Name: Cellule structuration par photolithographie sur Défini Parylene-C: SiO 2 Substrats (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Apprenez le micro-patronnage cellulaire sur SiO₂ par photolithographie avec du parylene-C. Cette méthode permet de contrôler l'adhésion cellulaire sans agents biologiques en salle blanche.

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Ce travail a été soutenu par un Wellcome Trust doctorat clinique bourse (ECAT).

Une. Fabrication de modèles Parylene sur SiO 2: Déroulement (voir la figure 1) <ol><li> Conception souhaite configuration parylène-C en utilisant un logiciel de l&#39;éditeur de mise en page, capable de lire / écrire CIF (Caltech forme intermédiaire) ou fichiers GDS-II (base de données système graphique II). CIF et GDS-II sont l&#39;industrie des formats de fichier standard pour la mise en page intégré circuit artistique. </li><li> Commission masque de photo la production à une installation de la microélectronique appropriées, ou de faire à l&#39;interne si les installations existent. </li><li> Oxyder une plaquette de silicium dans un four horizontal atmosphérique (H 2 1,88 SLM et O 2 1,25 SLM) à 950 ° C pendant 40 min pour produire une couche de SiO 2 de 200 nm (confirmer épaisseur avec une petite tache spectroscopique réflectomètre). </li><li> Premier la plaquette oxydée avec un promoteur d&#39;adhérence silane. Maintenant dépôt de parylène-C à 22 ° C à une vitesse de 1,298 nm / mg de dimère en utilisant un système de dépôt sous vide spécifiquement conçue pour déposer du parylène. A 100nm d&#39;épaisseur revêtement de parylène-C a été utilisé pour tous les exemples présentés ci-dessous. </li><li> Suivant dépôt hexaméthyldisilazane (HMDS), le promoteur d&#39;adhérence sur la plaquette revêtue de parylène en utilisant un système de revêtement de résine photosensible appropriée. </li><li> Maintenant tourner la tranche à 4000 tpm pendant 30 secondes tout en appliquant une laque photosensible positif (conduisant à une épaisseur théorique de 1 pm), en utilisant le même système de revêtement de résine photosensible comme ci-dessus. </li><li> Doux cuire la galette pendant 60 secondes à 90 ° C. </li><li> Insérez les deux la plaquette et préfabriqué masque de photo dans un alignement de masque. </li><li> Exposer la plaquette de résine photosensible revêtue d&#39;une représentation négative des UV la configuration souhaitée parylène-C. </li><li> Cuire tranche exposée pendant 60 secondes à 110 ° C. </li><li> Retirez tous les exposés de résine photosensible de la plaquette par le développement d&#39;une solution de développement approprié. </li><li> Graver au large de la parylène non protégés. Utilisation d&#39;un système de plasma d&#39;oxygène à la gravure (à une pression de chambre de 50 mTorr, 49 sccm d&#39;O 2, une puissance de 100 W RF à 13,56 MHz, etune vitesse de gravure de 100 nm / min) pour révéler le SiO 2 sous-jacente. </li><li> Couper la tranche en utilisant une scie de découpe approprié (vitesse de broche 30000 rpm, vitesse d&#39;avance de 7 mm / s). </li><li> Rincer puces en H 2 O déminéralisée et sécher avec de l&#39;azote. </li><li> puces de magasins (indéfiniment) dans des boîtes de poussière libre jusqu&#39;au moment. </li></ol> 2. Chip Nettoyage et activation: Protocole <ol><li> Retirer résine photosensible résiduelle à partir de copeaux par lavage dans de l&#39;acétone pendant 10 sec. </li><li> Rincer à l&#39;eau distillée déminéralisée 2 O 3x. </li><li> Maquillage acide piranha frais (un ratio 05:03 de 30% de peroxyde d&#39;hydrogène et d&#39;acide sulfurique à 98%). ATTENTION: Préparer acide piranha avec grand soin. Il est un oxydant très puissant, est fortement acide, et le mélange de peroxyde d&#39;hydrogène avec de l&#39;acide sulfurique est une réaction exothermique. Effectuez cette étape dans une hotte acide. Laisser 2 min de passer après le mélange de l&#39;acide piranha mais utilisent moins de 20 min. </li><li> Puces propres et gravure par immersion dans piacide Ranha pendant 10 min. </li><li> Rincer puces 3x en H 2 O déminéralisée et transférer dans un plat de culture stérile. </li><li> Maintenant activer puces pour un patron de cellules. Par exemple, ajouter deux puces par puits dans une plaque à 6 puits, puis ajouter 2 ml de sérum fœtal bovin de manière à immerger pleinement toutes les puces. Effectuer ceci, et toutes les étapes de culture de cellules suivantes, dans des conditions stériles dans une culture tissulaire hotte à flux laminaire. </li><li> Incuber les copeaux dans le sérum de 3-12 heures à 37 ° C. REMARQUE: Les étapes 02.04 à 02.07 doit être effectuée de manière séquentielle et sans délai entre les étapes. Si l&#39;activation de sérum est retardée par ≥ 24 heures après le traitement piranha, un patron de cellules est compromise en raison de la réduction de répulsion de la cellule de SiO 2 régions. Des solutions de remplacement d&#39;activation contenant des protéines spécifiques d&#39;adhésion cellulaire peuvent être utilisés à la place du sérum de veau fœtal. Ces solutions modifient les caractéristiques d&#39;adhérence cellulaire des deux substrats contrastées (voir résultats représentatifs pour un exemple). </li&gt; </ol> 3. Placage lignées cellulaires sur-puce: Protocole <ol><li> Enlevez les morceaux de leur solution d&#39;activation et laver une fois pendant 10 secondes dans une solution saline équilibrée de Hank. </li><li> Placer la puce dans un puits de culture et de la plaque type cellulaire choisi sous forme de suspension dans son milieu de culture habituel. Densité de placage de cellule optimale dépend à la fois du type de cellule et de motifs géométriques de parylène-C sur la puce. Une densité de 5 x 10 4 cellules / ml est un point de départ raisonnable. </li><li> L&#39;imagerie est adaptée à la motivation sous-jacente pour produire un patron de cellules, mais le comportement réel de la cellule peut facilement être évaluée à l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection et un appareil photo numérique avec une lentille de relais approprié. </li></ol>

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<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li>
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<li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C%2Fsilicon+dioxide+substrates%3A+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Immersion dans de l&#39;acide de puces de piranha sert non seulement de supprimer toute matière organique résiduelle, mais aussi attaque chimiquement les surfaces du substrat. Cela est essentiel pour permettre l&#39;activation efficace avec du sérum de veau fœtal. Ne pas le faire empêche la cellule de motifs et modifie le comportement des cellules sur puce profondément. Il n&#39;est pas nécessaire de stériliser les puces après le nettoyage avec de l&#39;acide de piranha. En effet, la stérilisation par exposition aux UV a été montré pour miner un patron de cellules dans un mode dépendant de la dose 13. Il faut veiller à enlever toute résine photosensible résiduelle après le processus de photolithographie. Résine photosensible persistant peut agir comme une couche de cyto-adhésif indésirables qui remplace motifs dictés par parylene-C/SiO 2 géométrie. L&#39;acétone est efficace lors de l&#39;utilisation du procédé décrit ci-dessus de photolithographie et avec les réactifs spécifiques. Cependant, d&#39;autres types de résine photosensible peuvent nécessiter un solvant différent. Pour évaluer l&#39;impact et le succès de la différent étapes de fabrication, l&#39;angle des deux substrats contrastées de contact peuvent être mesurés. figure 2 illustre les modifications qui se produisent au cours du processus d&#39;activation de la puce. Il est probable, cependant, que l&#39;adhésif spécifique et les composants protéiques dans le sérum de répulsion permettent finalement la puce de parylène à motifs pour exercer ses caractéristiques cyto-adhésives ou cyto-répulsive respectifs. Tous les résultats représentatifs utilisés puces avec une épaisseur de parylène de 100 nm, que nous avons modelé avec succès en utilisant des couches à la fois plus épaisses et plus minces de parylène. Fait important, cette technique photolithogravure permet un plus grand contrôle tridimensionnel de configuration de parylène à celle illustrée ici. Par exemple, en utilisant une combinaison de masques photographiques, il est possible de créer des zones de parylène d&#39;épaisseur mixte. Cela ouvre la voie à la création de cultures cellulaires avec défini topographie tridimensionnelle, allant au-delà des régions tout simplement dicter de l&#39;adhésion cellulaire / répulsionsion, offrant potentiellement un moyen d&#39;intégrer les canaux microfluidiques dans la construction. Comme le montre, cependant, cette plate-forme de structuration n&#39;est pas universellement efficace dans tous les types cellulaires. Des lignées cellulaires différentes, avec leurs profils variés de molécules d&#39;adhésion cellulaire, se comportent différemment lorsqu&#39;ils sont cultivés sans surprise sur cette plate-forme. Nous n&#39;avons pas encore identifié les éléments clés dans le sérum, ni les récepteurs de la membrane cellulaire gratuits, qui sous-tendent cette plate-forme cellulaire de motifs. Faire à l&#39;avenir promet d&#39;élargir son utilité et spécificité. Par exemple, une lignée de cellules &quot;non-patterning&quot; pourrait être génétiquement modifié pour exprimer la molécule d&#39;adhésion requis et ainsi de promouvoir la structuration.

Mécanismes qui dictent l&#39;adhésion cellulaire et la structuration de matériaux synthétiques Comprendre est important pour des applications telles que l&#39;ingénierie tissulaire, la découverte de médicaments, et la fabrication de biocapteurs 1-3. De nombreuses techniques sont disponibles et en évolution, chaque profitant des facteurs biologiques, chimiques et physiques qui influent sur une myriade de l&#39;adhésion cellulaire. Ici, nous décrivons une technique de cellule de motif, qui utilise les procédés développés initialement à des fins de fabrication microélectroniques. En tant que tel, la plate-forme est bien placé pour permettre une intégration en aval de technologies microélectroniques, tels que les AEM, dans la plate-forme de structuration. L&#39;interface entre la membrane cellulaire et un matériau adjacent est bidirectionnel et complexe. In vivo, les protéines de la matrice extracellulaire fournissent la structure et la force et l&#39;impact sur ​​le comportement des cellules par l&#39;intermédiaire d&#39;interactions avec des récepteurs d&#39;adhésion cellulaire. De même, les cellules de vITRO interagir avec des substrats synthétiques par des couches de protéines absorbées 4 tandis que les influences physico-chimiques modulent également l&#39;adhérence. Par exemple, une surface de polymère peut être rendu plus &quot;mouillable&quot; (hydrophile) par irradiation par des ions ou des rayons ultraviolets, ou la gravure par traitement avec de l&#39;acide ou de l&#39;hydroxyde 5. Méthodes établies pour un patron de cellules de profiter de ces et d&#39;autres médiateurs d&#39;adhésion cellulaire. Les exemples incluent impression jet d&#39;encre 6, 7 microcontact estampage, l&#39;immobilisation physique 8, 9 microfluidique, la manipulation en temps réel de 10, et la structuration sélective moléculaire de montage (SMAP) 11. Chacun a des avantages et des limites spécifiques. Un facteur clé dans notre travail, cependant, est d&#39;intégrer un patron de cellules avec les systèmes micro-électromécaniques (MEMS). MEMS se réfèrent à très petits dispositifs mécaniques d&#39;entraînement par l&#39;électricité. Cette chevauche l&#39;échelle nanométrique équivalent, nanoelectromechsystèmes anical. Ce concept est devenu pratique uniquement lorsque les stratégies de semi-conducteurs ont permis la fabrication aura lieu à l&#39;échelle microscopique. techniques de microfabrication développées à l&#39;origine pour des produits électroniques de semi-conducteurs ont été trouvés par inadvertance utile pour d&#39;autres utilisations telles que l&#39;électrophysiologie cellulaire, par exemple. Un but en aval clé est de combiner ces technologies microélectroniques avec un processus de structuration de la cellule de haute fidélité (formation d&#39;un dispositif bioMEMS). Plusieurs techniques cellules structuration existantes et autrement fiables et pratiques sont incompatibles avec cette idée. Par exemple, un alignement précis des biocapteurs ou des micro-électronique embarqué est essentielle à leur efficacité, mais il est extrêmement difficile à réaliser en utilisant une technique telle que l&#39;estampage microcontact. Pour contourner ce problème, nous travaillons sur une plate-forme de motifs de base de SiO 2 qui utilise photolithographie imprimé parylène-C. Photolithographie implique le transfert de caractéristiques géométriques deun masque sur un substrat par l&#39;intermédiaire d&#39;une illumination UV. Un masque est conçu en utilisant un programme de conception assistée par ordinateur approprié. Sur une plaque de verre, une mince couche de chrome opaque représente la configuration géométrique souhaitée (une résolution de caractéristique de 1-2 mm est possible). Le substrat à motif est revêtue d&#39;une mince couche de résine photosensible (un polymère sensible à l&#39;UV). Le polymère est ensuite revêtu aligné et mis en contact étroit avec le masque. Une source de rayons UV est appliquée de telle sorte que les zones non protégées sont irradiés et donc devenir soluble et amovible dans l&#39;étape de développement suivante, en laissant une représentation du parylène-C de la configuration de masque derrière. Ce processus a commencé pendant le développement de dispositifs semi-conducteurs. En tant que tel, des tranches de silicium sont fréquemment utilisés en tant que substrat. Dépôt de photolithographie de parylène C sur SiO 2 est donc un processus simple et fiable qui a lieu régulièrement en salle blanche microélectronique. Alors que parylène aplusieurs caractéristiques souhaitables de bio-ingénierie (chimiquement inerte, non bio-dégradables), un facteur limitant son utilisation directe dans la structuration de la cellule est son adhérence cellulaire innée pauvres, attribué en partie à l&#39;extrême hydrophobie. Néanmoins, le parylène-C a déjà été utilisé indirectement pour produire un patron de cellules, par exemple en tant que matrice cellulaire pelable 12,13. Cette approche est limitée par la faible résolution et nécessite plusieurs étapes. Le procédé décrit ici utilise à la place d&#39;une étape d&#39;attaque acide, suivie d&#39;une incubation de sérum, de sorte que les régions du parylène-C deviennent cellule-adhésif, à travers une combinaison de la réduction du caractère hydrophobe et la protéine de liaison sérum. Le résultat final est une construction composée de deux substrats différents qui, après activation biologique, manifestent des caractéristiques cyto-adhésives ou cyto-répulsion respectifs et représente une plate-forme efficace de crépitement de cellule ainsi. Fait important, il n&#39;est pas nécessaire d&#39;introduire ag biologiqueents dans l&#39;installation de salle blanche selon les substrats à motifs peuvent être stockées indéfiniment avant utilisation (la suite de quoi ils sont activés à l&#39;aide de sérum bovin fœtal ou d&#39;une autre solution d&#39;activation). Cette parylene-C/SiO 2 plate-forme de structuration est donc un bon candidat pour une coalition avec des composants MEMS, comme les procédés de fabrication afin reflètent étroitement celles utilisées pour la fabrication microélectronique.

<table><tbody><tr><td>Progiciel d’édition de mise en page</td><td>CleWin 5.0 de WieWeb</td><td></td><td>Capable de lire/écrire des fichiers CIF ou GDS-II. Utilisé pour créer un design en parylène pour la fabrication de masques photo. http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td></tr><tr><td>Masque photo sur mesure</td><td>Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Écosse</td><td></td><td>Soit fabriquer en interne des installations existantes, soit commander. www.compugraphics-photomasks.com</td></tr><tr><td>3 en plaquettes de silicium</td><td>Siltronix, Archamps, France</td><td></td><td>http://www.siltronix.com</td></tr><tr><td>Four horizontal atmosphérique</td><td>Sandvik</td><td></td><td>Pour oxyder les plaquettes de silicium. http://www.mrlind.com</td></tr><tr><td>Réflectomètre spectroscopique à petit point</td><td>Nanométrie</td><td></td><td>Pour mesurer la profondeur de la couche de dioxyde de silicium. www.nanometrics.com/ Promoteur d’adhésion</td></tr> au <tr><td>silane</td>, <td>Merck Chemicals</td><td>1076730050</td><td>Préappliqué sur la plaquette pour favoriser le dépôt de parylène. www.merck-chemicals.de/</td></tr> <tr><td>Parylene-C</td><td>Ultra Electronics</td><td></td><td>www.ultra-cems.com</td></tr><tr><td>Unité de dépôt SCS Labcoter 2, modèle PDS2010</td><td>SCS Equipment, Surrye, Royaume-Uni</td><td>Modèle PDS2010</td><td></td></tr> <tr><td>www.scscoatings.com/ Hexaméthyldisilazane (HMDS) promoteur d’adhésion</td><td>SpiChem</td><td></td><td>www.2spi.com</td></tr><tr><td>Système de piste automatisé pour la distribution de résine photosensible sur les plaquettes ; Piste photosensible 3 pouces</td><td>SVG (Silicon Valley Group)</td><td></td><td>Système de piste automatisé pour la distribution de résine photosensible sur des plaquettes. Un four de premier ordre cuit la plaquette et distribue le promoteur d’adhérence, HMDS. Une toupie combinée distribue la résine photosensible. Le four de précuisson durcit la réserve.</td></tr><tr><td>Photo-résistant</td><td>Rohm & Haas</td><td>SPR350-1.2 photo-resist</td><td>positif www.rohmhaas.com/</td></tr> <tr><td>aligneur de photo-masque MA/BA8</td><td>Suss Microtech</td><td></td><td>www.suss.com</td></tr><tr><td>Microchem MF-26A développeur</td><td>Microchem</td><td></td><td>Élimine les régions exposées de photorésine. www.microchem.com</td></tr><tr><td>JLS RIE80 système de gravure plasma</td><td>JLS Designs Supprime</td><td></td> les <td>régions exposées de parylène. www.jlsdesigns.co.uk</td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>DISCO DAD 680 Scie à découper les plaquettes</td><td>DISCO Corporation, Japon</td><td></td><td>www.disco.co.jp</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>Pour éliminer la résine photosensible résiduelle.</td></tr><tr><td>30 % de peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>98 % d’acide sulfurique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435589</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>10437</td><td>Activation standard de la puce. www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>solution saline équilibrée de Hank’s</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>14170</td><td>www.invitrogen.com</td></tr></tbody></table>

cellule structuration par photolithographie sur défini parylene-c: sio<sub&gt; 2</sub&gt; substrats

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Plates-formes cellule de motifs d&#39;appuyer les objectifs de recherche généraux, tels que la construction de réseaux de neurones prédéfinis in vitro et l&#39;exploration de certains aspects centraux de la physiologie cellulaire. Pour combiner facilement un patron de cellules avec Multi-Electrode Arrays (AME) et à base de silicium «laboratoire sur puce» technologies, un protocole de microfabrication-compatible est nécessaire. Nous décrivons un procédé qui utilise le dépôt du polymère de parylène-C sur SiO 2 gaufrettes. Photolithographie permet de motifs précis et fiable de parylène-C à une résolution au niveau du micron. Après activation par immersion dans du sérum de veau fœtal (ou d&#39;une autre solution d&#39;activation spécifique) conduit à un substrat dans lequel les cellules cultivées adhèrent à, ou sont repoussés par, le parylène ou de SiO 2, respectivement les régions. Cette technique a permis la structuration d&#39;une large gamme de types de cellules (y compris les cellules murines hippocampiques primaires, des cellules HEK 293, une lignée cellulaire de tératocarcinome humain neurone-likelignée cellulaire, les cellules granulaires du cervelet primaires murins, et cellules humaines primaires en forme de tige gliome-dérivée). Il est intéressant, cependant, la plate-forme n&#39;est pas universel; reflétant l&#39;importance des molécules d&#39;adhésion cellulaires spécifiques. Ce processus de structuration de la cellule est rentable, fiable, et surtout peut être incorporé dans la microfabrication norme (fabrication de la puce) les protocoles, ouvrant la voie à l&#39;intégration de la technologie microélectronique.

Le procédé de photolithographie un motif de SiO 2 de parylène-C est illustrée sur la figure 1. Une fois préparé, l&#39;activation de puces dans du sérum bovin fœtal permet une large gamme de types de cellules à être modelées en culture. Notre groupe a modelé avec succès des cellules hippocampiques murines primaires 14-16, la ligne HEK 293 de la cellule 17, le tératocarcinome humain de neurone comme (hNT) lignée cellulaire 18, les cellules primaires granulaires du cervelet de souris et des cellules humaines primaires souches comme gliome dérivés. La figure 3 illustre un motif solide de cellules HEK 293 sur un modèle de parylène constitué de nœuds circulaires avec les extensions «réticule». l&#39;activation de la puce dans cet exemple est de sérum bovin fœtal. En revanche, la figure 4 illustre le potentiel pour augmenter la plate-forme de formation de motifs en utilisant des solutions d&#39;activation alternative. Utilisation d&#39;une solution de sérum-albumine bovine (3 mg / ml) et<html> la fibronectine (1 pg / ml) dans du HBSS, le motif précepte précédent a été inversé. La figure 5 illustre un autre type de cellule (une ligne primaire d&#39;origine humaine comme tige-cellule dérivée d&#39;un gliome de grade élevé). Ici, la géométrie du comportement cellulaire des impacts de motif sous-jacent, le motif représenté sur la figure 4A la promotion de la croissance de la cellule le long processus de parylène-C mince écoutes comme représenté sur les figures 4B et 4C. Certains types de cellules ne motif lors de l&#39;utilisation du protocole d&#39;activation de sérum bovin fœtal établi. Figure 6 illustre des cellules 3T3 L1 croissance jusqu&#39;à confluence avec aucune différence discernable cyto-répulsive ou cyto-adhésif entre les deux régions du parylène-C et SiO. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Schéma illustrant le procédé de fabrication de motifs de parylène-C sur SiO 2. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> Figure 2. Diagramme de flux illustrant les variations de l&#39;angle de contact pour les motifs parylène-C et de SiO 2 domaines pendant les étapes d&#39;activation de puce. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> Figure 3. Imagerie des cellules vivantes de HEK 293 cellules cultivées sur parylene-C/SiO 2 après trois jours in vitro. Chips incubé pendant 3 heures dans le sérum fœtal bovin, après quoi les cellules ont étéplaqué en suspension à une concentration de 5 x 10 4 cellules / ml. Parylène C favorise l&#39;adhérence cellulaire tout nu SiO 2 repousse les cellules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> Figure 4. Imagerie des cellules vivantes de HEK 293 cellules cultivées sur parylene-C/SiO 2 après trois jours in vitro Chips activées pendant 3 heures dans différentes solutions d&#39;activation rationalisé:. A: sérum de veau foetal, B: vitronectine (1 pg / ml) dans du HBSS, C: la sérum-albumine bovine (3 mg / ml) + vitronectine (1 pg / ml) dans du HBSS, D: albumine bovine de sérum (3 mg / ml) + fibronectine (156; g / ml) dans du HBSS. Les cellules ont été étalées en suspension à une densité de 5 x 10 4 cellules / ml. Notez comment un traitement différent de la puce a abouti à l&#39;inversion du dogme de structuration précédente, avec SiO 2 maintenant adhésif et parylène-C répulsive. Diamètre de noeud parylène-C 250 um, adapté de Hughes et al. 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> Figure 5. images d&#39;immunofluorescence de cellules humaines primaires souches comme gliome dérivés cultivées sur divers modèles de parylène C sur SiO 2 A:. schématique illustrant la conception réticulaire de parylène montré en B et C </strong&gt; B:.. Fluorescence au microscope de cellules fixes (après 4 jours in vitro) teinté de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) C:. Micrographie lumière de cellules vivantes sur une même puce D: l&#39;image de fluorescence illustrant cellules GFAP-colorées sur un parylène différente E conception:.. l&#39;image de réflectance du nœud et parlé conception de parylène imagé dans D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> Figure 6. Imagerie des cellules vivantes de cellules 3T3 L1 cultivées sur parylene-C/SiO 2 après quatre jours in vitro. Chips activées pendant 3 heures dans le sérum fœtal bovin après which cellules ont été étalées en suspension (3 x 10 4 cellules / ml). Dans ce cas, la plate-forme ne permet pas de motifs, avec des cellules de devenir aussi confluentes sur parylène-C et SiO 2 régions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Ce protocole décrit un procédé de microfabrication compatible pour un patron de cellules de SiO 2. Une conception prédéfinie parylène-C par photolithographie est imprimé à la SiO 2 gaufrettes. Après incubation des cellules avec du sérum (ou une autre solution d&#39;activation) adhèrent spécifiquement (et se développent en fonction de la conformité des) sous-jacent parylène-C, tout en étant repoussé par SiO 2 régions.

Cellule structuration par photolithographie sur Défini Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrats

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Le but général de cette procédure est de structurer des cellules sur des surfaces en dioxyde de silicium selon un motif sous-jacent prédéfini de paraline. Cela est réalisé en créant d'abord un masque photolithographique du motif souhaité. La deuxième étape consiste à oxyder puis à recouvrir une tranche de silicium d'une couche de paraline.Les procédés photolithographiques suivants, réalisés dans une installation de salle blanche pour la microélectronique, permettent de graver sélectivement le revêtement paraline afin de faire apparaître le motif désiré. La dernière étape consiste à activer les puces à l'aide d'acide piranha, puis à les incuber dans du sérum de veau fœtal pendant trois à douze heures, après quoi une suspension cellulaire peut être appliquée pour culture. Enfin, la disposition cellulaire peut être évaluée soit par imagerie de cellules vivantes à l'aide d'un microscope stéréoscopique, soit après fixation par microscopie de fluorescence confocale.L'avantage principal de cette technique par rapport à plusieurs plates-formes existantes de dessin de cellules réside dans le fait qu'il n'est pas nécessaire d'introduire d'agents biologiques dans la salle blanche. De plus, les puces de motif peuvent être conservées indéfiniment jusqu'à ce qu'elles soient activées par de l'acide paraparfumique puis par du sérum. Pour concevoir la configuration de paraline C souhaitée, utilisez un logiciel éditeur de plan capable de lire et d'écrire des fichiers CIF ou GDS2.Externaliser la fabrication du masque photographique vers un établissement de microélectronique approprié ou le réaliser en interne. Si les installations existent, oxyder une tranche de silicium dans un four horizontal atmosphérique à 950 degrés Celsius pendant 40 minutes afin d'obtenir une couche de dioxyde de silicium de 200 nanomètres. Ensuite, confirmer l'épaisseur à l’aide d’un petit point.Reflectomètre spectroscopique. Placer les plaquettes dans le système de dépôt sous vide et appliquer le promoteur d'adhérence sine sur la face intérieure du couvercle de la chambre. Pendant le cycle de pompage, le promoteur d'adhérence sine recouvre la charge de plaquettes oxydées, puis le paraline est déposé dans le four à température ambiante à raison de 1,3 nanomètre par milligramme de dimère à l’aide d’un système de dépôt sous vide.Après cela, déposez un promoteur d'adhésion HMDS sur la tranche recouverte de paraline. À l'aide d'un système approprié de revêtement par résine photosensible, faites tourner la tranche à 4 000 tr/min pendant 30 secondes tout en appliquant une résine photosensible positive afin d'obtenir une épaisseur d'un micron à l'aide du système de revêtement par résine photosensible, puis effectuez une cuisson douce de la tranche pendant 60 secondes à 90 degrés Celsius. Insérez ensuite à la fois la tranche et le masque photolithographique préfabriqué dans un aligneur de masque.Exposer la plaquette recouverte de photo-résist à la lumière UV afin de transférer le motif souhaité dans le photo-résist. Ensuite, faire cuire la plaquette exposée pendant 60 secondes à 110 degrés Celsius. Puis éliminer tout le photo-résist exposé de la plaquette en la développant dans une solution révélatrice appropriée, suivie de l'élimination de la paraline non protégée à l'aide d'un système de gravure au plasma d'oxygène pour révéler le dioxyde de silicium sous-jacent.Ensuite, conservez les puces après le découpage dans des boîtes exemptes de poussière jusqu'à ce qu'elles soient nécessaires. Dans cette procédure, éliminez le photo-résist résiduel des puces en les lavant avec de l'acétone pendant 10 secondes. Rincez-les ensuite trois fois dans de l'H2O distillée désionisée, préparez ensuite du nouveau piranha frais dans une hotte aspirante acide, puis nettoyez et gravez les puces par immersion dans l'acide piranha pendant 10 minutes.Ensuite, rincez les puces trois fois dans de l'eau désionisée H2O et transférez-les dans une boîte de culture stérile sous hotte de culture laminaires. Activez les puces pour le dessin cellulaire en plaçant deux puces par puits dans une plaque de six puits. Ajoutez ensuite deux millilitres de sérum bovin fœtal afin d'immerger complètement toutes les puces.Incubez les puces dans le sérum pendant trois à douze heures à 37 degrés Celsius. Retirez maintenant les puces de leur solution d'activation. Lavez une fois pendant 10 secondes dans une solution saline équilibrée de Hank.Ensuite, placez les puces dans un puits de culture et semez le type de cellule choisi en suspension dans son milieu de croissance habituel. La densité optimale de semis cellulaire dépend à la fois du type de cellule et du motif géométrique de la paraline C sur la puce. Une densité de cinq fois dix puissance quatre cellules par millilitre constitue un point de départ raisonnable.L'imagerie est adaptée à la motivation sous-jacente de la structuration cellulaire, mais le comportement des cellules vivantes peut facilement être évalué à l'aide d'un microscope stéréoscopique et d'une caméra numérique équipée d'un objectif de relais approprié. Voici l'imagerie de cellules vivantes de HEC 2 93 cultivées sur du dioxyde de silicium paraligné C après trois jours. In vitro, les supports avaient été incubés pendant trois heures dans du sérum de veau fœtal, et les cellules ont été ensemencées en suspension à une concentration de cinq fois 10 à la puissance quatre cellules par millilitre.Le paraline C favorise l'adhérence cellulaire, tandis que le dioxyde de silicium nu repousse les cellules. Cette figure montre les images d'immunofluorescence de cellules souches de type souche dérivées de gliomes humains primaires cultivées sur divers motifs de paraline C déposés sur du dioxyde de silicium. Ici, le schéma illustre le motif réticulé de paraline C, la microphotographie de fluorescence de cellules fixées marquées pour la protéine acide fibrillaire gliale, et la microphotographie en lumière ordinaire de cellules vivantes sur la même puce.Voici une image fluorescente illustrant des cellules marquées pour la GFAP sur un autre motif paralinéaire, ainsi que l’image de réflectance du nœud en conception paralinéaire à rayons. Cette figure montre l’imagerie de cellules vivantes de trois cellules T trois L un cultivées sur du dioxyde de silicium C paralinéaire. Après quatre jours in vitro, les puces ont été activées pendant trois heures dans du sérum de veau fœtal, et les cellules ont été mises en culture en suspension à une concentration de cinq fois dix puissance quatre cellules par millilitre.Dans ce cas, la plateforme ne permet pas la structuration, les cellules devenant également confluentes sur les régions de Lene C et de dioxyde de silicium. Lors de l'exécution de ce protocole, il est important de se rappeler que l'activation par le sérum doit avoir lieu immédiatement après le traitement au piranha. Le fait de ne pas le faire compromet le processus de structuration.N'oubliez pas que le travail avec l'acide piranha peut être extrêmement dangereux. Préparez et utilisez l'acide piranha sous hotte chimique et assurez-vous de porter des lunettes de protection, une blouse de laboratoire et des gants adaptés.

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