Génération de microenvironnements cellulaires multicue par photomodèlement UV de substrats de culture cellulaire tridimensionnels

Traditionnellement, la culture cellulaire est réalisée sur des substrats planaires qui imitent mal l’environnement naturel des cellules in vivo. Nous décrivons ici une méthode pour produire des substrats de culture cellulaire avec des géométries courbes physiologiquement pertinentes et des protéines extracellulaires micromotifs, permettant des recherches systématiques sur la détection cellulaire de ces signaux extracellulaires.

L’influence des facteurs microenvironnementaux sur le comportement cellulaire est souvent étudiée à l’aide de plateformes in vitro trop simplifiées, qui isolent des indices uniques. Notre approche crée des substrats de culture cellulaire qui combinent plusieurs de ces indices. Cette approche est très polyvalente et permet une étude systématique utilisant une grande variété de matériel de culture cellulaire, de modèles de guidage de contact, de lectures cellulaires et de protéines.

La procédure sera démontrée par deux candidats aux études postsecondaires de notre laboratoire. CAS VAN DER PUTTEN, et MIRKO D’URSO Tout d’abord, créez un moule en verre négatif en utilisant une technique de droit direct laser femtoseconde contenant toutes les caractéristiques d’intérêt. Ensuite, placez soigneusement le moule en verre négatif sur le fond d’une boîte de Petri et versez le prépolymère Polydiméthylsiloxane sur le moule en verre négatif pour le couvrir complètement.

Placez cette boîte de Petri dans le dessiccateur à vide et démarrez la pompe à vide. Une fois le vide réalisé, attendez 5 minutes pour éliminer toutes les bulles présentes à l’interface entre la surface du moule et le prépolymère Polydiméthylsiloxane. Durcir le prépolymère PDMS pendant la nuit au four à 65 degrés Celsius.

Après le durcissement, utilisez une spatule pour soulever les bords du PDMS. Retirez la puce PDMS positive nouvellement durcie du moule en verre négatif, et si la puce PDMS positive a tendance à coller au moule en verre négatif, ajoutez de l’éthanol ou de l’eau sur les bords de l’empreinte pendant le levage. Ensuite, placez la puce positive de polydiméthylsiloxane dans un dessiccateur à côté d’un petit flacon avec une gouttelette d’agent de silanisation et laissez la puce sous vide pendant la nuit.

Versez le prépolymère PDMS dans le moule PDMS négatif pour produire plusieurs puces de culture cellulaire de 5 millimètres d’épaisseur. Ensuite, retirez les bulles à l’aide du dessiccateur et durcissez pendant trois heures à 65 degrés Celsius. Utilisez une lame de rasoir pour couper la puce à la taille finale et stocker les puces à température ambiante Pour la passivation du substrat à l’aide d’une pince à épiler, placez la puce dans le panier du plasma Asher.

Ensuite, utilisez du plasma d’oxygène pour activer les groupes hydroxyle à la surface de la puce et évacuez la chambre de cendrage à l’aide d’azote. Sortez la puce du panier et placez-la dans un petit récipient en polydiméthylsiloxane. Maintenant, utilisez une pipette pasteure pour ajouter 500 microlitres de Poly-L-lysine sur le dessus de la puce, pour immerger complètement la surface dans la solution et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.

Ensuite, retirez 450 microlitres de la Poly-L-lysine de la puce de culture cellulaire avec une pipette. Ensuite, rincez le trice de surface de la puce avec 500 microlitres de tampon HEPES 0,1 molaire. Maintenir la qualité du motif final en laissant un petit volume de liquide sur la puce de polydiméthylsiloxane, pour éviter le séchage de l’échantillon.

Juste avant utilisation, préparez 500 microlitres de 50 milligrammes par millilitre de solution de valérate de cyanamide glycosique méthoxy polyéthylène glycosique dans 0,1 tampon de tas molaires par puce de culture cellulaire et incuber l’échantillon pendant 60 minutes. À l’aide d’une micropipette, prélever 450 microlitres de la solution de valérate cyanamidal méthoxypolyéthylène glycosique. Lavez la surface de la puce cinq fois avec du PBS en l’introduisant et en sortant.

Pour supprimer tous les mPEG-SVA non liés. Placez la lame de verre avec un surligneur fluorescent dans le trajet optique du microscope. Passez en mode fluorescent sur le microscope et faites soigneusement la mise au point de l’image primo, en vous assurant que le logo et le texte sont nets.

Cliquez sur Suivant pour voir les données d’étalonnage et le modèle pour terminer la procédure d’étalonnage. Notez l’emplacement Z de la scène lors de l’étalonnage et utilisez cet emplacement comme référence ultérieurement dans le protocole. Après avoir retiré la lame d’étalonnage de la scène, placez une lame de verre contenant une gouttelette du photo-initiateur sur la scène et placez le substrat de culture cellulaire PDMS à l’envers, dans la gouttelette photo-initiatrice.

Assurez-vous que les caractéristiques 3D à la surface du substrat de culture cellulaire font face à la lame de verre et sont complètement immergées dans l’initiateur photo, afin d’assurer un motif approprié. Concentrez-vous respectivement sur le haut ou le bas des structures convexes ou concaves et concentrez-vous sur la zone de la puce au bon endroit, comme décrit dans le manuscrit. Ajustez les paramètres de motifs en fonction de la caractéristique et sélectionnez une dose de 1000 millijoules par millilitre.

Cliquez sur le bouton de lecture en bas à droite de l’écran pour démarrer le motif. Une fois terminé, observez le motif affiché en vert. À l’aide d’une micro-pipette, ajoutez deux millilitres de PBS à un flacon de 20 microgrammes de fibronectine marquée à la rhodamine, pour obtenir une concentration de 10 microgrammes par millilitre.

Pipeter doucement pour éviter les amas de protéines et protéger de la lumière. À l’aide d’une micropipette, ajoutez 200 à 500 microlitres de la solution protéique à la puce de culture cellulaire. Ajustez le temps et la température d’incubation en fonction de la protéine de votre choix et assurez-vous de couvrir l’échantillon.

Retirez la solution protéique et lavez la puce cinq fois avec 500 microlitres de PBS stérile. Assurez-vous de pipeter le PBS de haut en bas plusieurs fois au-dessus de toutes les caractéristiques pertinentes de la puce de culture cellulaire, pour éliminer toute protéine non liée. Une fois la suspension cellulaire préparée, retirez le PBS et ajoutez 1 millilitre de la suspension cellulaire à la puce.

Ensuite, incuber pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius. Vérifiez l’adhérence des cellules sur la puce de culture cellulaire à motif sous un microscope à champ clair. Recherchez les morphologies cellulaires allongées dans le cas des motifs de lignes.

Et si les cellules ont commencé à adhérer à l’extérieur de la zone à motifs, retirez-les en pipetant le milieu de haut en bas directement au-dessus des cellules sur le substrat. Après coloration, placez l’échantillon coloré à l’envers dans une gouttelette de PBS sur une lame de verre. Ensuite, en fonction du niveau de détail requis, faites des piles Z avec un objectif approprié et un espacement Z pour assurer une bonne acquisition d’image.

Créez un rendu 3D de la pile Z avec un logiciel de rendu 3D. Une fosse concave a été modelée en utilisant l’absorption moléculaire des protéines induite par la lumière et la projection d’intensité maximale et la vue orthogonale ont été visualisées. Le profil d’intensité a montré des transitions nettes à haute résolution de motif entre les zones à motifs et non structurées et une intensité protéique constante.

Les motifs utilisant le plan focal unique ainsi que la méthode des plans focaux à deux et trois ont montré un alignement parfait des motifs au-dessus des caractéristiques. Les semi-cylindres concaves, les semi-cylindres convexes, la surface de la selle et le PID ont été modelés à l’aide de lignes ou de cercles concentriques de différentes largeurs. L’effet à l’intérieur du squelette des kératocytes humains est coloré à l’aide de foliden et visualisé.

Les fibroblastes dermiques ont été cultivés sur un demi-cylindre concave à motifs et visualisés. Les cellules ont détecté et adhéré au substrat de culture cellulaire multi-indices et sont restées viables au fil du temps, comme visualisé par la F-actine, la vinculine et les noyaux. En outre, les cellules ont formé des adhérences focales principalement sur les lignes de fibronectine.

Les fibroblastes dermiques humains cultivés sur un cylindre concave à motifs en présence de fibronectine rhodamine adhéraient au substrat multi-indices et présentaient une réponse d’alignement, selon le modèle de guidage de contact. La réponse d’alignement et la viabilité cellulaire sont maintenues pendant toute la durée de la culture. La chose la plus importante lors de l’exécution de ce protocole est d’empêcher la surface de la puce de culture cellulaire de se dessécher.

L’utilisation de différents matériaux de substrat, revêtements de protéines et types de cellules peut nécessiter une optimisation supplémentaire. Fournir plusieurs indices environnementaux en 3D peut ouvrir de nouvelles possibilités pour orienter l’organisation cellulaire dans des tissus d’ingénierie complexes.