Un protocole pour Phage Display et Affinity sélection en utilisant appâts protéine recombinante

L’objectif général de cette procédure est de découvrir les interactions protéiques avec les molécules d’appât immobilisées. Pour ce faire, il faut d’abord acquérir et immobiliser l’appât. La deuxième étape consiste à introduire la banque de phages à cribler dans l’appât dans des conditions favorisant la liaison.

Ensuite, les phages non liés sont éliminés par un lavage rigoureux. Alors que les phages liés sont utilisés pour infecter la bactérie avant d’être récupérés. La dernière étape consiste à amplifier le phage lié pour la prochaine itération de sélection d’affinité.

En fin de compte, lorsque le titre de phage atteint un plateau, des plaques uniques sont sélectionnées et séquencées pour montrer quelles protéines ont la plus grande affinité pour le retard immobilisé dans les conditions de liaison expérimentales. Ce processus peut aider à répondre à des questions clés sur les interactions protéiques. Cette procédure commence par le placement de la protéine recombinante purifiée au fond des plaques de microtitration, comme décrit dans le protocole textuel.

L’étape suivante consiste à inoculer 50 millilitres de milieu Luria burani avec 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline dans un erlenmeyer de 250 millilitres avec une seule colonie qui a été préalablement cultivée comme décrit dans le protocole de texte, à incuber à 37 degrés Celsius, 200 tr/min dans un agitateur horizontal et à utiliser un spectrophotomètre pour surveiller la densité cellulaire jusqu’à ce qu’une densité optique à 600 nanomètres de 0,5 à 0,6 soit obtenue. Ensuite, versez les cellules dans un tube Falcon de 50 millilitres ou similaire et conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules restent généralement viables pendant environ une semaine le premier jour. Préparez-vous à la sélection par affinité telle que décrite dans le protocole textuel le matin du deuxième jour.

Placez neuf flacons erlenmeyer vides d’autoclave de 250 millilitres dans les pinces d’un agitateur d’incubation, inoculez 500 millilitres de lal burani avec 500 microlitres de l’une des cultures nocturnes de BLT 5 4 0 3 cellules infectées par des phages commencées la nuit précédente après avoir placé le flacon dans l’incubateur, allumez le spectrophotomètre et réglez-le pour lire l’absorbance à 600 nanomètres. Pendant ce temps, retirez la plaque de microtitration de quatre degrés Celsius et retirez le film plastique. Retirez toute protéine non liée de la plaque en lavant 10 fois avec 200 microlitres par puits d’une solution saline tamponnée X tris ou d’un pH TBS de 7,5 et en frappant la plaque à l’envers sur l’essuie-tout entre les lavages.

Bloc avec 200 microlitres par puits de 5 % de réactif de blocage dans le TBS pendant une heure. Avec l’assiette enveloppée dans une pellicule plastique, lavez la solution de blocage 10 fois avec 200 microlitres d’un X-T-B-S-T en frappant l’assiette à l’envers sur quatre couches de papier. Serviette entre les lavages.

À partir de là, utilisez des embouts de barrière de filtre pour éviter la contamination croisée par les phages. Pipette 100 microlitres de la bibliothèque de phages avec les protéines. Refermez la plaque avec une pellicule plastique et incubez à température ambiante pendant une heure.

Au bout d’une heure, retirez la pellicule plastique de la plaque et lavez-la immédiatement en secouant le phage dans les déchets biologiques dangereux. Ensuite, à l’aide d’un multipipeteur, ajoutez rapidement 200 microlitres d’un X-T-B-S-T à chacun. Bien réglez une minuterie sur une minute.

Au bout d’une minute, secouez le tampon dans les déchets biologiques dangereux, frappez l’assiette à l’envers sur une serviette en papier et remettez-la sur le banc. Répétez les étapes de lavage 10 fois après le 10e lavage. Prenez 200 microlitres de BLT 5 4 0 3 cellules du tube de faucon de 50 millilitres à quatre degrés Celsius et transférez-les au fond de chacun des neuf puits d’où le dernier lavage a été retiré.

Enveloppez les plaques dans une pellicule plastique et mettez-la à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes pour que tout phage encore collé à l’appât infecte la bactérie au bout de 20 minutes. Déballez les assiettes. Ensuite, retirez 10 microlitres de bactéries de la BSA à 25 degrés Celsius de réplication d’un puits et transférez-les dans les 990 microlitres de moyenne marquée.

Répétez ce processus deux fois de plus pour ce puits, ce qui donne trois triplets d’un à 100 dilu du phage de ce puits, c’est la réplication de BSA, un échantillonné trois fois. Ces dilutions seront utilisées pour estimer le titre moyen, plus ou moins l’erreur type de la moyenne, pour cette réplication de BSA ; faites de même pour les réplications deux et trois de BSA pour les trois puits répliqués de la protéine d’appât empoisonnée et pour la protéine d’appât, mettez ces 27 tubes EOR de côté. Si les bactéries présentes dans le ballon ont une densité optique de 0,6 à 1,0, décantez 50 millilitres de cellules du ballon de fougère dans chacun des 9 erlenmeyers de 250 millilitres.

Prenez les 170 microlitres restants de bactéries BLT 5 4 0 3 infectées par des phages dans le puits de réplication BSA et ajoutez-les aux 50 millilitres de cellules marquées BSA rep. Un. Faites cela pour les neuf puits avant de secouer les flacons dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. Pendant ce temps, effectuez des dilutions à partir des 27 dilutions initiales en prenant 100 microlitres de LB avec des bactéries du tube Einor un et en l’ajoutant aux 900 microlitres de LB dans le tube Einor.

Quatre pour la dilution de 10 à moins trois, jetez l’embout barrière du filtre pour un nouveau avant d’obtenir 100 microlitres de LB avec des bactéries du tube quatre et de l’ajouter aux 900 microlitres de LB dans le tube eph. Sept pour la dilution de 10 à moins quatrième, continuer la dilution pour tous les triplets de toutes les réplications de toutes les protéines et de tous les traitements. Il devrait y avoir 135 tubes au total une fois que les cellules ont menti.

Amenez la culture à 0,5 molaire de chlorure de sodium en ajoutant cinq millilitres d’un stock de chlorure de sodium à cinq molaires et en transférant l’échantillon dans une centrifugeuse à bouteille de centrifugation étiquetée à 8 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, décantez le surnageant contenant le virus dans un tube de faucon propre et stérile de 50 millilitres. Ajoutez quelques gouttes de chloroforme au surnageant décanté dans le tube Falcon.

Le surnageant peut être stocké à quatre degrés Celsius pour le prochain cycle de sélection d’affinité le troisième jour, pipeter 250 microlitres de VLT 5 4 0 3 cellules de quatre degrés Celsius dans chacun des tubes à essai de bosilicate numérotés préalablement préparés. Ensuite, pipetez 100 microlitres de la dilution dans le tube un dans les 250 microlitres de cellules dans un tube à essai en silicate de bure. Un. Chauffez brièvement les cinq premiers centimètres de la pipette au-dessus de la flamme et plongez-la dans les airs en fusion.

Prenez trois millilitres et administrez-les rapidement dans le tube à essai au-dessus des cellules et du phage. Mélangez en effleurant avec un doigt tout en tenant le tube de l’autre main, puis versez le contenu sur l’assiette. Inclinez la plaque et utilisez le tube à essai pour chasser les bulles et les points secs jusqu’à ce que toute la plaque soit recouverte par les agros supérieurs.

Mettez-le de côté debout sur le banc pour qu’il refroidisse. Jetez le tube de silicate boros. Éjectez l’embout de la barrière du filtre et obtenez-en un nouveau et continuez jusqu’à ce que toute la dilution ait été plaquée.

Récupérez les plaques préparées de l’incubateur au fur et à mesure qu’elles sont épuisées, mais pas plus de six à la fois ou elles refroidissent et le haut des agros se solidifie trop rapidement, examinez la plaque formée sur les plaques et jetez celles avec une lyse confluente. Déterminez lesquelles des dilutions en série restantes ont produit suffisamment peu de plaques pour permettre un enregistrement précis du nombre de plaques de ces plaques et procédez au calcul du titre comme décrit dans le protocole de texte à la fin de la sélection d’affinité. Au quatrième tour, sélectionnez 18 colonies de plaques individuelles bien définies à l’aide d’une pointe de pipette jaune stérile.

Mouillez l’intérieur de l’embout avec du chlorhydrate de tris pH 8,5 dans un tube einor. Ensuite, extrayez ces plaques des plaques en poussant l’extrémité à travers une plaque bien isolée directement vers la boîte de Pétri en plastique ci-dessous et en aspirant le noyau, expulsez le noyau dans 100 microlitres de chlorhydrate de tris pH 8,5 dans le tube approprié avant de vortexer. Brièvement, chauffez 20 microlitres de ce volume à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes et procédez à la PCR et au séquençage comme décrit dans le protocole textuel montré ici sont des résultats de titre typiques en échantillonnant plusieurs fois les décomptes finaux estimés ne sont pas aussi sensibles aux erreurs de pipetage et une estimation plus précise du titre réel et de la variation autour de celui-ci.

On obtient une estimation de bien à bien en augmentant le titre de phage de préférence pour l’appât non empoisonné à mesure que le nombre de tours de sélection d’affinité augmente. Donne également confiance que la technique fonctionne. La rétention d’un pourcentage croissant d’insert contenant des phages dans les puits d’appâts non empoisonnés à mesure que le nombre de sélections d’affinité augmente est également de bon augure après des cycles avancés de sélection d’affinité.

Une augmentation du nombre de phages récupérés indépendamment qui ont des inserts par rapport au premier tour et la fixation de ces amplicons sur quelques bandes de taille identique est une bonne indication que des clones particuliers sont sélectionnés dans la sélection d’affinité suivant cette procédure. D’autres méthodes comme l’hybride ease two peuvent être réalisées afin de valider les interactions découvertes par phage display.