Un système microfluidique avec Patterning de surface pour les enquêtes cavitation Bubble (s) Interaction -Cell et les effets biologiques résultantes au niveau d'une seule cellule

L'objectif général de cette procédure expérimentale est d'étudier les effets biologiques induits par la cavitation en confinement microfluidique, en utilisant un façonnage de surface permettant de contrôler précisément la génération de bulles en tandem ainsi que la localisation et la forme des cellules cibles individuelles. Ce système microfluidique permet d'expérimenter l'interaction entre les bulles de cavitation transitoires et les cellules, un phénomène pertinent pour les applications thérapeutiques ainsi que pour la publication et l'utilisation de signaux sonores. Le principal avantage de cette technique réside dans l'amélioration de la précision offerte par le façonnage de surface.

Il permet d'étudier les effets biologiques au niveau de cellules individuelles et assure un fort débit grâce à une interaction fiable entre bulles. La démonstration visuelle des procédures est essentielle, car la structuration de surface et la préparation des cellules lors des étapes de fabrication de la puce impliquent des techniques variées et des astuces spécifiques. Effectuez toutes les procédures de microfabrication en salle blanche, en portant une combinaison adaptée à cet environnement.

Concevoir la surface de chaque point d'or entre 25 et 30 micromètres carrés, de sorte qu'elle soit suffisamment grande pour absorber l'énergie laser nécessaire à la génération de bulles, mais assez petite pour éviter l'adhésion de cellules individuelles. Nettoyer la lame de verre dans une hotte chimique conformément au protocole décrit, puis passer à la hotte de dépôt par rotation. Programmer le dispositif de dépôt par rotation pour accélérer jusqu'à 1000 tr/min en deux secondes et maintenir cette vitesse pendant cinq secondes, puis augmenter progressivement jusqu'à 3000 tr/min en trois secondes et maintenir cette vitesse pendant 30 secondes.

Ensuite, fixez la lame de verre au spin coater à l’aide du vide. Puis, recouvrez la lame de P20 et démarrez le cycle de rotation. Ensuite, appliquez le vernis photosensible négatif NFR en utilisant le même cycle.

À présent, faites cuire la lame sur une plaque chauffante à 95 degrés Celsius pendant 60 secondes. Une fois refroidie à température ambiante, effectuez la lithographie optique. Montez le masque en chrome sur l'aligneur de masques et assurez-vous que le côté présentant le motif soit orienté vers le bas, face à la lame.

Ensuite, configurez la recette de photolithographie en mode d'exposition forte avec neuf secondes d'exposition aux UV et alignez le substrat en verre avec le masque. Après l'exposition aux UV, faites cuire la lame à 95 degrés Celsius pendant une minute, puis laissez-la refroidir comme précédemment. Pour développer le motif sur la lame, plongez-la dans la solution révélatrice pendant 60 secondes, rincez ensuite la lame avec de l'eau distillée et séchez-la à l'aide de gaz azote.

Après avoir confirmé le motif par inspection microscopique, faire cuire la lame à 120 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis la laisser refroidir à température ambiante. Nettoyer maintenant la lame avec un plasma dans la machine de gravure ionique réactive pendant 90 secondes à 500 torr et 100 watts. À l’aide d’un évaporateur par faisceau d’électrons, fixer l’échantillon sur le porte-échantillon à l’aide d’un ruban adhésif.

Programmer la machine pour déposer une couche de titane de 5 nanomètres, suivie d'une couche d'or de 15 nanomètres. Une fois cette étape terminée, aérer la machine. Ensuite, laisser tremper la lame toute la nuit dans un bécher contenant un solvant décapant de résine photosensible afin d'éliminer l'or déposé sur la résine NFR.

Le lendemain, laver la lame avec de l'acétone, puis avec de l'alcool isopropylique (IPA), et la sécher à l'azote. Rincer la lame avec de l'eau désionisée (DI) et la sécher de nouveau à l'azote. Chauffer ensuite la lame à 115 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, nettoyer la lame présentant le motif de points d'or à l'aide d'un nettoyeur à plasma d'oxygène à 100 watts pendant 90 secondes. Régler la surface de chaque îlot codé pour la fibronectine entre 700 et 900 micromètres carrés afin de permettre une bonne dispersion des cellules HeLa dans une région carrée, tout en minimisant les risques d'agrégation de plusieurs cellules sur l'îlot. La fabrication est similaire à celle du motif d'or.

Faire tourner le code sur la lame comme précédemment en utilisant la résine photosensible positive S18 et cuire le code à 115 degrés Celsius. Ensuite, effectuer la photolithographie en alignant les marques du masque avec celles du substrat. Vérifier le motif sur la partie centrale afin de confirmer l'angle correct et ajuster la distance de dégagement entre les points d'or et le motif en H.

Faites l'exposition UV pendant neuf secondes sans cuisson postérieure. La différence suivante est que l'étape de développement ne dure que 45 secondes. Pour la gravure par ion réactif, réglez les paramètres sur 500 torr, 100 watts et 90 secondes.

Ensuite, appliquez une goutte de solution passivante de PLLG-peg sur un morceau de film en paraffine et placez la face structurée de la lame contre la solution. Évitez de piéger des bulles d'air. Après 45 minutes, retirez la lame du film.

Rincez la lame avec de l'eau désionisée, puis séchez-la à l'azote. Ensuite, immergez la lame successivement dans le dissolvant de photo-résine 1165, puis dans une solution à 50 pour cent de 1165 dans de l'eau désionisée.

Ensuite, utilisez uniquement de l’eau distillée. Pendant chaque bain, agitez la solution dans un bain ultrasons pendant 90 secondes. Maintenant, faites sécher la lame sur une plaque chauffante, puis scellez-la dans un dessiccateur et stockez-la à 4 degrés celsius.

Assembler les lames dans une puce à microcanaux comme décrit dans le protocole écrit. Veiller attentivement à protéger la zone structurée du substrat en verre avec la petite lame de PDMS avant d'utiliser la gravure par plasma réactive pour éliminer le PLLG peg de la zone périphérique. Récupérer le verre structuré de la machine de gravure par plasma réactive et retirer la petite lame de PDMS.

Après avoir traité le microcanaux en PDMS avec une dose réduite de plasma d'oxygène, alignez-le par rapport au substrat en verre structuré sous un stéréoscope. Mettez le microcanaux en PDMS et le substrat en verre structuré en contact conforme. Utilisez maintenant la puce.

Commencez par amorcer la puce en faisant circuler du PBS dans le microcanal pendant 30 minutes à un débit de un microlitre par minute. Ensuite, perfusez la puce avec une solution de fibronectine pendant 45 minutes au même débit. Pendant l'attente, préparez les cellules à une concentration de cinq millions de cellules par millilitre.

Un état sain et une forte confluence sont essentiels pour cette procédure. Par la suite, remplacez la solution circulant dans la puce par du PBS et augmentez le débit à dix microlitres par minute. Laissez le PBS circuler pendant cinq minutes.

Ensuite, injectez les cellules préparées dans la puce à l’aide d’une seringue. Lorsqu’une goutte s’est écoulée du tube, arrêtez l’injection et pincez la sortie. Puis, placez la puce dans une étuve pendant 30 minutes.

Ensuite, relâchez la sortie et rincez la puce avec du milieu de culture cellulaire à raison de dix microlitres par minute pendant cinq minutes. Après cinq minutes, réduisez le débit à 0,75 microlitre par minute et transférez la puce et la pompe dans un incubateur pendant deux heures. Après deux heures, procédez à la génération en tandem de bulles en observant la puce sous un microscope inversé équipé de deux lasers NDI pulsés sous commande temporelle dirigés vers le motif de points dorés, et avec une caméra haute vitesse prête à enregistrer les résultats.

Pour des bulles de 50 microns, réglez le délai entre les deux lasers à 2,5 microsecondes et fixez leur puissance à dix microjoules. Ensuite, synchronisez l'enregistrement de la caméra haute vitesse avec les lasers et effectuez des enregistrements à deux millions d'images par seconde avec des temps de pose de 200 nanosecondes. Ainsi, les dynamiques de l'expansion des bulles, de l'effondrement, des interactions entre bulles et de la formation de jets sont enregistrées.

Les interactions entre bulles et divers effets biologiques induits par la cavitation ont été étudiées au niveau de la cellule unique à l’aide de la technique décrite, notamment les interactions transitoires de bulles en tandem accompagnées de la formation de jets, la visualisation du champ d’écoulement résultant et le calcul de la vitesse du jet. L’écoulement dirigé de type jet autour de la bulle en tandem atteint environ dix mètres par seconde, mesure environ dix micromètres de large et est donc capable d’exercer sur les cellules cibles voisines une contrainte de cisaillement impulsionnelle et localisée ainsi qu’un gradient de contrainte. La déformation de la membrane cellulaire induite par les bulles en tandem a également été étudiée.

La déformation et la récupération de la membrane sont mises en évidence par le déplacement de billes fonctionnalisées fixées au bord avant de la membrane cellulaire. À partir des coordonnées d'un triplet de billes adjacentes, la déformation locale de la surface a été calculée. Ce schéma montre la variation maximale de la surface à différents emplacements à la surface de la cellule.

Le bord avant est principalement étiré, tandis que le bord arrière ou les côtés latéraux de la cellule sont comprimés, indiquant une hétérogénéité et une déformation cellulaire provoquée par l'écoulement de jet induit par la bulle en tandem. La variation temporelle de la déformation surfacique au bord avant de la cellule comprend quelques oscillations rapides suivies d'un étirement important et prolongé d'environ 100 microsecondes, puis d'une récupération progressive sur une échelle de temps de plusieurs millisecondes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une interaction contrôlable entre bulles afin d'étudier les effets biologiques sur des cellules uniques avec une forme et une localisation contrôlées, grâce à un motif de surface.

Après cette procédure, d'autres mesures telles que l'amincissement du cytosquelette et l'imagerie conjugale peuvent être réalisées afin d'étudier la réorganisation du cytosquelette cellulaire induite par le traitement par bulles en tandem. Une fois développée, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs du domaine de l'ultrason subcritique pour explorer les effets biologiques induits par la captation au niveau individuel de la cellule. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir une bonne confluence et un bon état des cellules pour assurer le succès du traçage cellulaire.

N'oubliez pas que le travail avec des produits chimiques de salle propre et des lasers peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de gants et de lunettes de protection laser doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.