Microfabrication de Patterns d'or nanoporeux d'études sur l'interaction cellule-matériau

L’objectif global de cette procédure est de fabriquer des micro-motifs d’or nanoporeux et de démontrer leur compatibilité avec la culture cellulaire. Ceci est accompli en créant d’abord des masques au pochoir ou photolithographiques. La deuxième étape consiste à co-pulvériser de l’or et de l’argent à travers les masques pour modeler l’alliage précurseur de l’or nanoporeux.

Ensuite, les motifs en alliage d’or et d’argent sont désalliés dans de l’acide nitrique pour produire des revêtements d’or nanoporeux. La dernière étape consiste à cultiver des cellules sur des micro-motifs d’or nanoporeux et à les immunocolorer, puis à les immunocolorer ; la fluorescence et la microscopie électronique à balayage couplées à l’analyse d’images sont utilisées pour quantifier les interactions entre les matériaux cellulaires. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes de création de revêtements nanostructurés, tels que les nanotubes de carbone, est que l’or nanoporeux bénéficie de la compatibilité de la microfabrication, de la surface effective élevée, de la facilité de fonctionnalisation avec la chimie à base de tuiles, de la conductivité électrique et de la biocompatibilité.

Cette méthode peut répondre à des questions clés dans les domaines de la science des matériaux et de la bio-ingénierie, telles que l’effet de la nanostructure des matériaux sur les propriétés électriques, mécaniques, biologiques et chimiques. Bien que cette méthode donne un aperçu de l’effet de la nanostructure sur la morphologie cellulaire. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que le développement de biocapteurs, de systèmes d’administration de médicaments et de plateformes de stockage d’énergie.

Commencez cette procédure en nettoyant les lames de microscope d’un pouce sur trois pouces et les petites lamelles avec une solution de piranha, chargez les petites lamelles dans un bateau d’immunocoloration en porcelaine et plongez le bateau et la lame de microscope dans la solution de piranha. Voir le protocole texte pour plus de détails sur la procédure de nettoyage. Après le nettoyage, transférez les échantillons dans des plats de cristallisation et rincez-les à l’eau pendant trois minutes.

Placez les échantillons sur des serviettes non pelucheuses et séchez-les au sèche-cheveux avec un pistolet à azote pour créer des motifs à l’échelle millimétrique. Poinçonnez des feuilles d’élastomère de silicone de 250 microns d’épaisseur avec un poinçon de biopsie. Nettoyez les feuilles d’élastomère traitées en les immergeant dans de l’isopropanol à 70 %, puis séchez-les avec un pistolet à azote.

Placez ensuite la feuille perforée sur une serviette non pelucheuse et alignez les lamelles nettoyées sur le pochoir avec la surface de l’échantillon face au pochoir. Transférez le pochoir avec les lamelles de recouvrement sur une plaquette de support pour créer des motifs à l’échelle submillimétrique. Placez un microscope nettoyé, glissez-le sur un mandrin rotatif et soufflez toutes les particules avec un pistolet à azote.

Versez 1,5 millilitres d’hexaméthyldilane sur la lame de verre. À l’aide d’une pipette en plastique, étalez l’hexa méthyl dilane en faisant tourner la lame successivement à 500 tr/min pendant cinq secondes et à 1500 tr/min pendant 30 secondes. Une fois terminé, faites cuire la diapositive sur une plaque chauffante à 115 degrés Celsius pendant sept minutes, puis laissez-la refroidir pendant cinq minutes.

Ensuite, distribuez quatre millilitres d’une photo positive. Résistez sur la glissière en verre. Étalez la résine photosensible en faisant tourner la lame dans les conditions décrites précédemment.

Faites cuire la lame sur une plaque chauffante à 115 degrés Celsius pendant 1,5 minute et retirez-la après l’exposition aux UV et la cuisson. Dissoudre la photo exposée. Résistez en immergeant la diapositive dans une photo positive.

Résistez au révélateur pendant au moins 3,5 minutes. Lorsque vous avez terminé, rincez abondamment la lame avec de l’eau DI et inspectez les motifs développés au microscope optique. Ensuite, chargez les échantillons dans une machine de pulvérisation qui peut déposer indépendamment de l’or, de l’argent et du chrome

Nettoyez les échantillons pendant 90 secondes à 50 watts sous une atmosphère de traitement Argonne de 25 millitorr avant de commencer le dépôt de métal sous chrome pulvérisé Argonne de 10 millitorrs pendant 10 minutes à 300 watts. Ensuite, pulvérisez de l’or pendant 90 secondes à 400 watts, suivi d’une pulvérisation simultanée d’or et d’argent pendant 10 minutes avec de l’argent à 200 watts et de l’or à 100 watts. Éteignez la source de pulvérisation d’or environ 10 secondes avant d’éteindre la source de pulvérisation d’argent.

Retirez les échantillons de la machine de pulvérisation après avoir retiré les échantillons de la machine de pulvérisation. Sonicate-les dans environ 180 millilitres d’une photo positive. Décapant résistant pour 10 cycles de 22e sonication avec des pauses de deux minutes entre les cycles.

Une fois terminé, rincez les échantillons à l’eau di et séchez-les avec un pistolet à azote. Inspectez les motifs métalliques au microscope. Ensuite, décollez le pochoir en élastomère des échantillons non recouverts de résine photosensible à l’aide de deux pinces à épiler pour révéler le métal déposé.

Traitez les petites lamelles avec un plasma d’air à 10 watts pendant 30 secondes avant de les immerger dans de l’acide nitrique. Mélangez les lames du microscope en les immergeant dans un bécher à 70 % d’acide nitrique à 55 degrés Celsius pendant 15 minutes. Une fois le désalloyage terminé, rincez les échantillons en les immergeant successivement dans des béchers d’eau di trois fois chacun.

Placez les échantillons sur des serviettes non pelucheuses et séchez-les au sèche-cheveux avec un pistolet à azote. Ajustez la température d’une plaque chauffante entre 150 et 300 degrés Celsius. Ensuite, abaissez lentement les échantillons sur la surface chaude pour minimiser les changements brusques de température.

Après cinq minutes, retirez les échantillons de la plaque chauffante pour qu’ils refroidissent. Placez les échantillons d’or nanoporeux dans des boîtes en polystyrène et traitez-les avec un plasma d’air à 10 watts pendant 30 secondes. Transférez ensuite les échantillons dans des plaques de culture tissulaire à 24 puits.

Ajoutez 500 microlitres de milieu de culture complet à chacun. Rangez bien les plaques dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 jusqu’à l’ensemencement des cellules. Maintenir les cellules astrocytaires murines dans des fioles T 75 avec un milieu de culture.

Une fois que les cellules sont confluentes à 70 %, passez-les en retirant d’abord l’ancien média et en lavant les cellules avec du PBS. Voir le protocole texte pour plus de détails sur les conditions de passage. Après avoir retiré les plaques de culture de l’incubateur, aspirez les milieux usagés des puits et ensemencez les cellules sur le verre.

La couverture se glisse à une densité de 25 000 cellules par centimètre carré avec un volume final d’un millilitre. Secouez la plaque de culture pour assurer un revêtement uniforme des cellules sur les échantillons et placez la plaque de culture dans l’incubateur lorsque les cellules sont prêtes à être analysées. Retirez les fluides usagés des puits et lavez-les deux fois avec du PBS.

Une fois que les cellules ont été fixées dans 4 % de para formaldéhyde dans du PBS et lavées deux fois, perméez-les dans 500 microlitres de 0,1 % Triton X 100 dans du PBS pendant cinq minutes. Répétez le lavage PBS deux fois et transférez les cellules dans des puits propres. Appliquez 80 microlitres de solution de coloration sur les échantillons et conservez-les recouverts de papier d’aluminium pendant 20 minutes.

Après un autre lavage PBS, contre-colorez les cellules avec trois nanomolaires de DPI dans du PBS pendant cinq minutes. Lavez à nouveau les cellules avec du PBS et trempez-les dans di, puis montez les cellules sur du verre. Couvrez les lames avec un support de montage et scellez-les avec une image de vernis à ongles transparente.

L’or nanoporeux fait surface à l’aide d’un microscope électronique à balayage avec un grossissement de 50 000 x à une énergie électronique de 10 kilovolts à l’aide d’un détecteur d’électrons secondaires. Ensuite, capturez des images de cellules composites à différents endroits sur les échantillons à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée à un grossissement de 10 x avec les cubes de filtre appropriés. Ouvrez les images dans l’image J.Divisez les images en couches individuelles.

Convertissez-les en huit offres. Soustrayez l’arrière-plan et lissez-le par filtrage médian. Ajustez ensuite le seuil manuellement pour mettre en évidence les pores, les corps cellulaires et les noyaux.

Utilisez la commande watershed pour séparer les pores ou les cellules fusionnés. Définissez les paramètres d’analyse des particules et exécutez la commande pour extraire le nombre de particules, la surface moyenne et le pourcentage de couverture par particules. Enfin, modifiez les fichiers de macro inclus pour effectuer une analyse par lots de plusieurs images.

Le changement de couleur des motifs métalliques déposés avant et après l’alliage d est illustré ici. La finition argentée est due à la teneur en alliage riche en argent lors de l’alliage. Le film acquiert une teinte brun orangé visible.

Voici les caractéristiques les plus fines produites par la photolithographie. Modelage du métal. Différentes morphologies pauvres peuvent être obtenues par traitement thermique des films d’or nanoporeux.

L’image en coupe transversale révèle si les films sont désalliés uniformément en fonction de l’épaisseur du film. Les images du microscope électronique à balayage peuvent être segmentées en images binaires pour déterminer la taille et le pourcentage de couverture par les vides. Le code pour générer cette sortie peut être téléchargé à partir de la page Web JoVE.

Une image représentative de la fluorescence de cellules astrocytaires murines adhérentes cultivées sur une surface d’or nanoporeuse est illustrée ici. Les canaux individuels de l’image peuvent être divisés et segmentés pour produire des images binaires permettant d’analyser l’interaction entre les matériaux cellulaires. Les images segmentées du cytosquelette peuvent être utilisées pour quantifier la surface cellulaire et la couverture de surface.

Alors que les images segmentées du noyau cellulaire sont utiles pour le comptage cellulaire. Les codes permettant de générer ces résultats peuvent être téléchargés à partir de la page Web JoVE. Voici un résumé visuel des défaillances dans la fabrication de structures d’or nanoporeuses, y compris l’adhérence du film PO, l’absence de porosité et le traitement thermique excessif.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes suggèrent que la caractérisation électrochimique à la microscopie forestière, à la lyse cellulaire et à la PCR peut être effectuée pour répondre à d’autres questions telles que l’effet de l’adhésion cellulaire de la nanostructure et de l’expression génique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire des motifs d’or nanopores et de quantifier leurs interactions avec les cellules par analyse d’image numérique de la microscopie. Résultats. N’oubliez pas que travailler avec de l’acide nitrique, de l’acide sulfureux et du peroxyde d’hydrogène peut être extrêmement dangereux et que des précautions, y compris la mise en place d’un équipement de protection individuelle, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.