidificateur et vérifiez que l&#39;humidificateur produit une brume du réactif de réticulation. Pulvériser le réactif de reticulation sur le précurseur d&#39;hydrogel pendant 5 min, recouvrant la surface topographique des moules PDMS dans une plage de 5 cm. Note: distances plus longues et plus courte de 5 cm pourraient provoquer la gélification incomplète et inégale, respectivement. Assurez-vous que l&#39;humidificateur a un taux de pulvérisation de 250 ml / h, 20 ml de production de brouillard du réactif de reticulation à 5 min. </li><li> Après le processus de réticulation, éteignez l&#39;humidificateur et remplir le mo PDMSlds avec PBS. </li></ol> 4. Traitement des feuilles simples hydrogel modulaire <ol><li> Détachez chaque feuille d&#39;hydrogel durcie des moules microélectrodes via pipetage PBS doucement autour de la feuille d&#39;hydrogel à l&#39;aide d&#39;une pipette de 200 pi. </li><li> Pick-up chaque feuille d&#39;hydrogel flottante utilisant un 1000 ul pointe de la pipette end end coupe. Chaque feuille d&#39;hydrogel de maille lobule-comme le foie a des dimensions de 8 mm x 8,7 mm, et être 100 - 200 um d&#39;épaisseur. </li><li> Transfert d&#39;une seule couche de la feuille d&#39;hydrogel dans 1 ml de DMEM dans une plaque à 12 puits, et la culture des cellules in vitro de manière flottante à l&#39;aide de l&#39;hydrogel construire en tant que composant de l&#39;unité dans la plaque à 12 puits pendant une semaine dans un 5 % de CO 2 incubateur humidifié à 37 ° C. Remplacez le milieu de culture tous les autres jours. </li></ol> 5. Les Fiches hydrogel Assemblée des multi-couches <ol><li> Répétez les étapes 1.1 à 1.5 pour produire un cadre de PDMS avec des dimensions de 18 mm x 18 mm x 4 mm (L xH x D), et qui contient des structures de 170 um haute pilier à la surface inférieure. Utiliser 42 g du mélange de PDMS et d&#39;agent de durcissement, avec le même rapport que dans l&#39;étape 1.2. Placez un moule en polycarbonate spécialisée sur la plaquette de silicium pour le cadre PDMS afin de créer un cadre intérieur avec des dimensions de 8 mm x 9 mm x 2 mm (L x H x D). </li><li> Stériliser le cadre PDMS et 180 um-pores papiers filtres de nylon immergé dans l&#39;eau distillée et des pinces dans un autoclave pendant 15 min à 121 ° C. </li><li> Placez le cadre PDMS stérilisée sur un quart d&#39;un morceau de papier filtre en nylon (avec un diamètre de 5 cm) dans une boîte de Pétri de diamètre 60 mm. </li><li> Transférer une feuille d&#39;hydrogel modulaire à l&#39;intérieur du cadre PDMS en utilisant un 1000 ul pointe de la pipette final-cut. Les feuilles d&#39;hydrogel utilisées pour l&#39;assemblage doivent être cultivées pendant au moins un jour après qu&#39;ils ont été fabriqués. </li><li> Alignez le bord de chaque feuille d&#39;hydrogel modulaire avec le cadre PDMS en utilisant un 200 pi pointe de la pipette vide. </li><li> Répéter les étapes 5.4 et 5.5 en utilisant des feuilles d&#39;hydrogel modulaires pour former une pile de 4 - 6 couches. </li><li> Retirer le milieu de culture par écoulement à travers lui les structures de pilier à la partie inférieure du cadre PDMS. Ajouter ensuite 2 ul de solution d&#39;alginate (2% p / v) à un coin de la construction multicouche. </li><li> Pulvériser un brouillard du réactif de réticulation pendant 30 secondes sur le produit d&#39;assemblage multi-couches pour fixer les bords de chaque couche avec ceux d&#39;une autre. Utilisez 2 ml de brume du réactif de réticulation (à un taux de pulvérisation de 250 ml / h). </li><li> Rincer la construction multi-couches doucement avec 400 ul DMEM et enlever le cadre PDMS avec des pincettes. </li><li> Détachez la construction multi-couches du papier filtre en essuyant doucement avec une cellule de levage après l&#39;addition de 4 ml de DMEM. </li><li> Transférer la construction à couches multiples pour une plaque à 6 puits contenant 3 ml de milieu DMEM en utilisant un papier filtre, et la culture des cellules in vitro de manière flottante, avec la construction d&#39;hydrogel en tant queun échafaudage cellulaire multi-échelle dans la plaque de 6 puits plus d&#39;une semaine dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2 à 37 ° C. Remplacez le milieu de culture tous les autres jours. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole fournit une méthode simple de fabrication de feuilles d&#39;hydrogel modulaires, et de les assembler pour former des échafaudages cellulaires 3D. Pour construire des structures d&#39;alginate à motifs claires dans un court laps de temps, nous devrions identifier un processus de réticulation qui peut créer des structures suffisamment rigides pour maintenir les micropatterns complexes du moule, ainsi que de maintenir la viabilité des cellules et le métabolisme. Nous avons développ...

Les hydrogels sont particulièrement prometteurs biomatériaux, et devraient être importantes en biologie fondamentale, essais pharmacologiques et de la médecine. 1 Biofabrication de constructions cellulaires à base hydrogel a été suggéré de réduire l&#39;utilisation de l&#39;expérimentation animale, 2,3 remplacer des tissus transplantables, 4 et améliorer tests cellulaires. 5,6 contenant de l&#39;eau-hydrocarbures) (matériaux viscoélastiques (gels) permettent à un grand nombre de cellules à encapsuler et maintenu dans une structure d&#39;échafaudage pour contrôler le microenvironnement cellulaire 3D. En combinaison avec la direction des technologies microfluidiques ou micromodelage, la géométrie des constructions d&#39;hydrogel peut être contrôlée avec précision à l&#39;échelle cellulaire. A ce jour, une variété de formes d&#39;hydrogels, notamment des particules, 7 - 9, 10 fibres - 12 et des feuilles, des 13 - 15 ont été utilisés comme unités de construction dans bottom-up approcourbatures à la fabrication de la macro-échelle des architectures multi-cellulaires. Les deux particules et fibres à base hydrogel ont été facilement et rapidement fabriqués pour des applications comme les environnements cellulaires micro-échelle, avec des commandes fluidiques utilisant des dispositifs microfluidiques. Cependant, comme les unités de base de tissus d&#39;ingénierie, ce serait compliqué pour les réorganiser et d&#39;élargir leur volume comme des constructions macro-échelle. 16 Il est plus difficile de parvenir à des constructions macro-échelle que de produire des modules de base de taille micronique. Unités de constructions à base d&#39;hydrogel-feuille peuvent être utilisés pour augmenter le volume des échafaudages via un processus d&#39;assemblage simple. Par voie de conséquence, des couches empilées de feuilles d&#39;hydrogel fournissent non seulement une augmentation volumétrique, mais aussi une extension géométrique dans un espace 3D. Nous avons précédemment rapporté un procédé de fabrication de feuilles d&#39;hydrogel microélectrodes, de 13 à 15 ainsi que leur assemblage en multi-layarchitectures cellulaires Ered. La technique permet micromodelage complexe et de la conception modulaire des constructions cellulaires par l&#39;intermédiaire d&#39;un processus d&#39;empilement de structures multicouches. Grâce à la fabrication de feuilles empilées d&#39;hydrogel modulaires, qui sont microélectrodes, un système de culture cellulaire 3D avec un microenvironnement cellulaire macro-échelle contrôlée peut être réalisée. Ce protocole de vidéo décrit un procédé simple mais puissant de fabrication qui peut être utilisé pour construire des feuilles d&#39;hydrogel modulaires, basé sur la lignée cellulaire de carcinome de foie humain (HepG2). Nous démontrons ici manipulation simple de ces feuilles d&#39;hydrogel modulaires motifs, et leur assemblage dans une structure multi-couches.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Tensioactif non ionique en poudre&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sel de sodium d’acide alginique, faible viscosité</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25266</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Humidificateur à ultrasons</td><td>MediHeim</td><td>MH-2800</td><td>Équipement modifié, Débit maximal pulvérisé : 250 ml/h</td></tr><tr><td>Filtre en filet de nylon hydrofilique, 180 &mu ; m</td><td>EMD Millipore</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr><td>Moule</td><td></td><td></td><td>en polycarbonate Moule personnalisé pour la fabrication d’un modèle de cadre PDMS</td></tr></tbody></table>

construction de feuilles d&#39;hydrogel modulaire pour micropatterned macro-échelle 3d cellular architecture

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels peuvent être modelés à la micro-échelle en utilisant des technologies microfluidiques ou micromodelage de fournir une vivo -comme géométrie en trois dimensions (3D) des tissus. Les constructions 3D résultant base d&#39;hydrogel-cellulaires ont été introduits comme une alternative à l&#39;expérimentation animale pour les études biologiques de pointe, essais pharmacologiques et les applications de transplantation d&#39;organes. Bien que les particules et fibres à base hydrogel peuvent être facilement fabriqués, il est difficile de les manipuler pour la reconstruction tissulaire. Dans cette vidéo, nous décrivons un procédé de fabrication de feuilles d&#39;hydrogel d&#39;alginate microélectrodes, ainsi que leur assemblage pour former un système de culture cellulaire 3D macro-échelle avec un microenvironnement cellulaire contrôlée. Utilisation d&#39;une forme de brouillard de l&#39;agent gélifiant de calcium, de minces feuilles d&#39;hydrogel peuvent être facilement générées avec une épaisseur dans la plage de 100 - 200 pm, et avec micropatterns précises. Les cellules peuvent ensuite être cultivées à l&#39;orientation géométrique des feuilles d&#39;hydrogel dansconditions autonome. En outre, les feuilles d&#39;hydrogel peuvent être facilement manipulées en utilisant une micropipette avec une extrémité de bout en coupe, et peuvent être assemblés en structures multicouches en les empilant l&#39;aide d&#39;un polydiméthylsiloxane à motifs (PDMS) de trame. Ces feuilles d&#39;hydrogel modulaires, qui peuvent être fabriqués en utilisant un procédé facile, ont des applications potentielles des essais in vitro de médicaments et les études biologiques, y compris les études fonctionnelles des micro- et macrostructure et la reconstruction des tissus.

Nous avons décrit la fabrication et la manipulation des feuilles d&#39;hydrogel autoportante cellulaires. Comme le montre la Figure 1, nous avons fabriqué des moules PDMS microélectrodes, et un hydrogel contenant les cellules a été chargé sur la surface hydrophile de ces moules et réticulée en utilisant un humidificateur pour générer un brouillard d&#39;aérosol de l&#39;agent gélifiant. Suite à la publication des moules, les cellules HepG2 ont été cultivées dans autoport...

Nous décrivons la fabrication de feuilles d’hydrogel à micromotifs à l’aide d’un processus simple, qui peut être assemblé et manipulé sous une forme autonome. À l’aide de ces feuilles d’hydrogel modulaires, un système de culture cellulaire 3D simple à l’échelle macroscopique peut être généré avec un microenvironnement cellulaire contrôlé.

Construction de feuilles d&#39;hydrogel modulaire pour micropatterned macro-échelle 3D Cellular architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer la fabrication simple, la manipulation et l'assemblage de feuilles modulaires d'hydrogel pour un système de culture cellulaire en 3D. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du génie tissulaire, telles que la manière de créer des tissus ingénierisés fonctionnels plus proches de l'in vivo grâce à des micro-environnements cultivés. Le principal avantage de cette technique est que des constructions cellulaires en hydrogel peuvent être générées sans aucun coût supplémentaire élevé.Les conditions de culture cellulaire en 3D dépendront de chaque feuille hydrogel modulaire. Les implications de cette technique s'étendent à l'amélioration des tests cellulaires et des études biologiques, car elle peut fournir diverses géométries et compositions de micro- et macro-environnements cellulaires en 3D. Bien que cette méthode puisse offrir des informations sur les tests cellulaires in vitro, elle peut également être appliquée à un autre système, comme un support transplantable de modèle tissulaire en 3D.Commencez par produire les motifs à micro-échelle souhaités à l'aide de techniques standard de photolithographie. L'exemple montré dans cette vidéo utilisera un motif en treillis semblable à un lobule hépatique, comme celui illustré ici. Ensuite, pesez 2,5 grammes de PDMS et 2,5 grammes de la solution d'agent de réticulation, puis mélangez soigneusement les composants.Dégazer la solution dans une chambre à vide, puis étaler uniformément la solution mixte sur la surface micropatternée de la tranche de silicium à l'aide d'un plat d'écoulement en aluminium. Ensuite, polymériser le PDMS en plaçant le plat sur une plaque chauffante à 65 degrés Celsius pendant 90 minutes. Une fois la polymérisation terminée, retirer le PDMS du plat d'écoulement et le décoller soigneusement de la tranche de silicium.Découpez les bords du PDMS et placez la partie structurée sur une boîte de Pétri de 100 millimètres de diamètre, côté micropattern vers le haut. Ensuite, lavez le PDMS micropaterné avec de l'éthanol à 70 %, puis avec de l'eau distillée, pour une stérilisation primaire. Par la suite, faites sécher complètement l'ensemble pendant 10 minutes dans une étuve à 65 degrés Celsius.Ensuite, placer le moule micropaterné en PDMS dans un nettoyeur à plasma et le nettoyer pendant une minute afin de créer une surface hydrophile. Cela facilitera le chargement des liquides aqueux. Puis recouvrir la surface du PDMS de 100 millilitres de la solution de tensioactif indiquée dans le tableau des matériaux.Incuber les échantillons sur un agitateur de laboratoire pendant au moins trois heures. Ensuite, laver la solution de tensioactif des moules en PDMS à l'aide d'eau stérile, puis les sécher complètement dans une étuve à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Puis, stériliser chaque moule micromodélisé en l'exposant à une radiation ultraviolette pendant 30 minutes.Commencez par cultiver les cellules HepG2 en utilisant des techniques standard. Une fois que les cellules atteignent une confluence de 70 à 80 %, lavez les cellules une fois à l’aide de PBS. Ensuite, récoltez les cellules en ajoutant un millilitre de trypsine-EDTA 0,5 % et incubez-les pendant quatre minutes à 37 degrés Celsius.Une fois détachées, recueillir les cellules dans un tube de centrifugeuse et former un culot à 250 g pendant trois minutes. Éliminer le surnageant, puis resuspendre les cellules dans un millilitre de PBS. Compter le nombre de cellules simples et dispersées dans le PBS à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé.Ensuite, centrifuger à nouveau les cellules à 250 g pendant trois minutes. Éliminer le surnageant de PBS et ajouter une quantité suffisante d'une solution d'alginate de sodium à un pour cent aux cellules afin d'obtenir une densité d'ensemencement finale comprise entre cinq et dix millions de cellules par millilitre. Mélanger délicatement la suspension cellulaire à l'aide d'une pipette, puis incuber la suspension d'hydrogel contenant les cellules dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 degrés Celsius.Pendant l'incubation des cellules, placer les moules en PDMS micropatterning dans un nettoyeur à plasma et les nettoyer pendant une minute à 85 watts afin de créer une surface hydrophile. Mélanger la suspension d'hydrogel contenant les cellules en pipetant doucement de haut en bas, puis charger de manière régulière 7,2 microlitres de la suspension sur le bord du micropatron dans le moule. Ensuite, gélifier la suspension d'hydrogel contenant les cellules en produisant un brouillard du réactif de réticulation à l'aide de l'humidificateur à un débit de 250 millilitres par heure, et en l'appliquant par pulvérisation sur le précurseur d'hydrogel pendant cinq minutes.Veillez à ce que cette procédure couvre la surface topographique du moule en PDMS sur une étendue de cinq centimètres. Après le processus de réticulation, éteignez l'humidificateur et remplissez le moule en PDMS avec du PBS. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, déposez délicatement du PBS autour du bord des feuillets d’hydrogel durcis afin de détacher chacun des hydrogels.Ensuite, prélevez chaque feuille de gel hydrophile flottante à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres à extrémité coupée. Transférez chaque feuille de gel hydrophile dans des puits individuels d’une plaque de 12 puits contenant un millilitre de DMEM préchauffé, de manière qu’elles flottent à la surface du milieu. Incubez les cellules de cette manière pendant une semaine, en renouvelant le milieu de culture tous les deux jours.Ensuite, produire un cadre en PDMS, qui contient des structures de piliers de 170 micromètres de hauteur à la surface inférieure, comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Pendant la fabrication, placer un moule en polycarbonate spécialisé sur la plaquette de silicium afin de créer un cadre interne en PDMS ayant une largeur de huit millimètres, une hauteur de neuf millimètres et une profondeur de deux millimètres. Une fois stérilisé, placer le cadre en PDMS sur un quart d'un morceau de papier filtre en nylon disposé dans une boîte de Pétri de 60 millimètres.Retirer les feuilles d'hydrogel de l'incubateur et transférer la première des feuilles d'hydrogel modulaires à l'intérieur du cadre en PDMS à l'aide d'une pointe de pipette de 1 000 microlitres coupée à l'extrémité. Aligner le bord de la feuille d'hydrogel modulaire avec le cadre en PDMS à l'aide d'une pointe de pipette de 200 microlitres vide. Répéter ce processus avec des feuilles d'hydrogel supplémentaires jusqu'à l'obtention d'une pile de quatre à six couches.Ensuite, retirez le milieu de culture en le faisant circuler à travers les structures en piliers situées au fond du cadre en PDMS. Puis, ajoutez deux microlitres d'une solution d'alginate à deux pour cent dans un coin de l'assemblage multicouche. À l'aide d'un humidificateur, pulvérisez un brouillard du réactif de réticulation à un débit de 250 millilitres par heure sur l'assemblage multicouche pendant trente secondes afin de fixer les bords de chaque couche les uns aux autres.Ensuite, rincez délicatement la structure multicouche avec 400 microlitres de DMEM et retirez le cadre en PDMS à l’aide d’une pince. Ajoutez ensuite quatre millilitres supplémentaires de DMEM. Détachez la structure multicouche avec le papier filtre en l’essuyant doucement à l’aide d’un extracteur de cellules, puis utilisez le papier filtre pour la transférer dans une plaque de six puits contenant trois millilitres de DMEM.Incubez les cellules en suspension avec un construct en hydrogel agissant comme un échafaudage cellulaire multi-échelle dans une plaque à six puits pendant au moins une semaine. Renouvelez le milieu de culture tous les deux jours. Le résultat d'un assemblage couche par couche de feuillets d'hydrogel micropattonnés, semblables à des lobules hépatiques, est montré ici, où des cellules de carcinome hépatique humain fluorescents en vert et des fibroblastes NIH-3T3 fluorescents en rouge ont été cultivés ensemble en co-culture sur une membrane combinée.Grâce à la technique présentée ici, de nombreuses variations de motifs peuvent être créées, notamment des piliers hexagonaux, des mailles fines, des réseaux complets et des microfibres multiples en forme de micropeignes, sous la forme d'un fin construct en hydrogel d'environ 100 à 200 micromètres. Ces structures offrent un environnement de culture 3D riche pour de nombreux types cellulaires différents. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment créer des feuillets cellulaires en hydrogel afin de concevoir, de manière ascendante, des systèmes de culture 3D semblables à ceux in vivo.

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