L'avidité d'un dépistage interaction extracellulaire (AVEXIS) pour la détection évolutive de faible affinité extracellulaires interactions récepteur-ligand

L’objectif global de cette procédure est de découvrir de nouvelles interactions entre protéines extracellulaires impliquées dans les processus de reconnaissance cellulaire, en particulier les protéines réceptrices intégrées dans la membrane. L’approche AveXis est conçue pour contourner les très faibles affinités d’interaction qui caractérisent cette classe d’interactions protéiques et le fait que les protéines membranaires sont difficiles à manipuler biochimiquement. Ceci est accompli en compilant d’abord une bibliothèque de protéines recombinantes des régions extracellulaires des récepteurs de surface cellulaire.

Ceci est réalisé en concevant des plasmides d’expression pour produire les régions du domaine ecto des récepteurs sous forme de fragments solubles sous forme d’appâts biotinylés monomères et d’ensemencements marqués d’éloges. La deuxième étape consiste à exprimer et à normaliser les protéines pour être prêtes pour le criblage des interactions. Toutes les protéines sont produites dans les cellules de mammifères pour s’assurer que des modifications post-traductionnelles telles que le diss, le sulfure, les liaisons et la glycosylation sont ajoutées.

Une étape cruciale du protocole consiste à s’assurer que les protéines d’appât et de proie de la banque sont toutes normalisées à des niveaux seuils. Vient ensuite la partie passionnante, le dépistage de nouvelles interactions. Les Bates sont disposés dans des puits individuels d’une plaque microtique, puis sondés pour les interactions à l’aide de l’éloge.

Ensuite, une étape de lavage est effectuée. La dernière étape consiste à ajouter le substrat pour que l’enzyme détecte tout éloge capturé sur les réseaux de protéines d’appât. En fin de compte, les résultats d’un criblage VEX peuvent montrer quels récepteurs des surfeurs cellulaires sont capables de former des partenaires de liaison et peuvent donc être impliqués dans les processus de reconnaissance et de communication entre les cellules.

Le principal avantage de cette technique d’extraction de protéines populaires, telles que les purifications hybrides ou biochimiques de levure, est qu’elle est spécifiquement conçue pour détecter les interactions protéiques extracellulaires. Il est particulièrement adapté à la découverte de nouvelles interactions entre les protéines réceptrices membranaires. Ces interactions sont difficiles à détecter à l’aide d’autres techniques, car les protéines membranaires sont biochimiquement difficiles à manipuler et leurs interactions avec les contre-récepteurs sont extrêmement faibles.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés relatives à la façon dont les cellules se reconnaissent et communiquent entre elles. Au niveau moléculaire, il peut être utilisé pour répondre à des questions relatives à des processus biologiques de base tels que les protéines réceptrices affichées à la surface des ovules et des spermatozoïdes qui se combinent, ou les interactions entre les ligands récepteurs qui sont responsables des comportements cellulaires tels que la fusion des myocytes ou la formation de la crête neurale. Le principal défi de cette approche est de compiler les bibliothèques de protéines d’appât et de prière au sein desquelles filtrer les interactions.

Il est également très important de s’assurer que les protéines de l’appât et de la proie sont normalisées à l’intérieur des seuils requis pour l’essai. Cela réduit la fréquence des faux négatifs et des faux positifs. J’ai eu l’idée de cette méthode pour la première fois pendant mon doctorat, alors que j’essayais d’identifier un partenaire de liaison pour la protéine de surface cellulaire CD 200.

Essentiellement, je posais la question suivante : quel est le modèle de liaison pour ce récepteur de surface cellulaire particulier ? Même aujourd’hui ? Cela reste une question techniquement difficile à répondre à l’époque, cependant, le génome humain était presque terminé et j’ai réalisé que parce que nous avions maintenant une liste complète de tous les récepteurs de surface cellulaire dans le génome, nous pouvions maintenant demander à la place dans cet ensemble de protéines réceptrices qui peuvent interagir techniquement.

C’est une question beaucoup plus facile à répondre, et AveXis est la méthode que nous avons développée pour y répondre. Une fois qu’une bibliothèque de vecteurs d’appât et de pré-expression a été établie, préparez-vous à les transfecter dans des cellules HEC 2 9 3 E en commençant par ensemencer les cellules la veille de la transfection à une densité de 250 000 cellules par millilitre dans 50 millilitres de milieux freestyle 2 9 3 pour assurer une exaltation efficace de la biotine. Complétez le milieu utilisé pour produire des protéines d’appât, ne procurez pas de protéines avec de la d biotine avec toutes les plaques préparées, incubez les cellules pendant la nuit dans des conditions standard.

Parce que la biotine a une faible solubilité et une solution précise, nous préférons peser la biotine supplémentaire, puis l’ajouter au milieu et agiter vigoureusement le lendemain. Transfectez 50 millilitres de cellules cultivées avec 25 microgrammes de plasmide d’appât ou de proie à l’aide d’un réactif de transfection approprié pour produire des appâts biotinylés transfect. L’appât se construit dans un rapport de 10 pour 1 avec des plasmides codant pour une forme sécrétée de la protéine ELI, la biotine ligase, par récolte.

Les cultures cinq jours après la transfection en palissant d’abord les cellules par centrifugation à 3000 fois la gravité pendant 20 minutes, puis en filtrant le surnageant S à travers un filtre de 0,22 micron. L’une des principales caractéristiques d’AveXis est que, comme les protéines recombinantes sont sécrétées, elles peuvent être diluées ou concentrées à l’intérieur des activités de seuil. Nous avons constaté que les protéines recombinantes ont une expression variable jusqu’à quatre ordres de grandeur, de sorte que l’étape de normalisation réduit l’apparition de faux positifs lors des étapes de dépistage.

Pour commencer la normalisation de l’appât, la biotine non conjuguée doit être retirée du milieu par dialyse, car elle entrera en compétition avec la protéine d’appât biotinylée pour la liaison aux sites de liaison, en commençant par fixer l’appât dans un tube de dialyse. Pour assurer une dialyse efficace des protéines recombinantes, nous avons constaté qu’il est important de fournir une surface excédentaire à la tubulure de dialyse. En règle générale, nous fournissons deux à trois fois plus de tubes que ce qui est réellement nécessaire pour le volume à dialyser.

Sur une période de 24 heures, dialysez l’appât de manière extensive contre un tampon approprié tel que le PBS après la dialyse. Un ELIZA commence par bloquer les puits d’une plaque microtique codée en streptocoque avec du PBST contenant de la BSA pendant 15 minutes. Pendant ce temps, sur une assiette propre, faites une série de quatre dilutions une à trois des protéines de l’appât dans du PBST avec 2 % BSA.

Après l’incubation de 15 minutes, transférez la dilution dans la plaque codée en streptocoque TTR et incubez la plaque pendant une heure à température ambiante au bout d’une heure, lavez les puits puis à chacun, ajoutez bien 100 microlitres de deux microgrammes par millilitre OX 68. Incuber la plaque à température ambiante pendant encore une heure. Après la deuxième incubation, faites une autre série de lavages et chargez la plaque de phosphatase alcaline anti-US.

Incuber l’assiette pendant une troisième heure à température ambiante. Maintenant, lavez la plaque trois fois dans PBST et donnez-lui un dernier lavage PBS. Pour éliminer tout détergent résiduel, ajoutez 100 microlitres d’un milligramme par millilitre de substrat 1 0 4 in di éthanol amine tampon après une heure.

À une absorbance de mesure à température ambiante de 4 0 5 nanomètres, une série de dilution de quatre supinates d’appâts dialysés différents a été détectée par Eliza à l’aide d’un anticorps monoclonal anti CD à quatre étiquettes. Si les protéines d’appât express non diluées sont insuffisantes pour saturer tous les sites de liaison à la biotine d’une plaque revêtue d’ENC avide de streptocoque, concentrez la protéine à l’aide d’un concentrateur de spin Viva. Sinon, utilisez la protéine d’appât à une concentration diluée dans du PBST avec 2 % de BSA.

C’est juste assez pour saturer le site de liaison à la biotine du test. Quantifier les niveaux relatifs auxquels les préprotéines sont exprimées à l’aide de l’activité de l’enzyme bêta-lactamase. Commencez par faire une série de dilution du supinate contenant les paraprotéines dans le tampon PBST 2 %BSA.

Ajoutez ensuite 20 microlitres de dilution à 60 microlitres d’une solution nitreuse chargée dans une plaque. Transférez immédiatement la plaque dans un lecteur de plaques et mesurez l’absorbance de 4 85 nanomètres une fois par minute pendant les 20 minutes suivantes à l’aide de concentrateurs centrifuges ou de PBST à dilution avec 2 % BSA. Réglez la concentration finale des échantillons pour hydrolyser tous les nitros du test en sept minutes environ, soit environ deux rotations de nitros par minute.

Commencez l’écran AveXis en lavant une plaque enduite de streptocoque TAVR ENC dans du PBST et en tapotant la plaque pour la sécher contre une serviette en papier. Ensuite, ajoutez du PBST avec BSA dans chaque puits et incubez la plaque pendant 30 minutes. Cela bloque les sites de liaison aux protéines parasites.

À l’intérieur de chacun, retirez la solution de blocage d’un simple mouvement de la plaque au-dessus d’un évier et ajoutez 100 microlitres d’appât monomère biotinylé normalisé dans les puits appropriés. Incuber la plaque pendant une heure à température ambiante. Ensuite, retirez les échantillons d’appâts de la plaque avec un autre coup et lavez-les trois fois avec PBST.

Puis séchez après le troisième lavage. Ajoutez maintenant 100 microlitres de la construction de proie pentamer normalisée dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante pendant une heure. Au bout d’une heure, donnez à la plaque trois autres lavages avec PBST et un dernier lavage avec PBS uniquement.

Enfin, ajoutez 60 microlitres de solution nitreuse dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante pendant deux heures, ou de préférence incubez les plaques pendant 16 heures à quatre degrés SIU. Le lendemain, les interactions positives auront viré au rouge. Prenez une photo de la plaque pour un enregistrement visuel, puis quantifiez les réactions à une absorbance de 4 à 85 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques.

Environ 10 minutes après le début de la réaction de dépistage d’AveXis, des changements de couleur jaune à rouge ont été observés à la fois dans le contrôle de capture de proie médié par les anticorps et dans l’interaction de contrôle positive. Ce changement de couleur indique l’hydrolyse de l’azote dans le substrat. Certaines interactions positives sont observables sur cette échelle de temps, mais la plupart ont mis quelques heures à apparaître.

En règle générale, un taux de réussite d’environ 0,4 à 0,6 % de positifs a été observé. Une fois les banques de protéines préparées, la partie criblage de cette technique peut être effectuée rapidement. Il est tout à fait possible de contrôler jusqu’à 12 plaques en une journée après avoir identifié une interaction.

La prochaine étape la plus importante consiste d’abord à montrer que l’interaction peut être répétée en utilisant des préparations protéiques fraîches et indépendantes. Deuxièmement, nous déterminons toujours si l’interaction est indépendante de l’orientation de la proie de l’appât, c’est-à-dire, peut-elle être réciproque ? Cela implique de cloner les domaines du vecteur appât dans le vecteur proie et vice versa.

Les interactions qui peuvent être répétées et réciproques sont considérées comme un niveau de confiance élevé et se sont toujours révélées positives. En utilisant d’autres techniques telles que la résonance du plasma de surface, nous aimons utiliser le plasma de surface en résonance pour valider en outre toutes les interactions que nous réidentifions. Il est important de noter que cela démontre que les deux composants purifiés peuvent interagir directement et peuvent également être utilisés pour montrer que la liaison est stable et donc spécifique.