Construction de feuilles d'hydrogel modulaire pour micropatterned macro-échelle 3D Cellular architecture

L’objectif général de cette procédure est de démontrer la fabrication, la manipulation et l’assemblage simples de feuilles d’hydrogel modulaires pour un système de culture cellulaire 3D. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie tissulaire, telles que la création de tissus modifiés fonctionnels plus proches de ceux d’in vivo avec des micro-environnements cultivés. Le principal avantage de cette technique est que les constructions d’hydrogel cellulaire peuvent être générées sans aucun incrément coûteux.

Les conditions de culture cellulaire 3D dépendront de chaque feuille d’hydrogel modulaire. Les implications de cette technique s’étendent à l’amélioration des tests cellulaires et des études biologiques, car la technique peut fournir diverses géométries et compositions de micro et macro-environnements cellulaires 3D. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des tests cellulaires in vitro, elle peut également être appliquée à un autre système tel qu’un échafaudage transplantable de modèle tissulaire 3D.

Commencez par produire les motifs à micro-échelle souhaités à l’aide de techniques de photolithographie standard. L’exemple montré dans cette vidéo utilisera un motif de maille semblable à un lobule de foie comme celui montré ici. Ensuite, pesez 2,5 grammes de PDMS et 2,5 grammes de solution d’agent de durcissement et mélangez soigneusement les composants.

Dégazez la solution dans une chambre à vide, puis étalez uniformément la solution mixte sur la surface du micromotif de la plaquette de silicium dans une boîte de coulée en aluminium. Ensuite, durcissez le PDMS en plaçant le plat sur la surface plane d’une plaque chauffée à 65 degrés Celsius pendant 90 minutes. Une fois durci, retirez le PDMS de la boîte de coulée et retirez-le soigneusement de la plaquette de silicium.

Coupez les bords du PDMS et placez la partie à motifs sur une boîte de Pétri de 100 millimètres de diamètre de manière à ce que le côté du micromotif soit orienté vers le haut. Ensuite, lavez le PDMS à micromotifs avec de l’éthanol à 70 %, suivi d’eau distillée, pour la stérilisation primaire. Ensuite, séchez complètement la configuration pendant 10 minutes dans un four à 65 degrés Celsius.

Ensuite, placez le moule PDMS à micromotifs dans un nettoyeur plasma et nettoyez-le pendant une minute afin de créer une surface hydrophile. Cela facilitera le chargement des liquides aqueux. Enduisez ensuite la surface du PDMS avec 100 millilitres de la solution tensioactive répertoriée dans la table des matériaux.

Incuber les échantillons sur une bascule de laboratoire pendant au moins trois heures. Ensuite, lavez la solution tensioactive des moules PDMS à l’aide d’eau stérile et séchez-les complètement dans un four à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, stérilisez chaque moule à micromotifs en l’exposant à un rayonnement ultraviolet pendant 30 minutes.

Commencez par cultiver des cellules hepg2 à l’aide de techniques standard. Une fois que les cellules sont confluentes à 70 % à 80 %, lavez-les une fois avec du PBS. Ensuite, récoltez les cellules en ajoutant un millilitre de 05 % de trips dans l’edta et en les incubant pendant quatre minutes à 37 degrés Celsius.

Une fois détachées, récupérez les cellules dans un tube à centrifuger et granulez-les à 250 g pendant trois minutes. Retirez le surnageant, puis remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS. Comptez le nombre de cellules distribuées uniques dans PBS à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.

Ensuite, granulez à nouveau les cellules à 250 g pendant trois minutes. Retirez le surnageant PBS et ajoutez suffisamment d’une solution d’alginate de sodium à un pour cent aux cellules pour que la densité finale d’ensemencement soit comprise entre cinq et dix millions de cellules par millimètre. Mélangez doucement la solution cellulaire à l’aide d’une pipette, puis incubez la suspension d’hydrogel cellulaire dans un incubateur humidifié à cinq pour cent de CO2 à 37 degrés Celsius.

Pendant l’incubation des cellules, placez les moules PDMS à micromotifs dans un nettoyeur plasma et nettoyez-les pendant une minute à 85 watts pour créer une surface hydrophile. Mélangez la suspension d’hydrogel cellulaire en pipetant doucement de haut en bas, puis chargez régulièrement 7,2 microlitres de suspension au bord du micromotif dans le moule. Ensuite, gelez la suspension d’hydrogel cellulaire en produisant un brouillard du réactif de réticulation avec l’humidificateur à raison de 250 millilitres par heure et en le vaporisant sur le précurseur d’hydrogel pendant cinq minutes.

Assurez-vous que cette procédure couvre la surface topographique du moule PDMS dans une plage de cinq centimètres. Après le processus de réticulation, éteignez l’humidificateur et remplissez le moule PDMS de PBS. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, répartissez doucement le PBS sur le pourtour des feuilles d’hydrogel durcies afin de détacher chacun des hydrogels.

Ensuite, prélevez chaque feuille d’hydrogel flottante à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 microlitres. Transférez chaque feuille d’hydrogel dans des puits individuels d’une plaque de 12 puits contenant un millilitre de DMEM préchauffé afin qu’ils flottent à la surface du média. Cultivez les cellules ainsi pendant une semaine, en échangeant le milieu de culture tous les deux jours.

Ensuite, produisez un cadre PDMS, qui contient des structures de piliers de 170 microns de haut sur la surface inférieure, comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. Pendant la fabrication, placez un moule en polycarbonate spécialisé sur la plaquette de silicium pour le cadre PDMS afin de créer un cadre intérieur d’une largeur de huit millimètres, d’une hauteur de neuf millimètres et d’une profondeur de deux millimètres. Une fois stérilisé, placez le cadre PDMS sur un quart d’un morceau de papier filtre en nylon placé dans une boîte de Pétri de 60 millimètres.

Retirez les feuilles d’hydrogel de l’incubateur et transférez la première des feuilles d’hydrogel modulaires à l’intérieur du cadre PDMS à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 microlitres. Alignez le bord de la feuille d’hydrogel modulaire avec le cadre PDMS à l’aide d’une pointe de pipette vide de 200 microlitres. Répétez ce processus avec des feuilles d’hydrogel supplémentaires jusqu’à ce qu’une pile de quatre à six couches soit obtenue.

Ensuite, retirez le milieu de culture en le faisant passer à travers les structures piliers au bas du cadre PDMS. Ensuite, ajoutez deux microlitres d’une solution d’alginate à deux pour cent dans un coin de la construction multicouche. À l’aide d’un humidificateur, vaporisez un brouillard de réactif de réticulation à raison de 250 millimètres par heure sur la construction multicouche pendant trente secondes pour fixer les bords de chaque couche ensemble.

Ensuite, rincez doucement la construction multicouche avec 400 microlitres de DMEM et retirez le cadre PDMS à l’aide d’une pince à épiler. Ensuite, ajoutez quatre millilitres supplémentaires de DMEM. Détachez la construction multicouche avec le papier filtre en l’essuyant doucement avec un lève-cellule, puis utilisez du papier filtre pour le transférer sur une plaque à six puits contenant trois millilitres de DMEM.

Cultivez les cellules de manière flottante avec une construction d’hydrogel comme échafaudage cellulaire multi-échelle dans la plaque à six puits pendant au moins une semaine. Échangez le milieu de culture tous les deux jours. Le résultat d’un assemblage couche par couche de feuilles d’hydrogel micro-pattées ressemblant à des lobules hépatiques est montré ici, où des cellules de carcinome hépatique humain fluorescentes vertes et des fibroblastes NIH-3T3 fluorescents rouges ont été cultivées ensemble en co-culture sur un maillage combiné.

En utilisant la technique présentée ici, de nombreuses variations de motifs peuvent être créées, y compris des piliers hexagonaux, des mailles minces, des réseaux entiers et plusieurs microfibres ressemblant à des micropeignes sous la forme d’une mince construction d’hydrogel de l’ordre de 100 à 200 micromètres. Ces structures fournissent un environnement de culture 3D riche pour de nombreux types de cellules différents. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer des feuilles d’hydrogel cellulaire pour l’ingénierie de systèmes de culture 3D de type in vivo de bas en haut.