Name: Détection, visualisation et la quantification de la production despèces réactives de loxygène dans un système modèle Amoeba (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 41 s
Description: Découvrez une méthode polyvalente pour détecter et quantifier les espèces réactives de l'oxygène dans les cellules d'amibe et les modèles mammaliens. Cette approche combine microscopie en direct et lectures en plaque pour analyser le stress oxydatif.

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Nous sommes reconnaissants à MM Karl-Heinz Krause et Vincent Jaquet de l&#39;aide et des conseils pour mettre en place ces protocoles, et remercions également Christoph Bauer et Jérôme Bosset de la plate-forme de bio-imagerie du PRN et le Dr Navin Gopaldass pour leur soutien technique. La recherche est financée par une subvention de DocPro du Fonds national suisse.

Une. Visualisation et de mesure qualitative de la production de ROS dans phagosomes Les perles OBG enduits doivent être préparés à l&#39;avance. Les procédures de revêtement de perles et technique de gélose sont adaptés de références publiées 5,14. <ol><li> Ajouter 1 ml de la suspension de 3,0 um billes de silice carboxylés (environ 1,8 x 10 9 billes) dans un tube de 1,5 ml, laver les billes 3 fois avec 1 ml de PBS par centrifugation rapide et tourbillonnement. </li><li> Remettre en suspension les billes dans 1 ml de PBS contenant 25 mg / ml de cyanamide (pour activer les perles de silice se lient de manière covalente à carboxylés préalablement marqué BSA), sur une roue incuber pendant 15 min. </li><li> Laver 3 fois avec 1 ml de tampon de couplage (0,1 borate de sodium M, pH 8,0) par rotation rapide (centrifugeuse à pleine vitesse dans un dessus de table mini-centrifugeuse pendant 5 secondes ou encore centrifuger à 2000 g pendant 1 min dans une centrifugeuse de table) et vortex pour enlever l&#39;excès de cyanamide. </li><li> Mélanger les billes lavées avec 500 ul de ctampon contenant 1 mg de OxyBurst vert (OBG) H2HFF (dihydro-2 &#39;, 4,5,6,7,7&#39;-hexafluorofluorescein)-BSA oupling, remplir le tube avec de l&#39;azote gazeux à partir d&#39;une norme gaz peut avant plafonnement, et incuber sur une roue pendant 14 heures (la nuit) à la température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les billes avec 2x 1 ml de tampon de trempe (250 mM de glycine dans du PBS) pour éliminer OBG n&#39;ayant pas réagi, et deux fois avec du tampon de couplage pour éliminer le tampon de trempe par rotation rapide et tourbillonnement. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon de couplage contenant 50 pg de l&#39;Alexa Fluor 594 ester de succinimidyle de conjuguer à la BSA. Remplir le tube avec de l&#39;azote avant plafonnement, et incuber sur une roue pendant 1,5 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les perles 3x avec 1 ml de tampon trempe par tour rapide et vortex pour arrêter la réaction, puis lavez les perles 3x avec 1 ml de PBS par centrifugation rapide et vortex. </li><li> Enfin, la remise en suspension des billes dans 1 ml de PBS avec 2 ul de 10% p / v d&#39;azide de stockage à long terme. Mesurer la concentration des perles dans la suspension avec un hématimètre (généralement autour de 1-2 x 10 9 billes / ml), remplir le tube avec de l&#39;azote avant plafonnement, et conserver à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> L&#39;efficacité du revêtement de la fluorescéine OBG peut être testée en contrôlant le spectre d&#39;émission en utilisant une excitation à 500 nm. Lorsqu&#39;il est oxydé par H 2 O 2 en présence de peroxydase de raifort (HRP), l&#39;intensité de fluorescence des billes oxydées, au pic d&#39;émission (538 nm), est de 11-12x plus élevée que celle des billes revêtues non oxydés. </li><li> Récolte croissance exponentielle des cellules Dictyostelium d&#39;une boîte de 10 cm de Pétri, plaque différentes densités de cellules sur 3 cm plats avec un plastique optiquement transparent ou à fond de verre, et les cultiver pendant la nuit. Choisissez les plats qui sont environ 80% de confluence de l&#39;expérience. Un protocole détaillé pour cultiver des cellules Dictyostelium a été publié le 15. </li><li> Remplacez le milieu de culture avec un milieu LoFlo (milieu de LF), incuber pendant2 heures avant l&#39;expérience, afin de diminuer l&#39;auto-fluorescence extracellulaire et intraendosomales du milieu de culture de HL5C. </li><li> En parallèle, faire fondre bacto agar 10 ml de 1,5% en milieu LF, verser l&#39;agar sur une surface plane (une plaque de verre de 10 cm x 10 cm) pour former une couche d&#39;agar environ 1 mm d&#39;épaisseur, attendre 10-15 min se solidifier. Couper la couche d&#39;agar dans 2 cm x 2 cm carrés et placer dans un milieu LF pour une utilisation ultérieure. </li><li> Pendant ce temps, préparer le disque tournant ou large microscope de champ, régler la température de la chambre de l&#39;environnement à 22 ° C et ajuster les paramètres de cette expérience. (Voir les commentaires supplémentaires dans la discussion). </li><li> Après 2 h d&#39;incubation, aspirer le milieu de la LF à partir de 3 cm plat, mais la monocouche cellulaire doit toujours être recouvert d&#39;une mince pellicule de support. Diluer les billes revêtues à 1,5 x 10 7 perles / ml et ajouter 10 ul sur la couche cellulaire. </li><li> Prenez une feuille agar carré, drainer l&#39;excès de liquide mais garder humide. Placez délicatement ee agar carré sur le dessus de la couche de cellules. Ne pas déplacer le carré agar quand il est couché sur les cellules. La gélose est utilisée pour augmenter le contact entre les billes et les cellules, ce qui améliore l&#39;absorption, et elle comprime légèrement les cellules, en les maintenant mieux dans le plan focal de l&#39;objectif. </li><li> Placer le couvercle sur le plat, placez-le sur la platine du microscope, et automatiquement prendre des photos dans les canaux rouge, vert et de phase chaque 1 min pendant 2 heures ou plus. </li><li> Sélectionner et se concentrer sur les événements cellulaires qui contiennent l&#39;ensemble du processus de phagocytose. Fusionner les 3 canaux optimisés et assembler les images dans un film en utilisant un logiciel professionnel de traitement d&#39;image. Quantifier l&#39;intensité de fluorescence de chaque perles choisies dans les canaux rouge et vert, et le rapport de vert / rouge reflète la dynamique phagosome la production de ROS des cellules. </li></ol> 2. Quantitative et moyen débit Mesure de la production de superoxyde intracellulaire <ol><li> Recueillir o80% ne plat confluent de Dictyostelium dans 10 ml de milieu de HL5C. Cellules Centrifugeuse Dictyostélium à 850 g pendant 5 min, avec soin et excès du milieu aspirer complètement. Resuspendre les cellules dans un tampon de SS6.4 [0,12 M de sorbitol dans le tampon Sorensen (14,69 mM KH 2 PO 4 et 6,27 mM Na 2 HPO 4), pH 6,4], compter les cellules et diluer à une densité finale de 6 x 10 6 cellules / ml (voir les commentaires supplémentaires dans la discussion). </li><li> Ajouter 50 pi de suspension cellulaire dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits opaque blanc (voir les commentaires supplémentaires dans la discussion). </li><li> Diluer DHE actions (30 mM dans le DMSO) 500 fois avec SS6.4, pipette 50 ul de dilution DHE dans chaque puits à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux si nécessaire. La concentration finale de la DHE est de 30 uM. La réaction commence immédiatement. </li><li> Stimuli ou inhibiteurs peuvent être ajoutés à ce moment, ou à d&#39;autres points dans le temps en fonction des besoins spécifiques. </li><li> Utilisez le point final &quot;top lecture &amp; #34, le mode d&#39;un lecteur de microplaques à fluorescence, avec une fluorescence excitation / émission à 522 nm nm/605, lire toutes les 2 min pendant 1 heure, le tremblement moyenne 5 sec / min, à 22 ° C. </li></ol> 3. Quantitatif à haut débit et la mesure de extracellulaire H 2 O 2 Production <ol><li> Suivez les mêmes étapes décrites à la section 2.1 et 2.2. </li><li> Préparer HRP dilué par addition de 5 pi de HRP actions (100 U / ml dans l&#39;eau distillée) dans 10 ml de SS6.4, vortex ou inverser le tube pour bien mélanger et garder sur la glace pour une utilisation ultérieure. La solution HRP dilué est de 0,05 U / ml. </li><li> Préparer le mélange réactionnel en mélangeant l&#39;AUR AUR magasin (AUR 10 mM dans du DMSO) et la solution HRP dilué dans du tampon de SS6.4 aux concentrations finales de 6,25 uM, et 0,005 U / ml, respectivement. Par exemple, pour préparer le mélange de réaction pendant 40 réactions, mélanger 1 600 pi de SS6.4 avec 400 pi de HRP dilué et 2,5 pi de AUR solution stock. </li><li> Ajouter 50 ul de mélange AURture dans chaque puits en utilisant une pipette à canaux multiples, si nécessaire. Maintenant, la réaction démarre. </li><li> Stimuli ou inhibiteurs peuvent être ajoutés à ce moment, ou à d&#39;autres points dans le temps en fonction des besoins spécifiques. </li><li> Utilisez le point le mode de fin &quot;haut de lecture&quot; d&#39;un micro lecteur de plaque de fluorescence, avec une fluorescence excitation / émission à 530 nm nm/590, lisez toutes les 2 min pendant 1 heure, le tremblement moyenne 5 sec / min, à 22 ° C. </li></ol>

<ol><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li>
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<li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li>
<li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T. Autophagosomes and Phagosomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDieckmann%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Deretic, V. 445, Humana Press. Totowa, NJ. 317-328 (2008).</li>
<li>Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proto.+Exch%22%5BJournal%5D)">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Par rapport aux procédés décrits précédemment, le dosage OBG visualise dynamiquement le processus de génération de ROS phagosome au niveau de la cellule unique, au lieu de mesurer un signal moyen ROS partir d&#39;une population de cellules. Ces méthodes population moyennes ont tendance à occulter des informations critiques causés par phagocytose non synchrone. Nous avons adapté avec succès DHE et AUR essais de Dictyostelium et optimisé les protocoles. Plus important encore, nous avons précisé les types et local...

Les espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) sont impliqués dans une grande variété de processus biologiques tels que la défense de l&#39;hôte, la signalisation, le développement tissulaire et réponse à la lésion, ainsi que l&#39;hypertension artérielle et du cancer. Le mécanisme de la NADPH oxydase phagosome bien étudié est dédié à la génération de ROS rapide, connu sous le burst oxydatif, pour tuer les bactéries ingérées dans les phagosomes de neutrophiles 1. En outre, les fuites d&#39;électrons comme un sous-produit de la chaîne respiratoire mitochondriale a déjà été pensé pour être responsable que d&#39;une source non réglementée de ROS. Mais récemment, il a été identifié comme un mécanisme important pour contribuer à la mise à mort intraphagosomal de bactéries dans les macrophages de souris 2. Au cours des dernières années, l&#39;amibe sociale, Dictyostelium, est devenu un modèle puissant et populaire pour étudier les mécanismes intrinsèques cellulaires de la réponse immunitaire innée. En effet, Dictyostelium et phagocytes humains partagent un niveau étonnamment élevé de conservation dans moleculales mécanismes responsables de la détection des bactéries, l&#39;engloutissement et tuer 3,4 r. Les homologues des protéines et des enzymes liées à la production ou à la détoxification des ROS, tel que NADPH oxydases, les catalases, les superoxyde dismutases, peuvent être trouvés à la fois humaine et de Dictyostelium. Comme l&#39;amibe mieux étudié, Dictyostelium présente plusieurs avantages uniques sur le système de modèle de mammifère. Ils se développent à la température ambiante sans la nécessité pour le CO 2, avec un temps de doublement de 8-10 h. Ils peuvent être facilement conservées sous forme de cultures adhérentes ou en suspension. En outre, grâce à leur génome haploïde entièrement séquencé et annoté, et à la manipulation génétique facile, Dictyostelium est devenu un modèle expérimental très attrayant organisme. Dans des études antérieures, divers dérivés chlorés et fluorés de fluorescéine (collectivement connu sous le nom OxyBurst Green, OBG) qui émettent une fluorescence après oxydation par ROS, ont été utilisés en tant que reporter ROS. Cellulaire infiltrant intérêtdérivés erified sont utilisés pour mesurer cytoplasmique ROS, alors-ou les dérivés du dextran couplés aux protéines cellulaires imperméant sont utilisés pour mesurer extracellulaire ROS. En particulier, des perles OBG BSA revêtues ont déjà été utilisés pour détecter la production de ROS phagosomale dans les cellules de mammifères 5. Cependant, l&#39;approche basée sur lecteur microplaque ne peut donner une courbe de génération de ROS moyenne d&#39;une population de cellules. Avec le présent protocole, en utilisant Dictyostelium, un phagocyte professionnel, et les conditions expérimentales optimisées, nous obtenons la phagocytose stable et efficace sans la conjugaison tout opsonine sur les billes. DHE a été utilisée dans divers systèmes modèles, tels que les neutrophiles et les macrophages de mammifères, pour détecter la production de ROS 9.6. Pendant ce temps, il ya des controverses sur la spécificité et la sensibilité de la méthode 8,10. Comme une version améliorée de Amplex Red, l&#39;intensité de fluorescence de AUR est moins sensible au pH, ce qui le rend plus approprié pour mesurerROS dans les milieux non-neutres ou faiblement acides. AUR a récemment été appliquée dans plusieurs systèmes de mammifères 11,12, mais son utilisation dans les modèles non-mammifères, qui nécessitent souvent des milieux de croissance faiblement acide, n&#39;a pas encore été signalé. En outre, il n&#39;existe pas de protocole publié à mesurer quantitativement et dynamiquement la production de ROS et la localisation dans l&#39;amibe sociale Dictyostelium. Le but du jeu présenté des protocoles est de fournir une solution simple et souple pour surveiller divers ROS et leur localisation, et en outre donner un aperçu des mécanismes cellulaires ROS-liés. Pour le dosage OBG, nous avons utilisé la microscopie en direct pour surveiller l&#39;ensemble du processus de génération de ROS phagosome après absorption de perles OBG revêtues par des cellules Dictyostelium, et proposons une nouvelle approche pour étudier le mécanisme de destruction intraphagosomal de bactéries. Nous avons optimisé moyen débit DHE et AUR essais dans Dictyostelium, pour mesurer superoxyde intracellulaireide et de H 2 O 2 extracellulaire production, respectivement, à l&#39;aide de LPS comme un stimulateur puissant de ROS. Notez que le LPS a été récemment montré pour augmenter l&#39;activité bactéricide de Dictyostelium vers bactéries phagocytées 13. En outre, le traitement par DEDTC et de la catalase a confirmé explicitement que ces deux méthodes mesurent spécifiquement différents types et localisations subcellulaires de ROS dans Dictyostelium. Enfin, le dosage OBG peut être adapté à n&#39;importe quelle cellule phagocytaire adhérente, par opsonisation en outre les perles avec des ligands pour les récepteurs phagocytaires des cellules animales. En principe, les tests DHE et AUR peuvent également être affiné pour les mesures dans une cellule adhérente ou non adhérente dans des conditions expérimentales appropriées.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>OxyBURST Vert H2HFF BSA</td><td>Invitrogen</td><td>O-13291</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>Billes de silice carboxylées</td><td>Kisker Biotech</td><td>PSi-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>HL5C medium</td><td>ForMedium</td><td>HLC0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>Bacto</td><td>agar BD</td><td>204010</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Invitrogen</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>Raifort peroxydase</td><td>Roche</td><td>10108090001</td><td></td></tr><tr><td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td><td>Sigma</td><td>D3506-100G</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C9322-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cyanamide</td><td>Sigma</td><td>187364-25G</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides</td><td>Sigma</td><td>L2630-25G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>ibidi &mu ;-Dish 35 mm, high</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>Fond en plastique optiquement transparent</td></tr><tr><td>Plat MatTek 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Fond en lamelle en verre</td></tr><tr><td>Scepter Compteur de cellules</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>Blanc Plaque 96 puits</td><td>Nunc</td><td>236108</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>SORVALL</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>BioTek</td><td>Synergy Mx</td><td></td></tr></tbody></table>

détection, visualisation et la quantification de la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène dans un système modèle amoeba

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) comprennent une gamme de molécules contenant de l&#39;oxygène réactif et de courte durée, qui sont dynamiquement interconvertis ou éliminées soit catalytique ou spontanément. En raison de la durée de vie courte de la plupart des ROS et la diversité de leurs sources et localisations subcellulaires, une image complète peut être obtenue que par des mesures précises en utilisant une combinaison de protocoles. Ici, nous présentons un ensemble de trois protocoles différents à l&#39;aide OxyBurst vert (OBG) revêtu perles, ou dihydroethidium (DHE) et Amplex Ultrared (AUR), de suivre qualitativement et quantitativement différents ROS dans les phagocytes professionnels tels que Dictyostelium. Nous avons optimisé les procédures de revêtement de perles et perles occasion OBG-enduits et microscopie en direct de visualiser dynamiquement intraphagosomal génération de ROS au niveau d&#39;une seule cellule. Nous avons identifié le lipopolysaccharide (LPS) de E. coli comme un puissant stimulateur de la production de ROS dans Dictyostelium. En outre, nous Dtemps réel eveloped, essais à moyen débit utilisant DHE et AUR à mesurer quantitativement dismutase intracellulaire et H 2 O 2 de production extracellulaire, respectivement.

La génération de ROS dans les phagosomes peut être visualisé qualitativement et de façon dynamique par microscopie (S1 du fichier). La fluorescence rouge émise par Alexa Fluor 594 est insensible au pH et reste constante dans le milieu de phagosome, tandis que l&#39;oxydation de OBG augmente sa fluorescence dans le canal vert. Les spectres d&#39;émission de oxydé in vitro et non oxydés OBG perles revêtues sont comparées sur la figure 1B, montrant une augmentation significative d...

Nous avons adapté un ensemble de protocoles pour la mesure d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) qui peuvent être appliqués dans différents modèles cellulaires amibes et de mammifères pour les études qualitatives et quantitatives.

Détection, visualisation et la quantification de la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène dans un système modèle Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de proposer une solution simple et polyvalente permettant de surveiller diverses espèces réactives de l'oxygène, ou ERO, ainsi que leur localisation, et d'obtenir des éclaircissements supplémentaires sur les mécanismes cellulaires liés aux ERO. Ceci est réalisé en effectuant trois tests différents, le premier utilisant des billes revêtues de RST vert ou d'OB G et de la microscopie en direct, l'OB G fluorescéine et l'Alexa Fluor 594 étant couplés de manière covalente à la surface de billes de silice de trois micromètres via l'albumine de sérum bovin (BSA).L'émission de fluorescence de la fluorescéine OBG indique l'oxydation par les espèces réactives de l'oxygène (ROS), tandis que le signal provenant d'Alexa Fluor 594 permet de localiser les billes et sert de contrôle pour la quantification de la fluorescence. La deuxième méthode utilise la sonde sensible au superoxyde, le dihydroéthidium ou DHE, dans un test basé sur un lecteur de plaques. En raison de l'oxydation par le superoxyde, l'éthidium devient capable de s'intercaler dans l'ADN nucléaire et mitochondrial et présente des pics d'excitation et d'émission décalés à 522 nanomètres e

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Une méthode efficace pour mieux comprendre en visualisant l'induction paracrine dérivés du ROS endothéliales de signalisation Ca2 + est décrite. Cette méthode prend avantage de mesurer paracrine dérivés ROS déclenché la mobilisation de Ca2 + dans les cellules endothéliales vasculaires dans un modèle de co-culture.

Visualisation des vasculaire Ca 2 + Signalisation Déclenchée par paracrine Dérivé ROS

NADPH oxydase est la principale source d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les phagocytes. En raison de la nature éphémère de ROS, il est difficile de mesurer et de surveiller les niveaux de ROS chez les animaux vivants. Une méthode minimalement invasive pour la quantification de série de ROS chez les souris vivant est décrite.

Imagerie par bioluminescence de l&#39;activité de la NADPH oxydase dans différents modèles animaux

Cette vidéo décrit la technique de visualisation du stress oxydatif dans les organoïdes en culture. Ce travail aide à comprendre le niveau de stress oxydatif dû à l’accumulation de ROS dans les différents types de cellules présentes dans un organoïde après un traitement avec différents modulateurs de ROS.

Dosage par sonde fluorescente : une technique pour visualiser le stress oxydatif dans les cellules organoïdes intestinales en culture traitées par des inducteurs d’espèces réactives de l’oxygène

Ce manuscrit décrit l’utilisation de reporters fluorogène génétiquement encodé dans une application de l’imagerie de cellules vivantes pour l’examen du stress oxydatif induit par les xénobiotiques. Cette approche expérimentale offre inégalée de résolution spatio-temporelle, sensibilité et spécificité tout en évitant beaucoup des défauts des méthodes conventionnelles utilisées pour la détection du stress oxydatif toxicologique.

Imagerie des approches pour les évaluations toxicologiques stress oxydatif, à l’aide de capteurs codés génétiquement fluorogène

Ici, nous présentons un protocole pour détecter l’espèce totale d’oxygène réactif cellulaire (ROS) à l’aide de 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA). Cette méthode permet de visualiser la localisation cellulaire de ROS dans les cellules adhérentes avec un microscope à fluorescence et de quantifier l’intensité de ROS avec un lecteur de plaque de fluorescence. Ce protocole est simple, efficace et rentable.

Détection des espèces réactives totales d’oxygène dans les cellules adhérentes par 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacétate Staining

Ce protocole décrit l’évaluation de l’état redox subcellulaire spécifique au compartiment dans la cellule. Une sonde fluorescente sensible au redox permet une analyse ratiométrique pratique dans les cellules intactes.

Évaluation de l’oxydation cellulaire à l’aide d’une protéine fluorescente verte rougeox-sensible spécifique à compartiment subcellulaire

Escherichia coli est la principale cause de méningite bactérienne gramnégative néonatale. Pendant l’infection bactérienne, les espèces réactives d’oxygène produites par les neutrophiles jouent un rôle bactérien majeur. Ici, nous introduisons une méthode pour détecter les espèces réactives d’oxygène dans les neutrophiles en réponse à la méningite E. coli.

Quantification en temps réel des espèces réactives d’oxygène dans les neutrophiles infectés par escherichia coli méningitique

Le présent protocole décrit une méthode de détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les organoïdes murins intestinaux à l’aide d’une imagerie qualitative et de tests de cytométrie quantitative. Ce travail peut être potentiellement étendu à d’autres sondes fluorescentes pour tester l’effet de composés sélectionnés sur les ROS.

Analyse du stress oxydatif dans les organoïdes intestinaux murins à l’aide d’une sonde fluorogénique sensible aux espèces réactives de l’oxygène

Nous proposons ici un protocole systématisé, accessible et reproductible pour détecter les espèces réactives cellulaires de l’oxygène (ROS) à l’aide d’une sonde de diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCFH-DA) dans les cellules gliales de Müller (MGC). Cette méthode quantifie les niveaux de ROS cellulaires totaux à l’aide d’un cytomètre en flux. Ce protocole est très facile à utiliser, adapté et reproductible.

Quantification des espèces réactives de l’oxygène à l’aide de la sonde de diacétate de dichlorofluorescéine 2′,7′-dichlorofluorescéine et de la cytométrie en flux dans les cellules gliales de Müller

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour quantifier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires en utilisant le dihydroéthidium (DHE) comme sonde de colorant de fluorescence en utilisant une approche de criblage à haut débit. Le protocole décrit les méthodes d’évaluation quantitative des espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires dans les trois lignées cellulaires différentes de carcinome hépatocellulaire.

Évaluation préalable à haut débit de la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) à l’aide d’un colorant de fluorescence à base de dihydroéthidium (DHE)

Découvrez une méthode polyvalente pour détecter et quantifier les espèces réactives de l'oxygène dans les cellules d'amibe et les modèles mammaliens. Cette approche combine microscopie en direct et lectures en plaque pour analyser le stress oxydatif.

Détection, visualisation et la quantification de la production d'espèces réactives de l'oxygène dans un système modèle Amoeba

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