Stratégie d'analyse biopanning et bioinformatique à haut débit basée sur biocapteur pour la validation globale des interactions médicament-protéines
December 1st, 2020
Cette étude visait à présenter une stratégie pour identifier les interactions médicament-peptide. La stratégie consiste à biopanner les peptides courts reconnaissant les médicaments à partir d'un biocapteur de microbalance quartz-cristal (QCM), suivi d'une analyse bioinformatique pour évaluer quantitativement les informations obtenues pour la reconnaissance et l'annotation des sites de liaison médicamenteux sur les protéines.
L’identification des interactions entre les petites molécules et les protéines est essentielle pour la recherche et le développement de médicaments, ainsi que pour favoriser notre compréhension des mécanismes pathologiques sous-jacents aux DTC viraux. Cette méthode facilite le biopanning à haut débit des peptides de reconnaissance de médicaments et la validation globale des sites de liaison des médicaments sur les protéines pour les médicaments à petites molécules d’intérêt. Pour préparer une puce de capteur QCM, fixez une puce de capteur en céramique sur l’oscillateur d’un appareil QCM de 27 mégahertz et enregistrez la fréquence intrinsèque dans la phase aérienne avant l’immobilisation des petites molécules.
Après l’enregistrement, détachez la puce et ajoutez soigneusement une goutte de 20 microlitres d’une solution dérivée de petite molécule d’un millimolaire dans de l’éthanol à 70 % pour créer une monocouche auto-assemblée sur l’électrode d’or de la puce du capteur. Placez la puce dans une boîte de Pétri recouverte d’un tissu humide, protégez-la de la lumière pendant une heure à température ambiante avant de laver doucement la surface de l’électrode avec de l’eau ultra pure. Séchez la copeau avec une légère application d’air et chargez la copeau sur l’appareil QCM.
Après une heure, enregistrez la réduction de fréquence dans la phase aérienne pour mesurer la quantité de petite molécule qui a été immobilisée. Pour le biopannage de la bibliothèque de phages T7, placez une cuvette avec un agitateur magnétique dédié sur le biocapteur QCM réglé à 1000 tours par minute et ajoutez huit millilitres de tampon de réaction à la cuvette Pendant que le tampon est agité, fixez la puce du capteur QCM à l’oscillateur Maintenez le bras de l’oscillateur enfoncé pour immerger la puce dans le tampon et commencez à surveiller la fréquence QCM. Lorsque le gramme du capteur s’équilibre à environ trois Hertz par minute de dérive de fréquence, injectez huit microlitres d’une bibliothèque de phages T7 dans la cuvette et marquez le point d’injection sur le capteur.
Surveiller la réduction de fréquence provoquée par la liaison des phages T7 à la petite molécule immobilisée à la surface de l’électrode d’or. Au bout de 10 minutes, arrêtez le moniteur de fréquence QCM et soulevez rapidement l’oscillateur pour retirer la puce du capteur du lot, détachez la puce du capteur de l’oscillateur et retirez le tampon de la puce. Placez la puce de capteur séchée dans une boîte de Pétri humide et ajoutez une goutte de 20 microlitres de cellules hôtes E-coli en phase logarithmique sur l’électrode en or.
Incuber la parabole sur un mélangeur à microplaques de 96 puits à 37 degrés Celsius et 1000 à 1500 tours par minute pendant 30 minutes, à l’abri de la lumière pour améliorer la récupération des sept phages T7 liés. À la fin de l’incubation, transférez les 20 microlitres de suspension d’E-coli dans 200 microlitres de milieu LB. Selon la procédure générale, effectuez l’isolement de la plaque de phage dans le milieu et le séquençage de l’ADN qui code le médicament, reconnaissant les séquences peptidiques affichées sur chaque capside de phage.
Après l’entretien de la puce du capteur, utilisez un coton-tige imbibé d’une solution de dodécylsulfate de sodium à 1 % pour nettoyer la surface de l’électrode, laver la surface dorée avec de l’eau ultra pure et sécher l’électrode à l’air. Traitez ensuite la surface de l’électrode avec cinq microlitres de solution Parana fraîchement préparée pendant cinq minutes, puis effectuez un lavage à l’eau ultra-pure et un séchage à l’air libre deux fois. Pour effectuer une analyse bio-informatique à l’aide de RELIC, décompressez le programme RELIC autonome sur un PC avec un système d’exploitation Windows et utilisez les séquences d’acides aminés de 15 peptides mères sélectionnés ou d’une ou plusieurs protéines dans chaque fichier texte au format A rapide.
Placez les fichiers texte requis dans le dossier AA-div, info, motif, match, hetero align, fast A con ou fast A scan. Cliquez sur chaque fichier exécutable dans le dossier indépendant pour ouvrir la version personnelle de FTN 95 et entrez le nom et l’extension de fichier appropriés dans la ligne de commande pour exécuter chaque programme et obtenir le fichier de format texte résultant. Les fichiers au format texte obtenus sont présentés ici.
Exportez ensuite le fichier texte résultant vers une feuille de calcul pour générer un graphique d’informations, de contenu ou de scores de similarité cumulatifs calculés à l’aide d’un coup d’environ 62. Grâce à cette stratégie, des sites de liaison à une ou plusieurs petites molécules sur les protéines cibles ont été identifiés avec succès pour six médicaments à petites molécules. Par exemple, 29 peptides qui reconnaissent le médicament cliniquement approuvé Irinotecan immobilisé en tant que monocouche auto-assemblée ont été identifiés par biocapteur QCM basé sur un biocapteur à un cycle L’alignement ultérieur par paires des 29 peptides et de l’acétylcholinestérase a donné des scores maximaux pour des résidus d’acides aminés spécifiques qui étaient cohérents avec ceux constituant le site de liaison de l’irinotécan.
Ce même sous-ensemble de peptides a également été identifié avec succès au voisinage de la triade catalytique dans la carboxylestérase, indiquant que ces acides aminés forment un échafaudage pour la reconnaissance de l’irinotécan lors de la désestérification. Les 27 peptides qui reconnaissent le médicament antigrippal Oseltamivir recouvrant la surface de l’électrode d’or de la puce du capteur QCM ont détecté avec succès le site de liaison de l’oseltamivir dans la neuraminidase. Ce site de liaison est constitué de boucles peptidiques non structurées qui peuvent subir un mouvement dynamique lors de l’amarrage à l’oseltamivir.
Les médicaments, les régions, les produits chimiques, les bactériophages recombinants et les bactéries sont des corbillards biologiques et doivent être manipulés conformément au protocole de gain de culture. N’oubliez pas de toujours porter des gants, des lunettes de protection et une blouse de laboratoire pour plus de sécurité. À la suite de cette procédure, les protéines cibles de divers médicaments peuvent être validées à l’échelle mondiale chez l’homme, les virus pathologiques, et même les plantes afin de comprendre les mécanismes moléculaires et l’efficacité thérapeutique potentielle des médicaments d’intérêt.
Aperçu
Cette étude présente une stratégie pour identifier les interactions entre médicaments et peptides à l'aide d'un biocapteur à microbalance à quartz (QCM). La méthode implique le biopanning de peptides reconnaissant des médicaments et une analyse bioinformatique pour évaluer la reconnaissance des médicaments et les sites de liaison sur les protéines.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Développement de médicaments
- Biotechnologie
Contexte
- Comprendre les interactions entre petites molécules et protéines est crucial pour la recherche sur les médicaments.
- Des méthodes à haut débit sont nécessaires pour le biopanning des peptides.
- Les biocapteurs QCM fournissent une plateforme pour étudier la liaison des médicaments.
- L'identification des sites de liaison aide au développement thérapeutique.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour identifier les peptides liant les médicaments.
- Valider les sites de liaison des médicaments sur les protéines cibles.
- Améliorer la compréhension des interactions médicamenteuses au niveau moléculaire.
Méthodes utilisées
- Préparation de puces de capteurs QCM pour l'immobilisation de petites molécules.
- Biopanning utilisant des bibliothèques de phages T7 pour identifier les peptides de liaison.
- Surveillance des changements de fréquence dans le QCM pour évaluer les interactions de liaison.
- Analyse bioinformatique pour l'évaluation des séquences peptidiques.
Résultats principaux
- Identification réussie de peptides reconnaissant des médicaments comme l'Irinotecan et l'Oseltamivir.
- Caractérisation des sites de liaison sur des protéines telles que l'acétylcholinestérase et la neuraminidase.
- Démonstration de l'efficacité de la méthode pour valider les interactions médicamenteuses.
Conclusions
- La stratégie identifie efficacement les sites de liaison des médicaments sur les protéines.
- Elle peut être appliquée à divers médicaments pour obtenir des insights thérapeutiques.
- Améliore la compréhension des mécanismes moléculaires dans l'action des médicaments.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This biosensor-based high throughput strategy enables rapid global validation of drug-protein interactions, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. By identifying drug-recognizing peptides and mapping binding sites on target proteins, the method enhances predictive confidence in lead selection and reduces biological uncertainty in preclinical development. The approach applies to diverse small molecules, offering a reusable capability for assessing ADMET-relevant interactions across therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying peptide sequences that recognize drug-binding sites on proteins.
- Operational Value: Supports functional target validation through high throughput biopanning of T7 phage-displayed peptides immobilized on QCM biosensors.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by highlighting amino acid residues consistent with known drug-binding sites, such as the catalytic triad in carboxylesterase for irinotecan recognition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative frequency shift data from QCM biosensor to measure small molecule immobilization and phage binding kinetics.
- Operational Value: Establishes a reproducible, label-free assay format for monitoring biomolecular interactions in real time with minimal sample consumption.
- Scalability: Enables parallel processing of phage libraries and bioinformatics analysis via RELIC suite for high throughput peptide screening and motif identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro binding data to biological relevance by validating drug recognition in pathogenic contexts, such as neuraminidase for oseltamivir.
- Disease-Relevant System: Applies to target proteins in humans, viruses, and plants, supporting cross-species validation of drug mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by confirming target engagement and binding site fidelity before investing in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing orthogonal confirmation of drug-target interactions that complements biochemical and cellular assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating drug-recognizing peptides and clarifying binding site topology on target proteins.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized peptide outputs suitable for downstream epitope mapping and antibody development.
- Analytics: Yields quantifiable binding metrics (frequency shifts) and bioinformatics-derived similarity scores to rank peptide candidates and validate binding specificity.
- Translational Research: Connects molecular binding data to functional outcomes by linking peptide sequences to enzyme inhibition or viral replication assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for repeated application across drug classes, targets, and model systems without reformatting core workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct evidence of drug-peptide interaction and binding site mapping.
- Operational Value: Enhances reproducibility via standardized QCM sensor preparation and phage recovery protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failed targets through early mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of drug candidates based on validated target engagement and interaction topology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in QCM biosensor operation, phage display techniques, and bioinformatics analysis using RELIC suite.
- Depends on access to 27 MHz QCM apparatus, magnetic stirrer cuvettes, and compatible sensor chips for small molecule immobilization.
- Necessitates standardized buffer conditions and incubation parameters to ensure consistent phage binding and recovery across runs.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different protein targets or small molecule chemistries beyond the demonstrated irinotecan and oseltamivir models.
- Includes practical limitations such as the need for careful surface regeneration between cycles to maintain sensor sensitivity and avoid cross-contamination.
