Un protocole pour Phage Display et Affinity sélection en utilisant appâts protéine recombinante

L'objectif général de cette procédure est de découvrir les interactions protéiques avec des molécules appât immobilisées. Cela est réalisé en premier lieu en obtenant et en immobilisant l'appât. La deuxième étape consiste à introduire la bibliothèque de phages à analyser sur l'appât dans des conditions favorisant la liaison.

Ensuite, les phages non liés sont éliminés par des lavages rigoureux. Pendant ce temps, les phages liés sont utilisés pour infecter les bactéries avant leur récupération. La dernière étape consiste à amplifier les phages liés pour la prochaine itération de sélection d'affinité.

En fin de compte, lorsque le titre du phage atteint un plateau, des plaques individuelles sont sélectionnées et séquencées afin de déterminer quelles protéines présentent l'affinité la plus élevée pour la cible immobilisée dans les conditions expérimentales de liaison. Ce processus peut aider à répondre à des questions clés concernant les interactions entre protéines. Cette procédure commence par la mise en place d'une protéine recombinante purifiée au fond de plaques de microtitration, comme décrit dans le protocole écrit.

L'étape suivante consiste à inoculer 50 millilitres de milieu Luria burani contenant 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline dans un flacon Erlenmeyer de 250 millilitres avec une colonie unique préalablement cultivée comme décrit dans le protocole écrit, puis à incuber à 37 degrés Celsius, à 200 tr/min dans un agitateur horizontal, et à utiliser un spectrophotomètre pour surveiller la densité cellulaire jusqu'à l'obtention d'une densité optique à 600 nanomètres comprise entre 0,5 et 0,6. Ensuite, verser les cellules dans un tube Falcon de 50 millilitres ou équivalent et conserver à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation ; les cellules restent généralement viables environ une semaine. Le jour un, préparer la sélection par affinité comme décrit dans le protocole écrit le matin du jour deux.

Placer neuf flacons Erlenmeyer stérilisés de 250 millilitres vides dans les pinces d’un agitateur incubateur, puis inoculer 500 millilitres de bouillon LB avec 500 microlitres provenant d’une des cultures sur une nuit de cellules BLT5403 infectées par un bactériophage, amorcées la nuit précédente. Après avoir placé le flacon dans l’incubateur, allumer le spectrophotomètre et le régler pour mesurer l’absorbance à 600 nanomètres. Pendant ce temps, retirer la microplaque de 4 degrés Celsius et ôter le film plastique. Éliminer toute protéine non liée de la plaque en lavant 10 fois avec 200 microlitres par puits de tampon salin au tris 1 X (TBS) pH 7,5, et en tapotant la plaque à l’envers sur une serviette en papier entre chaque lavage.

Bloquez avec 200 microlitres par puits de réactif de blocage à 5 % dans du TBS pendant une heure. Enveloppez la plaque dans du film plastique, puis rincez dix fois la solution de blocage avec 200 microlitres de TBS-T 1X en tapotant la plaque à l’envers sur quatre couches de papier essuie-tout entre chaque lavage.

À partir de là, utilisez des pointes à barrière filtrante pour éviter la contamination croisée par les phages. Pipetez 100 microlitres de la banque de phages avec les protéines. Refermez la plaque avec du film plastique et incubez à température ambiante pendant une heure.

Au bout d'une heure, retirez le film plastique de la plaque et jetez-le immédiatement en agitant pour éliminer le bactériophage dans les déchets infectieux. Ensuite, utilisez une pipette multipuits pour ajouter rapidement 200 microlitres d'une solution X-T-B-S-T dans chaque puits. Réglez une minuterie sur une minute.

Après une minute, versez le tampon dans les déchets dangereux, tapez la plaque à l’envers sur une serviette en papier et replacez-la sur la paillasse. Répétez les étapes de lavage dix fois après le dixième lavage. Prélevez 200 microlitres de cellules BLT 5 4 0 3 provenant du tube Falcon de 50 millilitres à quatre degrés Celsius et transférez-les au fond de chacun des neuf puits dont le dernier lavage a été éliminé.

Enveloppez les plaques dans du film plastique et placez-les à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes afin que tout bactériophage encore fixé à l’appât infecte les bactéries. Au bout de 20 minutes, déballez les plaques. Ensuite, prélèvez 10 microlitres de bactéries depuis le puits de la réplication BSA à 25 degrés Celsius et transférez-les dans 990 microlitres de milieu marqué un.

Répétez ce processus deux fois supplémentaires pour ce puits, obtenant ainsi trois triplicats d’un dilué de 1 à 100 du bactériophage provenant de ce puits ; ceci correspond à la réplication de BSA numéro un échantillonnée trois fois. Ces dilutions seront utilisées pour estimer la concentration moyenne plus ou moins l’erreur type de la moyenne pour cette réplication de BSA. Procédez de la même manière pour les réplications deux et trois de BSA, pour les trois puits répliqués de la protéine appât empoisonnée et pour le jeu de protéines appât. Mettez de côté ces 27 tubes EOR. Si les bactéries dans le flacon présentent une densité optique comprise entre 0,6 et 1,0, versez 50 millilitres des cellules du flacon en verre dans chacun des 9 flacons Erlenmeyer de 250 millilitres.

Prendre les 170 microlitres restants de bactéries BLT 5 4 0 3 infectées par des phages dans le puits de réplication BSA un et les ajouter aux 50 millilitres de cellules marquées BSA rep.One. Effectuer cette étape pour les neuf puits avant d'agiter les flacons dans l'incubateur à 37 degrés Celsius. Pendant ce temps, réaliser des dilutions à partir des 27 dilutions initiales en prélevant 100 microlitres de LB contenant des bactéries provenant du tube Einor un et en les ajoutant aux 900 microlitres de LB contenus dans le tube einor.

Quatre pour la dilution à 10 à la puissance moins trois, jetez l'embout filtre et prenez-en un nouveau avant de prélever 100 microlitres de LB contenant des bactéries à partir du tube Eppendorf numéro quatre, puis ajoutez-les à 900 microlitres de LB dans le tube Eppendorf. Sept pour la dilution à 10 à la puissance moins quatre, poursuivez la dilution pour tous les triplicats de toutes les réplications de toutes les protéines et traitements. Il devrait y avoir 135 tubes au total une fois que les cellules se seront lysées.

Amener la culture à 0,5 molaire de chlorure de sodium en ajoutant cinq millilitres d'une solution mère de chlorure de sodium à cinq molaires et en transférant l'échantillon dans un flacon d'ultracentrifugation étiqueté. Centrifuger à 8 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Puis décantation du surnageant contenant le virus dans un tube Falcon stérile propre de 50 millilitres. Ajouter quelques gouttes de chloroforme au surnageant décanté dans le tube Falcon.

Le surnageant peut être conservé à quatre degrés Celsius pour le prochain cycle de sélection d'affinité le jour trois. Pipeter 250 microlitres de cellules VLT 5 4 0 3 à partir de quatre degrés Celsius dans chacun des tubes à essai en borosilicate numérotés préparés précédemment. Ensuite, pipeter 100 microlitres de la dilution contenue dans le tube einor un dans les 250 microlitres de cellules présents dans le tube à essai en borosilicate un. Chauffer brièvement les cinq premiers pouces de la pipette au-dessus de la flamme et l'immerger dans l'agarose fondue en surface.

Prélevez trois millilitres et versez-les rapidement dans le tube à essai contenant les cellules et les phages. Mélangez en tapotant avec un doigt tout en tenant le tube de l'autre main, puis versez le contenu sur la boîte de culture. Inclinez la boîte et utilisez le tube à essai pour chasser les bulles et les zones sèches jusqu'à ce que toute la surface soit recouverte par l'agar supérieur.

Placez-le verticalement sur la paillasse pour le laisser refroidir. Jetez le tube en verre borosilicaté. Éjectez l'embout de filtration et prenez-en un neuf, puis continuez jusqu'à ce que toutes les dilutions aient été ensemencées.

Récupérez les plaques préparées à partir de l’incubateur au fur et à mesure de leur épuisement, mais pas plus de six à la fois, car elles refroidissent et l’agarose supérieure se solidifie trop rapidement. Examinez les plaques formées sur les plaques et jetez celles présentant une lyse confluente. Déterminez quelles dilutions sérielles restantes ont produit un nombre suffisamment faible de plaques pour permettre un dénombrement précis. Notez le nombre de plaques provenant de ces plaques et procédez au calcul du titre comme décrit dans le protocole du texte à la fin de la sélection par affinité. Au quatrième tour, sélectionnez 18 colonies de plaques bien définies à l’aide d’une pointe de pipette jaune stérile.

Humidifiez l'intérieur de l'embout avec du chlorure de tris à pH 8,5 dans un tube einor. Ensuite, prélèvez en carottage ces plaques à partir des plaques de titrage en enfonçant l'embout à travers une plaque bien isolée jusqu'au fond en plastique de la boîte de Petri située en dessous, aspirez le carotte, puis expulsez le carotte dans 100 microlitres de chlorure de tris à pH 8,5 dans le tube approprié avant de vortexer. Chauffez brièvement 20 microlitres de ce volume à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis procédez à la PCR et au séquençage comme décrit dans le protocole écrit. Les résultats de titrage présentés ici sont typiques ; en échantillonnant plusieurs fois, les comptages finaux estimés sont moins sensibles aux erreurs de pipetage et fournissent une estimation plus précise du titre réel ainsi que de la variation autour de celui-ci.

Des estimations de puits à puits montrent une augmentation du titre de phages privilégiant l'appât non empoisonné à mesure que le nombre de cycles de sélection d'affinité augmente. Cela fournit également une confirmation que la technique fonctionne. Le maintien d'un pourcentage croissant de phages contenant un insert dans les puits de l'appât non empoisonné, à mesure que le nombre de sélections d'affinité augmente, est également un signe favorable après des cycles avancés de sélection d'affinité.

Une augmentation du nombre de phages récupérés indépendamment portant un insert par rapport au premier tour et la stabilisation de ces amplicons sur quelques bandes de taille identique indiquent clairement que des clones spécifiques sont sélectionnés lors de la sélection d'affinité suivant cette procédure. D'autres méthodes, comme le système deux-hybride, peuvent être réalisées afin de valider les interactions découvertes par affichage sur phage.