Un procédé de culture embryonnaire

L'objectif général de cette procédure est de dissocier et de cultiver in vitro des cellules embryonnaires de nématode. Cette étape est réalisée en faisant d'abord croître de grandes quantités de vers adultes. Ensuite, les œufs sont isolés à partir des adultes.

Ensuite, les œufs sont traités avec de la chitinase afin de dissoudre la coquille. Enfin, les cellules sont dissociées manuellement et mises en culture. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant l'expression de marqueurs spécifiques aux cellules par des techniques d'immunofluorescence, de microscopie, d'électrophysiologie et d'imagerie calcique.

La procédure sera démontrée par rel ti, postdoctorant au laboratoire mal. Après avoir cultivé au moins quatre boîtes de sea elegance jusqu'au stade adulte GR et préparé les milieux et solutions selon le protocole décrit dans le texte, commencez l'isolement des œufs en décongelant d'abord un tube d'une solution stock de lectine d'arachide préparée au préalable.

Placer des lamelles stérilisées à l'autoclave dans les puits d'une plaque de 24 puits et ajouter 200 microlitres de lectine d'arachide sur chaque lamelle ; incuber pendant au moins une heure à température ambiante. Ensuite, aspirer la solution et rincer les puits avec de l'eau stérile. Veiller à éliminer toute trace de lectine d'arachide afin d'éviter l'agglutination des cellules.

Ensuite, à l’aide d’eau stérile d’autoclave, lavez les adultes de GR des plaques d’agar et recueillez la suspension dans deux tubes coniques stériles de 50 millilitres. Placez les tubes sur de la glace pendant cinq minutes maximum pour permettre aux vers de se déposer au fond. À l’aide d’une pipette de transfert, retirez l’eau et remplacez-la par de l’eau stérile d’autoclave fraîche. Centrifugez les vers à 200 G pendant 10 minutes.

Après le dernier lavage, resuspendez les vers dans de l'eau stérile fraîche et transférez-les dans un tube conique stérile de 15 millilitres avant de les centrifuger à nouveau à 200 ×g pendant 10 minutes. Si les vers ne sont pas complètement en culot, placez le tube sur de la glace pendant cinq minutes. Une fois que les vers sont complètement déposés, éliminez l'eau et ajoutez cinq à six millilitres de solution de lyse.

Ensuite, agiter doucement la suspension pendant cinq à dix minutes et, toutes les deux à trois minutes, déposer une goutte de suspension sur une lame couvre-objet et vérifier la lyse au microscope stéréo. Lorsque 72 à 80 % des vers sont lysés, arrêter la réaction de lyse en ajoutant neuf millilitres de tampon à œufs ; à partir de ce moment, allumer un bec Bunsen et le laisser allumé afin d'éviter toute recontamination des œufs, puis centrifuger. Retirer soigneusement le surnageant et laver le culot avec du tampon à œufs trois à quatre fois jusqu'à ce que la solution devienne claire. Ensuite, après avoir éliminé le dernier surnageant afin de séparer les œufs des carcasses animales, resuspendre le culot dans deux millilitres de tampon à œufs stérile et ajouter deux millilitres de saccharose à 60 % dans le tampon à œufs.

Mélangez bien les œufs en solution avant de centrifuger pendant 20 minutes. À 200 G, retirez soigneusement les tubes de la centrifugeuse. Les œufs flotteront à la surface de la solution.

Par conséquent, utilisez une pipette et des embouts stériles d'un millilitre pour transférer les œufs dans un nouveau tube conique stérile de 15 millilitres. Lavez les œufs trois fois avec du tampon pour œufs stérile en travaillant sous une hotte à flux laminaire. Afin d'éviter toute contamination bactérienne, resuspendez les œufs en pellet dans un millilitre d'une solution de kinase à deux milligrammes par millilitre et transférez-les dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.

Agiter le tube de 10 à 30 minutes à température ambiante, selon la fraîcheur de l'enzyme, jusqu'à ce qu'environ 80 % des coquilles d'œufs soient digérées. Centrifuger les œufs à 900 ×g pendant trois minutes. Après avoir soigneusement éliminé le surnageant, ajouter trois millilitres de milieu L 15, transférer les œufs dans une plaque de six centimètres de diamètre et commencer la dissociation manuelle à l’aide d’une seringue stérile de 10 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 18.

Pour surveiller le degré de dissociation, déposez une goutte de suspension dans une nouvelle boîte de Pétri et observez au microscope. Poursuivez jusqu'à ce qu'environ 80 % des cellules soient dissociées. Pour éliminer les agrégats cellulaires, les œufs non digérés et les larves éclosies, filtrez délicatement la suspension à travers un filtre de cinq microns et faites passer quatre à cinq millilitres supplémentaires de milieu L 15 à travers le filtre afin de récupérer les cellules à mettre en culture.

Après centrifugation du filtrat à 900 ×g pendant trois minutes, resuspendre les cellules dans 1 mL de milieu L-15 complet par puits et conserver les plaques dans une chambre scellée et humide à 20 °C dans l'air ambiant. Afin de différencier les cellules embryonnaires isolées de C. elegans, elles doivent adhérer à un substrat. Le processus de différenciation débute environ deux à trois heures après le semis et se poursuit pendant environ 24 heures.

Les caractéristiques morphologiques in vitro sont remarquablement similaires à celles observées in vivo. Par exemple, comme illustré ici, les neurones touchés par un LM et un PLM développent uniquement deux prolongements neuronaux, dont un est plus long que l'autre, tout comme in vivo. Cela suggère que certaines des mécanismes moléculaires responsables de la différenciation des cellules d'elegans sont autonomes au niveau cellulaire et peuvent donc être recréés.

Les marqueurs protéiques in vitro et les modifications post-traductionnelles spécifiques aux cellules peuvent également être observés in vitro. Par exemple, la tubuline alpha est sature uniquement dans les neurones sensoriels du toucher chez l'oursin de mer, comme le montrent ici les processus in vitro des neurones sensoriels qui se colorent avec un anticorps dirigé contre une tubuline alpha saturée. De plus, comme on le voit dans ce panneau, les neurones sensoriels en culture expriment le canal muté toxique MEC quatre D, qui provoque effectivement la mort des neurones sensoriels in vivo.

Les neurones exprimant la GFP préparés à partir d'une souche MEC quatre DPE 4G FP sont initialement présents en culture, puis dégénèrent. Toutefois, comme dans les conditions in vivo, les cellules peuvent être sauvées de la mort par un traitement à l'IDE et à la dantrolène, comme illustré ici. Des techniques de patch clamp sont utilisées pour étudier les canaux potassiques, ioniques, non sélectifs et dépendants du transporteur de la dopamine dans des cellules de sea elgan en culture.

En raison de la petite taille de la cellule, les pipettes en verre doivent présenter une pointe fine suivie d'un cône large afin de compenser la résistance d'entrée accrue. En outre, on obtient de meilleurs résultats en appliquant une impulsion de haute tension sur la membrane située sous la pointe de la pipette, plutôt que d'obtenir un accès en configuration whole cell par aspiration, ce qui pourrait endommager la cellule. Sur cette figure, afin d'étudier le rôle des canaux calciques activés par le voltage, ION four est utilisé pour permeabiliser la membrane et calibrer les neurones sensoriels exprimant le chameleon YC two point 12 pour l'imagerie du calcium en absence ou en présence de calcium.

En outre, il a été déterminé que la concentration moyenne en calcium libre dans les neurones tactiles est de 200 nanomolaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler et cultiver in vitro des cellules embryonnaires de See elegance.