Un procédé de culture embryonnaire C. elegans Cellules

L’objectif global de cette procédure est de dissocier et de cultiver in vitro des cellules embryonnaires élégantes de la mer. Ceci est accompli en cultivant d’abord de grandes quantités d’animaux graves. Ensuite, les œufs sont isolés des adultes.

Ensuite, les œufs sont traités avec de la chitinase pour dissoudre la coquille de l’œuf. Enfin, les cellules sont dissociées manuellement et plaquées pour la culture. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent l’expression de marqueurs spécifiques de la cellule par immunofluorescence, microscopie, électrophysiologie et techniques d’imagerie calcique.

La démonstration de la procédure sera assurée par rel ti, un laboratoire postdoctoral. Après avoir cultivé au moins quatre plaques d’élégance marine au stade adulte GR et préparé des milieux et des solutions selon le protocole de texte. Commencez l’isolement de l’œuf en hachant d’abord un tube de solution mère de lectine d’arachide préalablement préparée.

Placez les lamelles de l’autoclave dans les puits d’une plaque à 24 puits et ajoutez 200 microlitres de lectine d’arachide à chaque lamelle de couverture et incubez pendant au moins une heure à température ambiante. Ensuite, aspirez la solution et utilisez de l’eau stérile pour laver les puits. Une fois éliminé toutes les traces de lectine d’arachide pour éviter l’agglutination des cellules.

Ensuite, à l’aide d’eau stérile d’autoclave, lavez les adultes GR des plaques de gélose et collectez la suspension dans deux tubes coniques stériles de 50 millilitres. Placez les tubes sur de la glace jusqu’à cinq minutes pour permettre aux vers de se déposer au fond Avec une pipette de transfert, retirez l’eau et remplacez-la par une centrifugeuse à eau autoclave fraîche et stérile. Les vers à 200 G pendant 10 minutes.

Après le lavage final, réanimez, suspendez les vers dans de l’eau fraîche stérile et transférez-les dans un tube conique stérile de 15 millilitres avant de les faire tourner à nouveau à 200 G pendant 10 minutes. Si les vers ne sont pas complètement granulés, placez le tube sur de la glace pendant cinq minutes. Une fois que les vers sont complètement installés, retirez l’eau et ajoutez cinq à six millilitres de solution de lyse.

Ensuite, balancez doucement la suspension pendant cinq à 10 minutes et toutes les deux à trois minutes, placez une goutte de suspension sur une lamelle et vérifiez la lyse sous un microscope stéréoscopique. Lorsque 72 à 80 % des vers sont lysés, arrêtez la réaction de lyse en ajoutant neuf millilitres de tampon pour œufs avant de tourner à partir de ce moment, allumez un bec Bunsen et gardez-le allumé pour éviter la recontamination des œufs, retirez soigneusement le surnageant et utilisez le tampon à œufs pour bien laver le granulé trois à quatre fois jusqu’à ce que la solution soit claire. Ensuite, après avoir retiré le dernier surnageant pour séparer les œufs des carcasses d’animaux, suspendez la pastille dans deux millilitres de tampon d’œufs stérile et ajoutez deux millilitres de 60 % de saccharose dans le tampon d’œufs.

Bien mélanger les œufs en solution avant de les centrifuger pendant 20 minutes. À 200 G, retirez délicatement les tubes de la centrifugeuse. Les œufs flotteront à la surface de la solution.

Par conséquent, utilisez une pipette et des embouts stériles d’un millilitre pour transférer les œufs dans un tube conique frais et stérile de 15 millilitres. Utilisez un tampon à œufs stérile pour laver les œufs trois fois tout en travaillant sous une hotte à flux laminaire. Pour éviter d’introduire une contamination bactérienne, suspendez les œufs granulés dans un millilitre de kinase de deux milligrammes par millilitre et transférez-les dans un tube conique frais de 15 millilitres.

Secouez le tube pendant 10 à 30 minutes à température ambiante, selon la fraîcheur de l’enzyme lorsque environ 80 % des coquilles d’œufs sont digérées. Centrifugez les œufs à 900 G pendant trois minutes. Après avoir soigneusement retiré le surnageant, ajoutez trois millilitres de milieu L 15, transférez les œufs dans une plaque de six centimètres de diamètre et commencez la dissociation manuelle à l’aide d’une seringue stérile de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 18.

Pour surveiller le degré de dissociation, placez une goutte de suspension dans une boîte de Pétri fraîche et observez-la au microscope. Continuez jusqu’à ce qu’environ 80 % des cellules soient dissociées. Pour éliminer les grumeaux cellulaires, les œufs non digérés et les larves écloses, filtrez doucement la suspension à travers un filtre de cinq microns et faites passer quatre à cinq millilitres supplémentaires de milieu L 15 à travers le filtre pour récupérer les cellules afin de les cultiver.

Après avoir centrifugé le filtrat à 900 G pendant trois minutes, suspendez les cellules dans un milieu L 15 complet joué un millilitre par puits et stockez les plaques dans une chambre étanche humide à 20 degrés Celsius à l’air ambiant. Afin de différencier les cellules embryonnaires isolées, les cellules éléganes doivent adhérer à un substrat. Le processus de différenciation commence environ deux à trois heures après le placage et se poursuit pendant environ 24 heures.

Les caractéristiques morphologiques in vitro sont remarquablement similaires à celles in vivo. Par exemple, comme le montre ici, les neurones tactiles d’un LM et d’un PLM ne développent que deux processus neuronaux, l’un plus long que l’autre, comme ils le font in vivo. Cela suggère qu’au moins certains des mécanismes moléculaires qui entraînent la différenciation dans les cellules elegan sont autonomes cellulaires et peuvent donc être récapitulés.

Des marqueurs protéiques in vitro et des modifications post-traductionnelles spécifiques aux cellules peuvent également être observés in vitro. Par exemple, l’alpha-tubuline est une protéine uniquement dans les neurones tactiles de l’éléphant de mer, comme le montrent ici les processus in vitro de coloration des neurones tactiles avec un anticorps élevé contre une alpha-tubuline rassasiée. Et de plus, comme on le voit dans ce panel, les neurones tactiles cultivés expriment le canal mutant toxique MEC quatre D, qui provoque la mort des neurones tactiles in vivo.

Les neurones exprimant la GFP préparés à partir d’une souche MEC quatre DPE 4G FP sont initialement présents en culture, mais dégénèrent ensuite. Cependant, tout comme in vivo, les cellules peuvent être sauvées de la mort par un traitement avec un IDE et du dantrolène, comme indiqué ici. Les techniques de patch clamp sont utilisées pour étudier les canaux phoniques de potassium, onic, non sélectifs et dépendants du transporteur de dopamine dans les cellules cultivées d’elgan de mer.

En raison de la petite taille de la cellule, les pipettes en verre doivent avoir une petite pointe, puis un cône large pour compenser la résistance d’entrée accrue. De plus, un plus grand succès est obtenu en appliquant une impulsion à haute tension à la partie de la membrane sous l’extrémité de la pipette plutôt qu’en accédant à la cellule entière par aspiration qui peut endommager la cellule. Dans cette figure, pour étudier le rôle des canaux calciques voltage-dépendants, l’ION quatre est utilisé pour perméer la membrane et pour calibrer les neurones tactiles exprimant le caméléon YC deux point 12 pour l’imagerie calcique en l’absence ou la présence de calcium.

De plus, il a été déterminé que la concentration moyenne de calcium libre dans les neurones tactiles est de 200 molaires nanomolaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de cultiver vitro. Voir l’élégance, les cellules embryonnaires.