Construction de feuilles d'hydrogel modulaire pour micropatterned macro-échelle 3D Cellular architecture

L'objectif général de cette procédure est de démontrer la fabrication simple, la manipulation et l'assemblage de feuilles modulaires d'hydrogel pour un système de culture cellulaire en 3D. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du génie tissulaire, telles que la manière de créer des tissus ingénierisés fonctionnels plus proches de l'in vivo grâce à des micro-environnements cultivés. Le principal avantage de cette technique est que des constructions cellulaires en hydrogel peuvent être générées sans aucun coût supplémentaire élevé.

Les conditions de culture cellulaire en 3D dépendront de chaque feuille hydrogel modulaire. Les implications de cette technique s'étendent à l'amélioration des tests cellulaires et des études biologiques, car elle peut fournir diverses géométries et compositions de micro- et macro-environnements cellulaires en 3D. Bien que cette méthode puisse offrir des informations sur les tests cellulaires in vitro, elle peut également être appliquée à un autre système, comme un support transplantable de modèle tissulaire en 3D.

Commencez par produire les motifs à micro-échelle souhaités à l'aide de techniques standard de photolithographie. L'exemple montré dans cette vidéo utilisera un motif en treillis semblable à un lobule hépatique, comme celui illustré ici. Ensuite, pesez 2,5 grammes de PDMS et 2,5 grammes de la solution d'agent de réticulation, puis mélangez soigneusement les composants.

Dégazer la solution dans une chambre à vide, puis étaler uniformément la solution mixte sur la surface micropatternée de la tranche de silicium à l'aide d'un plat d'écoulement en aluminium. Ensuite, polymériser le PDMS en plaçant le plat sur une plaque chauffante à 65 degrés Celsius pendant 90 minutes. Une fois la polymérisation terminée, retirer le PDMS du plat d'écoulement et le décoller soigneusement de la tranche de silicium.

Découpez les bords du PDMS et placez la partie structurée sur une boîte de Pétri de 100 millimètres de diamètre, côté micropattern vers le haut. Ensuite, lavez le PDMS micropaterné avec de l'éthanol à 70 %, puis avec de l'eau distillée, pour une stérilisation primaire. Par la suite, faites sécher complètement l'ensemble pendant 10 minutes dans une étuve à 65 degrés Celsius.

Ensuite, placer le moule micropaterné en PDMS dans un nettoyeur à plasma et le nettoyer pendant une minute afin de créer une surface hydrophile. Cela facilitera le chargement des liquides aqueux. Puis recouvrir la surface du PDMS de 100 millilitres de la solution de tensioactif indiquée dans le tableau des matériaux.

Incuber les échantillons sur un agitateur de laboratoire pendant au moins trois heures. Ensuite, laver la solution de tensioactif des moules en PDMS à l'aide d'eau stérile, puis les sécher complètement dans une étuve à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Puis, stériliser chaque moule micromodélisé en l'exposant à une radiation ultraviolette pendant 30 minutes.

Commencez par cultiver les cellules HepG2 en utilisant des techniques standard. Une fois que les cellules atteignent une confluence de 70 à 80 %, lavez les cellules une fois à l’aide de PBS. Ensuite, récoltez les cellules en ajoutant un millilitre de trypsine-EDTA 0,5 % et incubez-les pendant quatre minutes à 37 degrés Celsius.

Une fois détachées, recueillir les cellules dans un tube de centrifugeuse et former un culot à 250 g pendant trois minutes. Éliminer le surnageant, puis resuspendre les cellules dans un millilitre de PBS. Compter le nombre de cellules simples et dispersées dans le PBS à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé.

Ensuite, centrifuger à nouveau les cellules à 250 g pendant trois minutes. Éliminer le surnageant de PBS et ajouter une quantité suffisante d'une solution d'alginate de sodium à un pour cent aux cellules afin d'obtenir une densité d'ensemencement finale comprise entre cinq et dix millions de cellules par millilitre. Mélanger délicatement la suspension cellulaire à l'aide d'une pipette, puis incuber la suspension d'hydrogel contenant les cellules dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 degrés Celsius.

Pendant l'incubation des cellules, placer les moules en PDMS micropatterning dans un nettoyeur à plasma et les nettoyer pendant une minute à 85 watts afin de créer une surface hydrophile. Mélanger la suspension d'hydrogel contenant les cellules en pipetant doucement de haut en bas, puis charger de manière régulière 7,2 microlitres de la suspension sur le bord du micropatron dans le moule. Ensuite, gélifier la suspension d'hydrogel contenant les cellules en produisant un brouillard du réactif de réticulation à l'aide de l'humidificateur à un débit de 250 millilitres par heure, et en l'appliquant par pulvérisation sur le précurseur d'hydrogel pendant cinq minutes.

Veillez à ce que cette procédure couvre la surface topographique du moule en PDMS sur une étendue de cinq centimètres. Après le processus de réticulation, éteignez l'humidificateur et remplissez le moule en PDMS avec du PBS. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, déposez délicatement du PBS autour du bord des feuillets d’hydrogel durcis afin de détacher chacun des hydrogels.

Ensuite, prélevez chaque feuille de gel hydrophile flottante à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres à extrémité coupée. Transférez chaque feuille de gel hydrophile dans des puits individuels d’une plaque de 12 puits contenant un millilitre de DMEM préchauffé, de manière qu’elles flottent à la surface du milieu. Incubez les cellules de cette manière pendant une semaine, en renouvelant le milieu de culture tous les deux jours.

Ensuite, produire un cadre en PDMS, qui contient des structures de piliers de 170 micromètres de hauteur à la surface inférieure, comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Pendant la fabrication, placer un moule en polycarbonate spécialisé sur la plaquette de silicium afin de créer un cadre interne en PDMS ayant une largeur de huit millimètres, une hauteur de neuf millimètres et une profondeur de deux millimètres. Une fois stérilisé, placer le cadre en PDMS sur un quart d'un morceau de papier filtre en nylon disposé dans une boîte de Pétri de 60 millimètres.

Retirer les feuilles d'hydrogel de l'incubateur et transférer la première des feuilles d'hydrogel modulaires à l'intérieur du cadre en PDMS à l'aide d'une pointe de pipette de 1 000 microlitres coupée à l'extrémité. Aligner le bord de la feuille d'hydrogel modulaire avec le cadre en PDMS à l'aide d'une pointe de pipette de 200 microlitres vide. Répéter ce processus avec des feuilles d'hydrogel supplémentaires jusqu'à l'obtention d'une pile de quatre à six couches.

Ensuite, retirez le milieu de culture en le faisant circuler à travers les structures en piliers situées au fond du cadre en PDMS. Puis, ajoutez deux microlitres d'une solution d'alginate à deux pour cent dans un coin de l'assemblage multicouche. À l'aide d'un humidificateur, pulvérisez un brouillard du réactif de réticulation à un débit de 250 millilitres par heure sur l'assemblage multicouche pendant trente secondes afin de fixer les bords de chaque couche les uns aux autres.

Ensuite, rincez délicatement la structure multicouche avec 400 microlitres de DMEM et retirez le cadre en PDMS à l’aide d’une pince. Ajoutez ensuite quatre millilitres supplémentaires de DMEM. Détachez la structure multicouche avec le papier filtre en l’essuyant doucement à l’aide d’un extracteur de cellules, puis utilisez le papier filtre pour la transférer dans une plaque de six puits contenant trois millilitres de DMEM.

Incubez les cellules en suspension avec un construct en hydrogel agissant comme un échafaudage cellulaire multi-échelle dans une plaque à six puits pendant au moins une semaine. Renouvelez le milieu de culture tous les deux jours. Le résultat d'un assemblage couche par couche de feuillets d'hydrogel micropattonnés, semblables à des lobules hépatiques, est montré ici, où des cellules de carcinome hépatique humain fluorescents en vert et des fibroblastes NIH-3T3 fluorescents en rouge ont été cultivés ensemble en co-culture sur une membrane combinée.

Grâce à la technique présentée ici, de nombreuses variations de motifs peuvent être créées, notamment des piliers hexagonaux, des mailles fines, des réseaux complets et des microfibres multiples en forme de micropeignes, sous la forme d'un fin construct en hydrogel d'environ 100 à 200 micromètres. Ces structures offrent un environnement de culture 3D riche pour de nombreux types cellulaires différents. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment créer des feuillets cellulaires en hydrogel afin de concevoir, de manière ascendante, des systèmes de culture 3D semblables à ceux in vivo.