Un système microfluidique avec Patterning de surface pour les enquêtes cavitation Bubble (s) Interaction -Cell et les effets biologiques résultantes au niveau d'une seule cellule

L’objectif global de cette procédure expérimentale est d’étudier les effets biologiques induits par la cavitation en confinement microfluidique en utilisant la modélisation de surface pour contrôler avec précision la génération de bulles en tandem et l’emplacement et la forme des cellules cibles individuelles. Ce système microfluidique permet l’expérimentation de ce transit de bulles de cavitation et de cellules qui est pertinent pour la publication thérapeutique et sonore et le fonctionnement sonore. Le principal avantage de cette technique vient de l’amélioration de la précision du modelage de surface.

Il nous permet d’étudier les effets biologiques de cellules individuelles et constitue une charge de flux élevée à partir d’une interaction fiable bulle-bulle. La démonstration visuelle des procédures est essentielle car la structuration de la surface et la préparation des cellules dans les étapes de la puce sont complexes et font appel à diverses techniques et astuces. Effectuer toutes les procédures de microfabrication dans une salle blanche tout en portant une combinaison de salle blanche.

Concevez la zone de chaque point d’or entre 25 et 30 microns carrés, de sorte qu’elle soit suffisamment grande pour absorber l’énergie laser pour la génération de bulles, mais suffisamment petite pour éviter que des cellules individuelles n’y adhèrent. Nettoyez la lame de verre dans un capot chimique conformément au protocole de texte, puis passez au capot de revêtement par rotation. Programmez le codeur de spin pour qu’il accélère à 1000 tr/min en deux secondes et pour maintenir cette vitesse pendant cinq secondes, puis faites-le monter à 3000 tr/min en trois secondes et maintenez cette vitesse pendant 30 secondes.

Ensuite, fixez la lame de verre au codeur de centrifugation à l’aide de l’aspirateur. Ensuite, couvrez la diapositive avec du P20 et démarrez le cycle d’essorage. Ensuite, appliquez la résine photo négative NFR en utilisant le même cycle.

Maintenant, faites cuire la lame sur une plaque chauffante à 95 degrés Celsius pendant 60 secondes. Une fois refroidi à température ambiante, effectuez la photolithographie. Montez le masque chromé sur l’aligneur de masque et assurez-vous que le côté du motif est orienté vers le bas vers la diapositive.

Ensuite, réglez la recette de photolithographie sur le mode d’exposition difficile avec neuf secondes d’exposition aux UV et alignez le substrat de verre avec le masque. Après l’exposition aux UV, faites cuire la lame à 95 degrés Celsius pendant une minute, puis laissez-la refroidir comme précédemment. Pour développer le motif sur la lame, placez-la dans une solution de révélateur pendant 60 secondes, puis lavez la lame avec de l’eau distillée et séchez-la avec de l’azote gazeux.

Après avoir confirmé le motif par une inspection microscopique, faites cuire la lame à 120 degrés Celsius pendant cinq minutes et laissez-la refroidir à température ambiante. Maintenant, nettoyez la lame avec du plasma dans la machine de gravure ionique réactive pendant 90 secondes à 500 tor et 100 watts. À l’aide d’un évaporateur à faisceau d’extrémisme, fixez l’échantillon sur le support de plaque.

Programmez la machine pour qu’elle dépose une couche de titane de 5 nanomètres, suivie d’une couche d’or de 15 nanomètres. Une fois cette position terminée, aérez la machine. Ensuite, faites tremper la lame pendant la nuit dans un bécher de solvant dissolvant pour photorésine afin d’éliminer l’or qui repose sur le vernis NFR.

Le lendemain, lavez la lame avec de l’acétone, puis de l’IPA, puis séchez-la avec de l’azote. Rincez la lame à l’eau DI et séchez-la à nouveau avec de l’azote. Maintenant, chauffez la diapositive à 115 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, nettoyez la diapositive à l’aide d’un asher à plasma d’oxygène à 100 watts pendant 90 secondes. Réglez l’aire de chaque îlot codé en fibronectine pour qu’elle se situe entre 700 et 900 microns carrés afin de faciliter la propagation adéquate des cellules hela dans une région carrée tout en minimisant les risques d’agrégation de plusieurs cellules sur l’îlot. La fabrication ressemble beaucoup à celle du motif or.

Tournez le code de la lame comme précédemment en utilisant la résine photosensible positive S18 et faites cuire le codage à 115 degrés Celsius. Ensuite, effectuez une photolithographie, en alignant les marques sur le masque avec celles sur le substrat. Vérifiez le motif sur la partie centrale pour confirmer l’angle correct et ajustez la distance de distance entre les points dorés et le motif H.

Exécutez l’exposition aux UV pendant neuf secondes sans post-cuisson. La différence suivante est que l’étape de développement ne prend que 45 secondes. Pour la gravure ionique réactive, réglez les parimètres sur 500 pour 100 watts et 90 secondes.

Ensuite, appliquez une goutte de solution de passivation PLLG peg sur un morceau de film de paraffine et prenez en sandwich la solution sur le côté motif de la lame. Évitez de piéger les bulles. Après 45 minutes, retirez la diapositive du film.

Rincez la lame à l’eau DI, puis séchez-la avec de l’azote. Ensuite, trempez la lame consécutivement dans le dissolvant de résine photosensible 1165. Puis 50 pour cent 1165 dans de l’eau DI.

Ensuite, il suffit de DI l’eau. Pendant chaque bain, agitez la solution dans un bain à ultrasons pendant 90 secondes. Maintenant, séchez la lame sur une plaque chauffante, puis scellez-la dans un dessiccateur et conservez-la à 4 degrés Celsius.

Assemblez les diapositives dans une puce à microcanaux comme décrit dans le protocole texte. Faites attention à protéger la zone à motifs du substrat de verre avec la petite dalle PDMS avant d’utiliser la gravure ionique réactive pour retirer la cheville PLLG de la zone périphérique. Récupérez le verre à motifs de la machine RIE et retirez la petite dalle PDMS.

Après avoir traité le PDMS à microcanaux avec une dose réduite de plasma d’oxygène, alignez-le sur le substrat de verre à motifs sous un stéréoscope. Mettez le PDMS à micro-canaux et le substrat de verre à motifs en contact conforme. Maintenant, procédez à l’utilisation de la puce.

Tout d’abord, amorcez la puce en faisant couler du PBS dans le microcanal pendant 30 minutes à raison d’un microlitre par minute. Ensuite, infusez la puce avec une solution de fibronectine pendant 45 minutes au même débit. En attendant, préparez les cellules à cinq millions de cellules par millilitre.

Un état de santé et une confluence élevée sont essentiels à cette procédure. Plus tard, remplacez la solution qui circule à travers la puce par du PBS et augmentez le débit à dix microlitres par minute. Laissez le PBS couler pendant cinq minutes.

Ensuite, injectez les cellules préparées dans la puce à l’aide d’une seringue. Lorsqu’une goutte s’est écoulée de la tubulure, arrêtez l’injection et clampez la sortie. Ensuite, placez la puce dans un incubateur pendant 30 minutes.

Plus tard, libérez la sortie et rincez la puce avec un milieu de culture cellulaire à dix microlitres par minute pendant cinq minutes. Après cinq minutes, réduisez le débit à 0,75 microlitre par minute et transférez la puce et la pompe dans un incubateur pendant deux heures. Après deux heures, procédez à la génération de bulles en tandem en visualisant la puce sous un microscope inversé avec deux lasers NDI pulsés sur des commandes de synchronisation dirigées vers le motif de points dorés et avec une caméra à grande vitesse prête à capturer les résultats.

Pour des bulles de 50 microns, réglez le délai entre les deux lasers à 2,5 microsecondes et réglez leur puissance à dix microjoules. Ensuite, synchronisez l’enregistrement à grande vitesse de la caméra avec les lasers et enregistrez à deux millions d’images par seconde avec des expositions de 200 nanosecondes. Ainsi, la dynamique de l’expansion des bulles, de l’interaction bulle-bulle de l’effondrement et de la formation des jets est enregistrée.

Les interactions bulle-bulle et une variété de bioeffets induits par la cavitation ont été étudiés au niveau de la cellule unique à l’aide de la technique décrite, tels que les interactions transitoires des bulles en tandem avec la formation du jet, la visualisation du champ d’écoulement résultant et le calcul de la vitesse du jet. Le flux de jet directionnel autour de la bulle tandem est d’environ dix mètres par seconde, est d’environ dix microns de large et est donc capable de produire un stress pur impulsif et localisé et un gradient de stress sur les cellules cibles voisines. La déformation de la membrane cellulaire induite par la bulle en tandem a également été étudiée.

La déformation et la récupération de la membrane sont mises en évidence par le déplacement de billes fonctionnalisées fixées au bord d’attaque de la membrane cellulaire. À partir des coordonnées d’une triade de billes adjacentes, la déformation de la zone locale a été calculée. Ce schéma montre le changement de surface maximal à différents endroits sur la surface de la cellule.

Le bord d’attaque est principalement étiré, tandis que le bord de fuite ou les côtés latéraux de la cellule sont comprimés, ce qui indique l’hétérogénéité et la déformation de la cellule produites par l’écoulement de jet induit par la bulle en tandem. La variation temporelle de la déformation surfacique au bord d’attaque de la cellule est composée de quelques oscillations rapides suivies d’un étirement important et soutenu d’environ 100 microsecondes, puis d’une récupération progressive sur une échelle de temps de plusieurs millisecondes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire une interaction bulle-bulle contrôlable pour étudier les effets biologiques de cellules uniques avec une forme et un emplacement contrôlés à partir du motif de surface.

Suite à cette procédure, d’autres mesures telles que l’amincissement du cytosquelette et l’imagerie conjugale peuvent être effectuées pour étudier le réarrangement du cytosquelette cellulaire du traitement par bulles en tandem. Après son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine des ultrasons sous-prétiques pour explorer les effets biologiques induits par la capture au niveau de la cellule unique. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir une bonne confluence cellulaire et des conditions pour le succès lors de la structuration cellulaire.

N’oubliez pas que travailler avec des produits chimiques et des lasers pour salles blanches peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et de lunettes laser doivent toujours être prises lors de cette procédure.