Cellule structuration par photolithographie sur Défini Parylene-C: SiO 2 Substrats
7 mars 2014
Ce protocole décrit un procédé de microfabrication compatible pour un patron de cellules de SiO 2. Une conception prédéfinie parylène-C par photolithographie est imprimé à la SiO 2 gaufrettes. Après incubation des cellules avec du sérum (ou une autre solution d'activation) adhèrent spécifiquement (et se développent en fonction de la conformité des) sous-jacent parylène-C, tout en étant repoussé par SiO 2 régions.
L’objectif global de cette procédure est de modéliser les cellules sur les services de dioxyde de silicium selon une conception sous-jacente prédéfinie de paraline. Pour ce faire, il suffit de créer d’abord un masque photo du motif souhaité. La deuxième étape consiste à oxyder puis à enduire une plaquette de silicium de paraline.
Ensuite, des processus photolithographiques réalisés dans une salle blanche de microélectronique sont utilisés pour graver sélectivement le revêtement paraline afin de révéler le design souhaité. La dernière étape consiste à activer les puces en utilisant d’abord de l’acide piranha, puis à incuber dans du sérum de veau fœtal pendant trois à 12 heures, après quoi une suspension cellulaire peut être appliquée pour la culture. En fin de compte, la structuration cellulaire peut être évaluée soit par imagerie de cellules vivantes à l’aide d’un microscope de dissection, soit après fixation à l’aide de la microscopie à fluorescence confocale.
Le principal avantage de cette technique par rapport à plusieurs plateformes de structuration cellulaire existantes est qu’il n’est pas nécessaire d’introduire des agents biologiques dans la salle blanche. De plus, les puces de motif peuvent être conservées indéfiniment jusqu’à ce qu’elles soient activées d’abord avec de l’acide pur, puis du sérum. Pour concevoir la configuration paraligne C souhaitée, utilisez un progiciel d’édition de mise en page capable de lire, d’écrire deux fichiers CIF ou GDS.
Sous-traitez le fabricant de masques photo à une installation de microélectronique appropriée ou à une fabrication interne. S’il existe des installations, oxydez une plaquette de silicium dans un four horizontal atmosphérique à 950 degrés Celsius pendant 40 minutes pour produire une couche de dioxyde de silicium de 200 nanomètres. Après cela, confirmez l’épaisseur avec un petit point.
Réflectomètre spectroscopique. Placez les plaquettes dans le système de dépôt sous vide, appliquez un promoteur d’adhérence sinusoïdale à l’intérieur du couvercle de la chambre. Au cours du cycle de pompage, le promoteur d’adhérence sinusoïdale enrobe la paraligne de charge de plaquette oxydée dans la paraligne de dépôt C du four à température ambiante à un taux de 1,3 nanomètre par milligramme de dimère à l’aide d’un système de dépôt sous vide.
Après cela, déposez le promoteur d’adhérence HMDS sur la plaquette recouverte de paraline. À l’aide d’un système de revêtement photosensible approprié, faites tourner la plaquette à 4 000 tr/min pendant 30 secondes tout en appliquant une résine photosensible positive afin d’obtenir une épaisseur d’un micron à l’aide du système de revêtement photorésistant, puis faites cuire la plaquette pendant 60 secondes à 90 degrés Celsius. Insérez maintenant la plaquette et le masque photo préfabriqué dans un aligneur de masque.
Exposez la plaquette recouverte d’une résine photosensible avec une lumière UV afin de transférer le motif souhaité dans la résine photosensible. Ensuite, faites cuire la gaufrette exposée pendant 60 secondes à 110 degrés Celsius. Ensuite, retirez toute la résine photosensible exposée de la plaquette en la développant dans une solution de développement appropriée à Hoff la paraline non protégée en utilisant un système de gravure au plasma d’oxygène pour révéler le dioxyde de silicium sous-jacent.
Rangez ensuite les chips après les dés dans des boîtes sans poussière jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Dans cette procédure, retirez la résine photosensible résiduelle des copeaux en lavant une acétone pendant 10 secondes. Ensuite, rincez-les trois fois dans du H2O distillé désionisé, faites de l’acide piranha frais dans une hotte acide ensuite, nettoyez et gravez les copeaux en les immergeant dans de l’acide piana pendant 10 minutes.
Ensuite, rincez les copeaux trois fois dans du H2O désionisé et transférez-les dans une boîte de culture stérile dans une hotte de culture de tissus à flux laminaire. Activez les puces pour la structuration des cellules en plaçant deux puces par puits dans une plaque à six puits. Ensuite, ajoutez deux millilitres de sérum fœtal bovin afin d’immerger complètement toutes les puces.
Incuber les copeaux dans du sérum pendant trois à 12 heures à 37 degrés Celsius. Retirez maintenant les puces de leur solution d’activation. Lavez une fois pendant 10 secondes dans la solution saline équilibrée de Hank.
Placez ensuite les puces dans un puits de culture et plaquez le type de cellule choisi en suspension dans son milieu de croissance habituel. La densité optimale de placage cellulaire dépend à la fois du type de cellule et du motif géométrique de la paraligne C sur la puce. Une densité de cinq fois 10 à la quatrième cellule par millilitre est un point de départ raisonnable.
L’imagerie est adaptée à la motivation sous-jacente de la structuration cellulaire, mais le comportement des cellules vivantes peut facilement être évalué à l’aide d’un microscope de dissection et d’une caméra numérique avec un objectif relais approprié. Voici l’imagerie de cellules vivantes de 93 cellules HEC cultivées sur du dioxyde de silicium paraline C après trois jours. In vitro, les vaisseaux avaient été incubés pendant trois heures dans du sérum de veau fœtal, et les cellules avaient été mises en suspension à une concentration de cinq fois 10 contre quatre cellules par millilitre.
La paraline C favorise l’adhésion cellulaire tandis que le dioxyde de silicium nu repousse les cellules. Cette figure montre les images d’immunofluorescence de cellules souches primaires dérivées d’un gliome humain cultivées sur divers modèles de paraligne C sur du dioxyde de silicium. Ici, le schéma illustre la conception de la paraline réticulaire, la micrographie de fluorescence des cellules fixes colorées pour la protéine acide fibrillaire gliale et la micrographie optique des cellules vivantes sur la même puce.
Voici une image fluorescente illustrant des cellules colorées GFAP sur une conception de paraligne différente et l’image de réflectance du nœud dans la conception de paraline en rayon. Et cette figure montre l’imagerie de cellules vivantes de trois cellules T trois L one cultivées sur du dioxyde de silicium paraline C. Après quatre jours in vitro, les puces avaient été activées pendant trois heures dans du sérum de veau fœtal, et les cellules ont été mises en suspension à une concentration de cinq fois 10 des quatrièmes cellules par millilitre.
Dans ce cas, la plate-forme ne permet pas de structurer les cellules devenant également confluentes sur les régions de Lene C et de dioxyde de silicium. Lors de l’exécution de ce protocole, il est important de se rappeler que l’activation sérique doit se produire immédiatement après le traitement du piranha. Ne pas le faire entraîne une sape du processus de structuration.
N’oubliez pas que travailler avec de l’acide piranha peut être extrêmement dangereux. Préparez et utilisez de l’acide piranha dans une hotte chimique et assurez-vous de porter des lunettes de protection, des blouses de laboratoire et des gants appropriés.
Aperçu
Ce protocole décrit une méthode de dessin cellulaire sur du dioxyde de silicium (SiO2) à l'aide de parylène-C. Les cellules adhèrent aux régions de parylène-C tout en étant repoussées par le SiO2, ce qui permet d'obtenir des motifs de croissance contrôlés.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Agencement cellulaire
- Microfabrication
- Applications en neurosciences
Contexte
- Le façonnage des cellules est essentiel pour l'étude du comportement cellulaire.
- Le parylène-C sert de substrat à l'adhésion cellulaire.
- Le dioxyde de silicium est utilisé pour ses propriétés répulsives vis-à-vis des cellules.
- Cette méthode évite la contamination par des agents biologiques dans les salles propres.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour le dessin de cellules sur du SiO2.
- Approfondir la compréhension du comportement cellulaire dans des environnements dessinés.
- Fournir un protocole qui minimise les risques de contamination.
Méthodes utilisées
- Création d'un masque photographique pour le motif souhaité de parylene-C.
- Oxydation et revêtement de tranches de silicium avec de la parylene-C.
- Gravure par photolithographie pour révéler le motif.
- Activation des puces à l'aide d'acide piranha et de sérum de veau fœtal.
Résultats principaux
- Les cellules ont été correctement disposées selon le motif en parylène-C.
- L'imagerie de cellules vivantes a mis en évidence le comportement cellulaire sur les surfaces structurées.
- L'immunofluorescence a confirmé les motifs d'adhésion et de croissance cellulaire.
- La méthode permet un stockage indéfini des puces structurées avant leur activation.
Conclusions
- Cette technique offre une approche robuste du façonnage cellulaire.
- Elle simplifie le processus en éliminant le besoin d'agents biologiques dans les salles blanches.
- Des applications futures pourraient inclure divers types cellulaires et motifs à des fins de recherche.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode de dessin de cellules compatible avec la microfabrication permet un contrôle spatial précis de l'adhésion cellulaire sur des substrats à base de silicium, soutenant ainsi le développement de modèles in vitro reproductibles pour la recherche en neurosciences et en étude des maladies. En s'intégrant aux procédés standard de semi-conducteurs, elle facilite la création de plateformes évolutives compatibles avec des réseaux d'électrodes multiples et des systèmes labo-sur-puce. L'approche réduit le risque de contamination dans les environnements de salle blanche et permet un stockage indéfini des puces dessinées avant leur activation, améliorant ainsi la flexibilité des flux de travail dans les contextes de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à l'organisation spatiale précise de réseaux neuronaux ou gliaux afin d'étudier les interactions spécifiques aux voies.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle des cibles en isolant les réponses cellulaires dans des microenvironnements définis, réduisant ainsi les variables de confusion lors du criblage phénotypique.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans les données d'engagement des cibles en permettant des tests de co-culture contrôlée ou d'interfaces répulsives qui imitent l'architecture tissulaire.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi pour les tests : Produit des substrats standardisés, compatibles avec la microfabrication, adaptés aux analyses d’imagerie à haut débit et aux enregistrements électrophysiologiques dans des flux de travail intégrant des MEA.
- Reproductibilité : Assure une fidélité de motif au niveau micrométrique grâce à la photolithographie, garantissant un positionnement cellulaire cohérent entre réplicats pour un criblage fiable de composés.
- Extensibilité : Permet la fabrication par lots et le stockage indéfini de puces, permettant une mise en œuvre des tests à la demande sans traitement répété en salle blanche.
Recherche translationnelle et préclinique
- Modélisation de maladies : Permet l'exploration de la physiologie cellulaire dans des systèmes neurologiquement pertinents, notamment des cellules souches de type glial humaines primaires dérivées de gliomes et des neurones hippocampiques murins.
- Continuité translationnelle : Permet de passer du criblage phénotypique en phase de découverte à la validation préclinique en utilisant des plateformes de substrat cohérentes.
- Réduction des risques mécanistiques : Clarifie le rôle des molécules d'adhésion spécifiques aux cellules dans les résultats de structuration, orientant ainsi la sélection des cibles selon leur pertinence biologique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation précoce de cibles jusqu'au développement de tests et à la modélisation préclinique, en particulier pour les cibles liées aux neurothérapeutiques et à l'oncologie, où l'organisation spatiale des cellules influe sur la fonction.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en permettant des conceptions de co-culture contrôlées ou de limites répulsives afin de clarifier la communication cellulaire et la modulation des voies.
- Écrans biologiques : Fournit des substrats prêts à l'emploi avec des sorties quantitatives par imagerie de cellules vivantes ou par immunofluorescence, facilitant la comparaison des effets de composés dans différentes conditions structurées.
- Analytique : Génère des lectures spatialement résolues (par exemple, coloration GFAP, métriques de confluence) qui permettent la comparaison statistique du comportement cellulaire dans des microenvironnements définis.
- Recherche translationnelle : S'intègre aux travaux précliniques grâce à l'utilisation de types cellulaires pertinents pour la maladie (par exemple, cellules souches-like de gliome humain) et de motifs imitant l'architecture tissulaire.
- Réutilisation en entreprise : Représente une capacité de microfabrication réutilisable plutôt qu'un protocole à usage unique, compatible avec les procédés standards de traitement des plaquettes et l'infrastructure de salle blanche.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique des réponses cellulaires grâce à des systèmes de culture spatialement définis.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation et la reproductibilité par une précision photolithographique et une activation indépendante de l'introduction biologique en salle blanche, basée sur le sérum.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision go/no-go en permettant une détection précoce des risques associés aux cibles, fondée sur leur comportement dans des contextes spatiaux physiologiquement pertinents.
- Impact sur le portefeuille : Favorise un développement ajusté au risque en fournissant des données issues de modèles reflétant mieux l'organisation au niveau tissulaire et l'hétérogénéité cellulaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microfabrication, en photolithographie et en systèmes de dépôt sous vide pour le revêtement et la structuration du parylène-C.
- Dépend de l'accès à des installations de salle blanche, à des aligneurs de masque, à des gravureurs au plasma d'oxygène et à des réflectomètres spectroscopiques pour le contrôle des procédés.
- Exige des protocoles d'activation standardisés (acide piranha suivi d'une incubation avec du sérum) afin d'assurer une reproductibilité des résultats de structuration entre les différents lots.
- Requiert l'adaptation de la densité de semis cellulaire et des durées d'incubation en fonction des propriétés d'adhésion spécifiques à chaque type cellulaire et de la géométrie du motif.
- Universalité limitée entre les types cellulaires en raison de la dépendance aux molécules d'adhésion endogènes, nécessitant une validation empirique pour de nouveaux modèles.
