Détection, visualisation et la quantification de la production d'espèces réactives de l'oxygène dans un système modèle Amoeba

L’objectif global de l’expérience suivante est de fournir une solution simple et polyvalente pour surveiller diverses espèces réactives de l’oxygène ou ROS et leur localisation, et de fournir des informations supplémentaires sur les mécanismes cellulaires liés aux ROS. Ceci est réalisé en effectuant trois tests différents, dont le premier utilise des billes revêtues de RST green ou OB G et la microscopie en direct, la fluorescéine ob g et Alexa. Le fluor 594 est couplé de manière covalente à la surface de billes de trois microns sica via BSA.

L’émission de fluorescence de la fluorescéine OBG indique l’oxydation par les ROS, tandis que le signal d’Alexa Fluor 594 aide à localiser les billes et sert de contrôle pour la quantification de la fluorescence. La deuxième méthode utilise la sonde sensible aux superoxydes, le dihydro éthidium ou DHE dans un test basé sur un lecteur de plaques. À la suite de l’oxydation par le superoxyde, l’éthidium est capable de s’intercaler dans l’ADN nucléaire et mitochondrial et a décalé les pics d’excitation et d’émission à 522 nanomètres et 605 nanomètres respectivement.

L’intensité de fluorescence de l’AUM correspond à la quantité de production de superoxyde, ce qui permet de mesurer quantitativement la génération intracellulaire de superoxyde dans les cellules. La troisième méthode est également un test basé sur un lecteur de plaques. La sonde plex ultra rouge sensible au peroxyde d’hydrogène ou un UR est utilisée pour mesurer quantitativement la production de peroxyde d’hydrogène extracellulaire.

L’intensité fluorescente d’un UR OX correspond à la quantité de peroxyde d’hydrogène produite à l’extérieur des cellules. Les résultats obtenus montrent la localisation de la génération dynamique de ROS sur la base des tests O-B-G-D-H-E et d’un UR. Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes existantes, telles que les OB GSA basés sur le taux de plaques, est qu’elle visualise dynamiquement la génération d’Al Roth au niveau de la cellule unique.

Au lieu de refléter et de moyenner le signal Roth à partir d’une population de cellules. De telles méthodes de calcul de la moyenne de la population ont tendance à masquer des informations critiques en raison de la phagocytose non synchrone. Pour commencer la procédure de codage des billes avec oxy, Burt Green ou OBG, ajoutez un millilitre d’une suspension de billes de silice carboxylée de 3,0 microns dans un tube de 1,5 millilitre.

Faites tourner le tube pour retirer rapidement le surnageant. Ajoutez un millilitre de PBS et vortex de cette manière. Lavez les perles trois fois avec du PBS.

Après le troisième lavage, retirez le surnageant et remettez les billes en suspension. Dans un millilitre de PBS contenant 25 milligrammes par millilitre de cyanure, la solution de cyanure doit être fraîchement préparée à chaque fois avant d’être utilisée, incubée sur une roue pendant 15 minutes. Cela activera les billes de silice carboxylée pour se lier de manière covalente à la BSA pré-étiquetée après 15 minutes, centrifuger le tube, éliminer le surnageant.

Ajoutez un millilitre de tampon de couplage et lavez trois fois avec le tampon de couplage par un essorage rapide et un vortex pour éliminer l’excès de cyanure, mélangez les billes lavées avec 500 microlitres de tampon de couplage contenant un milligramme de OBGH deux H-F-F-B-S-A, puis remplissez le tube avec de l’azote gazeux à partir d’une cartouche de gaz standard. Après avoir bouché le tube incubé sur une roue pendant 14 heures à température ambiante dans l’obscurité le lendemain, trempez l’OBG non réactif en lavant les billes deux fois avec un millilitre de tampon d’extinction par un essorage rapide et un vortex, puis lavez deux fois avec un tampon d’accouplement pour retirer le tampon d’extinction. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez un millilitre de tampon de couplage contenant 50 microgrammes de LOR 594 cin un ester moyen à conjuguer à BSA.

Remplissez le tube avec un bouchon d’azote et incubez sur une roue pendant 1,5 heure à température ambiante dans l’obscurité. À la fin de l’incubation de 1,5 heure, arrêtez la réaction en lavant les billes trois fois avec un millilitre de tampon de trempe. Ensuite, les billes sont lavées trois fois avec un millilitre de PBS.

Enfin, Ray, suspendez les billes dans un millilitre de PBS avec deux microlitres de 10 % de poids par volume. Azoture pour le stockage à long terme. Mesurez la concentration de billes dans la suspension avec un hémocytomètre, elle est généralement de un à deux fois 10 à la neuvième billes par millilitre.

Remplissez le tube avec un bouchon d’azote et stockez-le à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Commencez cette procédure en récoltant des cellules d’alium à croissance exponentielle à partir d’une boîte de Pétri de 10 centimètres. Différentes densités de cellules sur des boîtes de trois centimètres avec un fond en plastique ou en verre optiquement transparent et faites-les pousser pendant la nuit le lendemain matin.

Choisissez les plats qui sont confluents à environ 80 % pour l’utilisation dans l’expérience. Remplacer le milieu de culture par un milieu à faible débit ou LF et incuber pendant deux heures avant l’expérience afin de diminuer l’autofluorescence extracellulaire et intra-endosomale du milieu de culture HL cinq C. Faites fondre 10 millilitres de gélose BDO à 1,5 % dans un milieu LF et versez la gélose sur une surface plane afin de former une couche de gélose d’environ un millimètre d’épaisseur.

Attendez 10 à 15 minutes pour que la gélose se solidifie. Coupez la couche d’agar en deux par deux centimètres carrés et placez-la dans un milieu LF pour plus tard. Utiliser. Réparez le microscope à grand champ.

Réglez la température de la chambre environnementale à 22 degrés Celsius et ajustez les paramètres requis pour l’expérience. Après deux heures d’incubation, aspirez le milieu LF de la boîte de trois centimètres, mais laissez la monocouche cellulaire recouverte d’une fine pellicule de milieu. Diluez les billes enrobées d’OBG préalablement préparées à 1,5 fois 10 à la septième perles par millilitre et ajoutez 10 microlitres sur la couche cellulaire.

Prenez une feuille de gélose carrée et égouttez tout excès de liquide, mais gardez la gélose humide. Placez délicatement le carré d’agar sur la couche cellulaire. La superposition de gélose augmente le contact entre les billes et les cellules, améliorant ainsi l’absorption.

Il comprime également légèrement les cellules, les maintenant mieux dans le plan focal de l’objectif. Placez le couvercle sur le plat Pour le succès de l’expérience. Ne déplacez pas la superposition AGA lorsqu’elle recouvre les cellules et il est également essentiel de commencer l’étape d’imagerie immédiatement.

Ensuite, placez la parabole sur la platine du microscope et prenez automatiquement des photos dans les canaux rouge, vert et de phase toutes les minutes pendant deux heures ou plus. Pour mesurer la production de ROS, sélectionnez et concentrez-vous sur les événements cellulaires qui contiennent l’ensemble du processus de phagocytose. À l’aide d’un logiciel de traitement d’image professionnel, fusionnez les trois canaux optimisés et assemblez les images en un film.

Quantifiez les intensités de fluorescence de chacune des billes sélectionnées dans les canaux rouge et vert. Le rapport entre le rouge et le vert reflétera la production dynamique de FOMO R os des cellules. Pour mesurer d’abord la production intracellulaire de superoxyde, prélevez d’abord 180 % de confluent d’alium dans 10 millilitres de milieu HL cinq C, puis centrifugez les cellules d’alium à 850 fois G pendant cinq minutes et aspirez soigneusement et complètement le milieu, remettez en suspension les cellules dans des cellules tampons SS 6.4 et diluez à une densité finale de six fois 10 à six cellules par millilitre.

Ajoutez 50 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque blanche non transparente à 96 puits, didihydro éthidium ou DHE diluée 500 fois avec un tampon SS 6.4. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, versez 50 microlitres de DHE dilué dans chaque puits de la plaque à 96 puits. La concentration finale de DHE est de 30 micromolaires.

La réaction commencera immédiatement. Des stimuli ou des inhibiteurs peuvent être ajoutés à ce stade ou à d’autres moments en fonction des besoins spécifiques. Incuber les cellules en secouant moyennement à 22 degrés Celsius.

Lire la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques à fluorescence toutes les deux minutes pendant une heure. Utilisez le mode de lecture par le haut du point final avec une excitation de fluorescence à 522 nanomètres et une émission à 605 nanomètres. Commencez cette procédure en préparant une plaque à 96 puits avec des cellules au dium, comme démontré dans le segment précédent.

Préparez de la peroxydase de raifort diluée ou HRP en ajoutant cinq microlitres de stock HRP dans 10 millilitres de tampon SS 6.4. Retournez le tube pour bien mélanger et gardez sur de la glace. La solution diluée de HRP est à 0,05 unité par millilitre.

Préparez le plex ultra rouge ou un mélange réactionnel UR en mélangeant un stock UR et une solution de HRP diluée dans un tampon SS 6.4 jusqu’à des concentrations finales de 6,25. Micromolaire a UR et 0,005 unité par millilitre. HRP ajouter 50 microlitres d’un mélange UR dans chaque puits.

La réaction commencera immédiatement. Des stimuli ou des inhibiteurs peuvent être ajoutés à ce stade ou à d’autres moments en fonction des besoins spécifiques. Incuber les cellules en secouant moyennement à 22 degrés Celsius.

Lire la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques à fluorescence toutes les deux minutes pendant une heure. Utilisez le mode de lecture par le haut du point final avec une excitation de fluorescence à 530 nanomètres et une émission à 590 nanomètres. L’efficacité du revêtement de la fluorescéine OB g est testée en utilisant du peroxyde d’hydrogène et du HRP pour oxyder les billes revêtues in vitro et en vérifiant le spectre d’émission à l’aide d’une excitation à 500 nanomètres.

Comme le montre ce graphique, les billes oxydées présentent un pic d’émission significatif à 538 nanomètres par rapport à celui des billes non oxydées avec un rapport d’intensité d’au moins 11 à 12 fois. La génération de ROS dans les phagosomes dans les cellules de dium peut être visualisée qualitativement et dynamiquement par microscopie, comme le montre cette vidéo représentative en accéléré enregistrée pendant 40 minutes en utilisant un grossissement de six x pendant la première minute après la hausse. Par phagocytose, la fluorescence des billes recouvertes de fluorescence OBG est passée du rouge à l’orange vif, ce qui indique que les ROS ont probablement été produits directement à l’intérieur des phagosomes.

La production intracellulaire de superoxyde et de peroxyde d’hydrogène extracellulaire est mesurée quantitativement par les dosages DHE et UR, respectivement. Un résumé des réactions biochimiques liées à ces deux essais est présenté. Le superoxyde est converti en peroxyde d’hydrogène par la superoxyde dismutase ou SOD et le peroxyde d’hydrogène est converti en eau et en oxygène par la catalase dans le dosage de la DHE.

Un lecteur de microplaques est utilisé pour la mesure quantitative à moyen débit du superoxyde intracellulaire. Une expérience représentative montre que lorsqu’il est stimulé avec le lipopolysaccharide LPSA d’E coli, la production dynamique de superoxyde des cellules AX deux est significativement plus élevée que le niveau basal des cellules AX deux non stimulées et le fond de la réaction en tampon, la diminution de la fluorescence bleue et l’augmentation de la fluorescence rouge sont inversement corrélés. Comme prévu.

La localisation de la production de R os mesurée par le dosage DHE est confirmée par les résultats suivants. De plus, l’ajout d’une membrane D-E-D-T-C-A a permis d’augmenter le signal DHE d’une manière dose-dépendante, indiquant que D-E-D-T-C a provoqué l’accumulation du substrat de superoxyde dismutase. Par ailleurs, l’ajout d’un extincteur de peroxyde d’hydrogène IMP sur membrane n’a pas affecté la production de superoxyde dans le test A UR.

Un lecteur de microplaques est utilisé pour la mesure quantitative à moyen débit de la production de peroxyde d’hydrogène extracellulaire. Une expérience représentative montre que lorsqu’il est stimulé avec du LPS, la production dynamique de peroxyde d’hydrogène à partir des cellules AX deux est significativement plus élevée que le niveau basal à partir des cellules AX deux non stimulées et la réaction de fond lorsqu’elle est traitée avec diverses concentrations de D-E-D-T-C ou de catalase, le signal A UR diminue de manière dose-dépendante en raison de l’inhibition de la production de peroxyde d’hydrogène à partir du superoxyde intracellulaire et de l’épuisement du peroxyde d’hydrogène extracellulaire respectivement. Les traitements avec D-E-D-T-C et catalase ont explicitement confirmé que les dosages DHE et UR mesurent spécifiquement différents types et localisations subcellulaires de ROS Indicum à la suite de cette procédure.

D’autres méthodes, telles que la mise en miroir de la génération de Ross lors d’une infection par des bactéries pathogènes ou non pathogènes, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont l’étalon Dictal réagira à différentes infections bactériennes en termes de génération de perte. Et n’oubliez pas que travailler avec des bactéries pathogènes telles que les microbactéries marum peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que deux mesures BSL appropriées doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.