JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

Régulation de la température au laboratoire: conservation des échantillons à froid

Regulating Temperature in the Lab: Preserving Samples Using Cold

JoVE Science Education
General Laboratory Techniques

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education General Laboratory Techniques

Regulating Temperature in the Lab: Preserving Samples Using Cold

1.13: Introduction to Light Microscopy

1.15: Regulating Temperature in the Lab: Applying Heat

65,664 Views

•

08:07 min

•

April 30, 2023

Overview

La conservation d’échantillons, prélèvements et réactifs de laboratoire en utilisant du froid extrême est quotidiennement réalisée dans les labos de recherche biomédicale. Cette vidéo montre quelques méthodes pour conserver des échantillons de laboratoire froid et explique les méthodes correctes de refroidissement à utiliser pour chaque besoin expérimental. Par exemple, les agents refroidissants, comme la glace et la carboglace, sont typiquement utilisés pour la conservation d’échantillons froids pendant les expériences. Cette vidéo explique les propriétés physiques des agents refroidissants les plus couramment utilisés, ainsi que les précautions de sécurité pour les manipuler. Pour la conservation d’échantillons froids entre les expériences, les équipements refroidissants, incluant les frigos et congélateurs de niveau laboratoire peuvent être utilisés pour conserver des échantillons pour une période de temps étendue. Les types d’échantillons et de réactifs qui peuvent être entreposés dans les équipements refroidissants habituellement disponibles au labo sont également expliqués dans cette vidéo. Finalement, le concept de cryopréservation est introduit comme un procédé à travers lequel les tissus, cellules et biomolécules sont refroidis à des températures inférieures à zéro, en stoppant ainsi effectivement toute activité de dégradation biologique de l’échantillon. Plusieurs méthodes de cryopréservation sont discutées qui minimisent ou éliminent la formation de cristaux de glace endommageant.

Procedure

La conservation d’échantillons, prélèvements et réactifs de laboratoire, est une exigence dans les laboratoires de recherche du monde entier. Un moyen efficace pour conserver l’intégrité et la viabilité des échantillons au cours du temps est de les maintenir à des températures froides.

Que vous travailliez avec un échantillon sur la paillasse, ou que vous l’entreposiez à la fin d’une expérience, différentes méthodes de refroidissement peuvent être utilisées. Cette vidéo va vous montrer les differents types d’agents et instruments refroidissants typiquement trouvés au laboratoire, et vous aidera à comprendre quels types d’échantillons sont entreposés et à quelles températures.

Le choix de l’agent refroidissant est dépendant de la nature de la procédure expérimentale qui va être réalisée.

La glace conventionnelle est le choix logique pour conserver des échantillons à court-terme. Vous savez probablement que la glace est de l’eau gelée, qui a une température de fonte à 0°C à pression atmosphérique normale, comme vous pouvez le voir dans ce diagramme de phase. Par contre, vous ne savez peut etre pas qu’elle est appelée « glace humide », car elle devient liquide en se réchauffant à température ambiante.

La « glace humide » est idéale pour conserver des échantillons et réactifs froids lors de leur utilisation ou de leur transport.

Alors que la « glace humide » est de l’H2O solide, la « glace sèche » est la forme solide du dioxyde de carbone, appelée carboglace, qui a un point de fonte à

-78,5°C. La carboglace ne devient pas liquide sous la pression atmosphérique, mais se transforme directement en gaz de dioxyde de carbone, à travers un procédé appelé sublimation. La Sublimation fait référence au passage directement de l’état solide à l’état gazeux, et apparait en-dessous du point triple dans un diagramme de phase.

Utilisez de la carboglace lorsque vous travaillez avec des prélèvements biologiques comme des bactéries gelées ou des cellules ou tissus de mammifères, qui sont généralement entreposés à des températures bien en-dessous de 0°C.

La carboglace est aussi avantageuse car elle ne laisse aucun résidu lors du changement d’état, ce qui la rend idéale pour la réalisation d’un bain de congélation, en renversant du liquide sur de la carboglace.

L’azote liquide est de l’azote gazeux condensé et est communément écrit « LN2 ». Sous la pression atmosphérique, l’azote liquide bout, ou fait sa transition du liquide vers le gaz, à -196°C, comme vous pouvez le voir dans son diagramme de phase.

Lorsque vous avez besoin d’entreposer des prélèvements biologiques à des températures inférieures à ce que la plupart des congélateurs de laboratoire peuvent atteindre, l’azote liquide est utilisé.

L’azote liquide peut être entreposé dans un vase dewar ou un flacon sous vide, avec un couvercle lâche ou dans un grand réservoir dewar équipé d’une valve de relâchement pour empêcher que la pression augmente à l’intérieur.

Bien que non-toxique, la carboglace et l’azote liquide sont des matériaux dangereux, et ne devraient pas être manipulés avant d’avoir été entrainé par un membre expérimenté du labo.

A cause des températures extrêmement basses de l’azote liquide et de la carboglace, des dommages sévères aux tissus peuvent avoir lieu au contact avec la peau. Portez toujours une protection correcte, incluant des gants cryogéniques et un tablier de labo. Utilisez des outils pour manipuler les échantillons et évitez le contact avec la peau.

De plus, les récipients hermétiques ne devraient jamais être utilisés pour entreposer la carboglace ou l’azote liquide, car ces agents refroidissants changent d’état en gaz. Sous des conditions hermétiques, la pression peut conduire à une explosion.

Parlons maintenant des instruments qui conservent les échantillons froids… Les frigos et congélateurs de laboratoire régulent la température bien mieux que ceux trouvés à la maison, pour assurer une température uniforme d’un bout à l’autre de l’unité.

Ils sont généralement équipés avec des systèmes de surveillance de température et des alarmes, qui s’allument suite à des changements significatifs de température.

N’entreposez jamais de nourriture ou de boisson dans les frigos ou congélateurs de labo, car ceci pourrait résulter en une contamination avec des produits chimiques toxiques ou des bactéries. Vous devrez trouver un autre endroit pour entreposer votre déjeuner.

Les frigos sont maintenus à 4°C et généralement utilisés pour des stockages temporaires d’échantillons, particulièrement lorsque la congélation peut atteindre l’intégrité de l’échantillon.

Beaucoup de réactifs et de solutions sont entreposés à 4°C pour étendre leur durée de vie, comme par exemple le milieu de culture des tissus et les plaques de culture de cellules coulées, qui sont chauffés avant utilisation.

Les chambres froides sont idéales pour l’entreposage d’équipements plus grands qui devraient fonctionner à basses températures, comme les unités de chromatographie liquide.

Les congélateurs spécialisés pour laboratoire varient en températures, de -20°C, à -196°C pour les congélateurs cryogéniques.

Pour le stockage d’acides nucléiques et de réactifs, comme l’enzyme de restriction, -20°C est le choix approprié. Une fois retirés du congélateur, les échantillons et réactifs doivent être gardés dans la glace.

Une temperature de -80°C et des congélateurs cryogéniques sont appropriés pour le stockage de tissus et de cellules sur une période étendue de temps, suite à la cryopréservation dans l’azote liquide. De la carboglace est généralement utilisée pour transporter les échantillons retirés du congélateur à -80°C.

La cryopréservation est un terme qui fait référence au stockage à long terme de tissus, ou même de cellules vivantes. En-dessous de zéro, toute activité biologique, incluant les réactions qui dégradent l’échantillon, sont effectivement stoppées.

Lors de la congélation des cellules et tissus, des cristaux de glace se forment, conduisant à la déshydratation et au ravage de la cellule, ainsi qu’à l’accumulation de molécules de solutés dans des concentrations nocives.

La congélation nette, ou éclair, est le procédé par lequel les échantillons biologiques sont rapidement submergés dans de l’azote liquide, ou un mélange de carboglace et d’éthanol, afin que ne puissent pas se former de larges cristaux de glace qui endommageraient les cellules. Des cryoprotecteurs peuvent aussi être utilisés comme additif pour réduire la formation de glace.

En tant qu’alternative à la congélation éclair, des machines peuvent être utilisées pour lentement contrôler le procédé de congélation, ce qui est nécessaire pour cryopréserver les embryons de mouton que vous voyez ici.

Récemment, la vitrification a été introduite comme une méthode pour cryopréserver les cellules et tissus sans aucun dommage cause par les cristaux de glace. Ce procédé transforme le liquide de l’échantillon en un solide non-cristallin et transparent, grace a un refroidissement rapide en présence de certains cryoprotecteurs.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE au refroidissement des prélèvements et des réactifs de laboratoire. Dans cette vidéo, nous avons vus différents types d’agents et d’équipements refroidissants, et à quel moment utiliser chacune de ces méthodes de refroidissement. Nous avons aussi expliqué plusieurs moyens de cryopréserver des prélèvements biologiques. Merci de nous avoir regardé.

Transcript

Preservation of laboratory samples, specimens and reagents, is a requirement of research laboratories worldwide. An efficient way to preserve sample integrity and viability over time is by maintaining them at cold temperatures.

Whether you are working with a sample at the bench, or storing a sample at the end of an experiment, different methods of cooling can be used. This video will demonstrate the types of cooling agents and instruments typically found in the lab and will help you understand what types of samples are stored at which temperatures.

The choice of cooling agent is dependent on the nature of experimental procedure being performed.

Conventional ice is the logical choice for preserving samples over the short-term. You probably know that ice is frozen water, which has a melting point of 0 °C at normal atmospheric pressure as you can see in this phase diagram. You might not know that it is sometimes referred to as “wet ice”, because it becomes liquid as it warms at room temperature.

“Wet Ice’ is ideal for keeping samples and reagents cold while working with- or transporting them.

While “wet ice’ is solid H2O, “dry ice’ is the solid form of carbon dioxide, which has a melting point of -78.5 ˚C. Dry ice does not melt into liquid at atmospheric pressure but rather transforms directly into carbon dioxide gas, through a process called sublimation. Sublimation refers to a shift in the phase of matter from solid directly to gas and occurs below the triple point in a phase diagram.

Use dry ice, when you are working with biological specimens such as frozen bacterial or mammalian cells or tissue, which are generally stored at temperatures well below 0˚C.

Dry ice is also advantageous as it leaves no residue upon changing state, which makes it ideal for constructing a freezing bath by pouring liquid over dry ice.

Liquid nitrogen is condensed nitrogen gas and is. commonly written as “LN2”. At atmospheric pressure liquid nitrogen boils, or transitions from liquid to a gas, at -196 °C, which you can see by its phase diagram.

When you need to store biological specimens at temperatures below what most laboratory freezers can obtain, liquid nitrogen is used.

Liquid Nitrogen can be stored in a dewar, or vacuum flask, with a loose fitting lid or a large tank dewar equipped with a relief valve to prevent pressure build-up within the system.

Though non-toxic, dry ice and liquid nitrogen are dangerous materials and should not be handled until you have been trained by an experienced member of the lab.

Due to the extremely low temperatures of liquid nitrogen and dry ice, severe tissue damage can occur upon contact with skin. Always wear proper protection, including cryogenic gloves and a lab coat. Use tools to manipulate samples to avoid contact with skin.

Also, airtight containers should never be used to store either dry ice or liquid nitrogen, since these cooling agents change state into gas. Under airtight conditions, pressure can build leading to an explosion.

And now for the instruments that keep samples cold… Laboratory refrigerators and freezers regulate temperature more tightly than those found in the home to ensure a uniform temperature throughout the unit.

They are generally equipped with temperature monitoring systems and alarms that go off following significant temperature change.

Never store food or drink in lab fridges or freezers, as this could result in contamination with toxic chemicals or bacteria. You’ll have to find another place to store your lunch.

Refrigerators are maintained at 4°C and generally used for temporary storage of samples especially when freezing can affect sample integrity.

Many reagents and solutions are stored at 4°C to extend their shelf life, including tissue culture media and poured cell culture plates, which are warmed before use.

Cold rooms are ideal for storage of larger equipment that should operate at low temperatures, such as liquid chromatography units.

Laboratory grade freezers range in temperature from -20° C to -196 °C for cryogenic freezers.

For storage of nucleic acids and reagents, such as restriction enzyme, -20 °C is the appropriate choice. Upon removal from the freezer, samples and reagents should be kept on ice.

-80°C and cryogenic freezers are suitable for storage of frozen tissue and cells over an extended period of time following cryopreservation in liquid nitrogen. Dry ice is generally used to transport samples taken out of -80 ˚C freezers.

Cryopreservation is a term that refers to the long-term storage of tissues, or even living cells. At sub-zero temperatures all biological activity, including reactions that degrade the sample is effectively stopped.

When freezing living cells and tissue, ice crystals can form, leading to cell dehydration and damage, as well as accumulation of solute molecules to harmful concentrations.

Snap- or flash-freezing is the process by which biological samples are rapidly submerged in liquid nitrogen, or a mixture of dry ice and ethanol, so that large ice crystals cannot form and damage the cells. Cryoprotectants can also be used as an additive to reduce the formation of ice.

As an alternative to flash freezing, machines can be used to slowly control the freezing process, which is needed to cryopreserve the sheep embryos you see here.

Recently, vitrification has been in introduced as a method to cryopreserve cells and tissue without any damage due to ice crystals. This process transforms the liquid in the sample to a non-crystalline, glassy solid through rapid cooling in the presence of certain cryoprotectants.

You’ve just watched JoVE’s introduction to cooling laboratory specimens and reagents.

In this video we reviewed different types of cooling agents and equipment, and examples of when to use each cooling method. We also introduced several ways to cryopreserve biological specimens. Thanks for watching.