Cellule structuration par photolithographie sur Défini Parylene-C: SiO 2 Substrats

L’objectif global de cette procédure est de modéliser les cellules sur les services de dioxyde de silicium selon une conception sous-jacente prédéfinie de paraline. Pour ce faire, il suffit de créer d’abord un masque photo du motif souhaité. La deuxième étape consiste à oxyder puis à enduire une plaquette de silicium de paraline.

Ensuite, des processus photolithographiques réalisés dans une salle blanche de microélectronique sont utilisés pour graver sélectivement le revêtement paraline afin de révéler le design souhaité. La dernière étape consiste à activer les puces en utilisant d’abord de l’acide piranha, puis à incuber dans du sérum de veau fœtal pendant trois à 12 heures, après quoi une suspension cellulaire peut être appliquée pour la culture. En fin de compte, la structuration cellulaire peut être évaluée soit par imagerie de cellules vivantes à l’aide d’un microscope de dissection, soit après fixation à l’aide de la microscopie à fluorescence confocale.

Le principal avantage de cette technique par rapport à plusieurs plateformes de structuration cellulaire existantes est qu’il n’est pas nécessaire d’introduire des agents biologiques dans la salle blanche. De plus, les puces de motif peuvent être conservées indéfiniment jusqu’à ce qu’elles soient activées d’abord avec de l’acide pur, puis du sérum. Pour concevoir la configuration paraligne C souhaitée, utilisez un progiciel d’édition de mise en page capable de lire, d’écrire deux fichiers CIF ou GDS.

Sous-traitez le fabricant de masques photo à une installation de microélectronique appropriée ou à une fabrication interne. S’il existe des installations, oxydez une plaquette de silicium dans un four horizontal atmosphérique à 950 degrés Celsius pendant 40 minutes pour produire une couche de dioxyde de silicium de 200 nanomètres. Après cela, confirmez l’épaisseur avec un petit point.

Réflectomètre spectroscopique. Placez les plaquettes dans le système de dépôt sous vide, appliquez un promoteur d’adhérence sinusoïdale à l’intérieur du couvercle de la chambre. Au cours du cycle de pompage, le promoteur d’adhérence sinusoïdale enrobe la paraligne de charge de plaquette oxydée dans la paraligne de dépôt C du four à température ambiante à un taux de 1,3 nanomètre par milligramme de dimère à l’aide d’un système de dépôt sous vide.

Après cela, déposez le promoteur d’adhérence HMDS sur la plaquette recouverte de paraline. À l’aide d’un système de revêtement photosensible approprié, faites tourner la plaquette à 4 000 tr/min pendant 30 secondes tout en appliquant une résine photosensible positive afin d’obtenir une épaisseur d’un micron à l’aide du système de revêtement photorésistant, puis faites cuire la plaquette pendant 60 secondes à 90 degrés Celsius. Insérez maintenant la plaquette et le masque photo préfabriqué dans un aligneur de masque.

Exposez la plaquette recouverte d’une résine photosensible avec une lumière UV afin de transférer le motif souhaité dans la résine photosensible. Ensuite, faites cuire la gaufrette exposée pendant 60 secondes à 110 degrés Celsius. Ensuite, retirez toute la résine photosensible exposée de la plaquette en la développant dans une solution de développement appropriée à Hoff la paraline non protégée en utilisant un système de gravure au plasma d’oxygène pour révéler le dioxyde de silicium sous-jacent.

Rangez ensuite les chips après les dés dans des boîtes sans poussière jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Dans cette procédure, retirez la résine photosensible résiduelle des copeaux en lavant une acétone pendant 10 secondes. Ensuite, rincez-les trois fois dans du H2O distillé désionisé, faites de l’acide piranha frais dans une hotte acide ensuite, nettoyez et gravez les copeaux en les immergeant dans de l’acide piana pendant 10 minutes.

Ensuite, rincez les copeaux trois fois dans du H2O désionisé et transférez-les dans une boîte de culture stérile dans une hotte de culture de tissus à flux laminaire. Activez les puces pour la structuration des cellules en plaçant deux puces par puits dans une plaque à six puits. Ensuite, ajoutez deux millilitres de sérum fœtal bovin afin d’immerger complètement toutes les puces.

Incuber les copeaux dans du sérum pendant trois à 12 heures à 37 degrés Celsius. Retirez maintenant les puces de leur solution d’activation. Lavez une fois pendant 10 secondes dans la solution saline équilibrée de Hank.

Placez ensuite les puces dans un puits de culture et plaquez le type de cellule choisi en suspension dans son milieu de croissance habituel. La densité optimale de placage cellulaire dépend à la fois du type de cellule et du motif géométrique de la paraligne C sur la puce. Une densité de cinq fois 10 à la quatrième cellule par millilitre est un point de départ raisonnable.

L’imagerie est adaptée à la motivation sous-jacente de la structuration cellulaire, mais le comportement des cellules vivantes peut facilement être évalué à l’aide d’un microscope de dissection et d’une caméra numérique avec un objectif relais approprié. Voici l’imagerie de cellules vivantes de 93 cellules HEC cultivées sur du dioxyde de silicium paraline C après trois jours. In vitro, les vaisseaux avaient été incubés pendant trois heures dans du sérum de veau fœtal, et les cellules avaient été mises en suspension à une concentration de cinq fois 10 contre quatre cellules par millilitre.

La paraline C favorise l’adhésion cellulaire tandis que le dioxyde de silicium nu repousse les cellules. Cette figure montre les images d’immunofluorescence de cellules souches primaires dérivées d’un gliome humain cultivées sur divers modèles de paraligne C sur du dioxyde de silicium. Ici, le schéma illustre la conception de la paraline réticulaire, la micrographie de fluorescence des cellules fixes colorées pour la protéine acide fibrillaire gliale et la micrographie optique des cellules vivantes sur la même puce.

Voici une image fluorescente illustrant des cellules colorées GFAP sur une conception de paraligne différente et l’image de réflectance du nœud dans la conception de paraline en rayon. Et cette figure montre l’imagerie de cellules vivantes de trois cellules T trois L one cultivées sur du dioxyde de silicium paraline C. Après quatre jours in vitro, les puces avaient été activées pendant trois heures dans du sérum de veau fœtal, et les cellules ont été mises en suspension à une concentration de cinq fois 10 des quatrièmes cellules par millilitre.

Dans ce cas, la plate-forme ne permet pas de structurer les cellules devenant également confluentes sur les régions de Lene C et de dioxyde de silicium. Lors de l’exécution de ce protocole, il est important de se rappeler que l’activation sérique doit se produire immédiatement après le traitement du piranha. Ne pas le faire entraîne une sape du processus de structuration.

N’oubliez pas que travailler avec de l’acide piranha peut être extrêmement dangereux. Préparez et utilisez de l’acide piranha dans une hotte chimique et assurez-vous de porter des lunettes de protection, des blouses de laboratoire et des gants appropriés.