Tri des Streptomyces culots cellulaires à l'aide d'un objet complexe paramétrique Analyzer et trieuse

L’objectif global de cette procédure est de trier les pastilles mycéliennes formées par des streptomyces filamenteux en fonction de leur taille, à l’aide d’un cytomètre en flux COPA à grosses particules. Ceci est accompli d’abord par la croissance et l’échantillonnage ultérieur de la souche bactérienne souhaitée. Dans la deuxième étape, la déformation de l’échantillon est mesurée par coppa.

Les données sont ensuite analysées in silico et les pastilles mycéliennes sont triées selon des paramètres définis par l’utilisateur. En fin de compte, ces analyses peuvent être utilisées pour caractériser davantage l’hétérogénéité de la taille des granulés. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour les streptomyces, elle peut également être appliquée à d’autres organismes tels que les champignons filamenteux, démontrant cette procédure par MaRous Petrus, un étudiant au doctorat de notre laboratoire.

Tout d’abord, cultivez les cultures en ajoutant 100 millilitres d’extrait de levure, de milieu d’extrait de malt et 0,2 millilitre de chlorure de magnésium de 2,5 molaires dans un erlenmeyer stérile de 250 millilitres, équipé de ressorts enroulés métalliques pour chaque échantillon bactérien. Ensuite, inoculez chaque fiole avec un fois 10 aux huit spores de streptomyces pour obtenir une concentration de spores de un fois 10 à six spores par millilitre et faites pousser les bactéries à 30 degrés Celsius en agitant à 180 tr/min. Après deux jours, utilisez une pipette stérile de cinq millilitres pour prélever un échantillon de cinq millilitres de chaque culture tout en secouant doucement le flacon pour répartir uniformément les cellules.

Ensuite, distribuez chaque échantillon dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres. Pour évaluer les échantillons par analyse cocus, vérifiez que l’ordinateur de pompe copus plus et le laser argon 488 nanomètres sont allumés, puis ouvrez le logiciel biosource. Vérifiez que la bouteille de liquide de gaine est pleine et que la bouteille de déchets est vide, puis cliquez sur Démarrer et exécuter.

Pour faire passer le laser à l’argonne de 488 nanomètres de la veille à la marche après environ 60 secondes, le laser sera prêt. Cliquez, c’est fait, puis vérifiez les manomètres. Cochez la case à côté de la pression.

D’accord, puis une fois que le système a amorcé la cellule de flux, vérifiez que le paramètre de retard est de 11 et que la largeur est de sept. Réglez les seuils à 50 pour le signal et à 40 pour le temps de vol minimum. Retirez ensuite l’eau restante de la tasse d’échantillon.

Ajoutez environ 50 millilitres de PBS, puis ajoutez 0,1 millilitre de l’un des échantillons de streptocoque dans la tasse. Assurez-vous que la tasse est correctement fermée, puis cliquez sur Acquérir pour commencer à collecter des données. Gérez la vitesse du flux pour obtenir entre 30 et 50 événements par seconde lorsqu’au moins 2 500 événements ont été collectés.

Cliquez, arrêtez, puis stockez pour enregistrer les données en vue d’une analyse statistique ultérieure afin de trier les granulés bactériens pour chaque échantillon. Définissez d’abord des limites de tri et entrez des détails sur le temps minimal et maximal des valeurs de vol. Vous pouvez également sélectionner des régions, puis définir une zone de porte pour créer une zone de sélection des granulés avec les dimensions et les propriétés souhaitées.

Placez un tube de 50 millilitres pour récupérer les granulés qui répondent aux paramètres de tri. Définissez ensuite le nombre de granulés à trier et cliquez sur trier manuellement pour trier en fonction des paramètres sélectionnés. Après le tri, retirez l’échantillon restant et rincez deux fois le gobelet d’échantillon à l’eau.

Avant d’éteindre le copus, nettoyez le gobelet d’échantillonnage avec de l’éthanol à 70 %. Exécutez maintenant le système deux fois. Une fois avec de l’eau chlorée et une fois avec de l’eau plate, videz le réservoir de trop-plein Après le nettoyage, cliquez sur arrêter pour relâcher la pression du système.

Lorsque le moteur s’arrête, fermez le programme et cliquez sur arrêter sans purger. Ensuite, éteignez l’ordinateur, le copa, le laser et la pompe que les streptomyces se forment. Granulés mycéliens et cultures liquides qui ont une large gamme de tailles.

Pour analyser la distribution de la taille des granulés, une culture de couleur de streptomyces cila cultivée en liquide âgée de deux jours a été soumise à une cytométrie à grand flux de particules à l’aide d’un profileur copus plus équipé d’une buse d’un millimètre. Ici, un nuage de points de sortie copus typique est présenté. L’axe des x représente le temps de vol.

Plus l’appel est grand, plus il faut de temps pour passer le faisceau laser. L’axe Y indique l’extinction, qui représente la densité optique de l’objet, chaque point dans le correspond à une seule pastille passant à travers le faisceau laser. Le tracé des points de données dans un histogramme a indiqué que les tailles de cet échantillon représentatif n’étaient pas normalement distribuées.

La distribution semblait être biaisée vers la bûche de droite. La transformation de l’ensemble de données n’a pas non plus conduit à une distribution normale pour évaluer si la distribution de taille pouvait être expliquée en supposant un mélange de deux distributions normales, les données ont été modélisées mathématiquement. La modélisation a en effet indiqué une population de petits plombs composée de 92 % de tous les plombs d’une taille moyenne de 248 micromètres, et une population de gros plombs comprenant 8 % de tous les plombs d’une taille moyenne de 319 micromètres.

Ici, une analyse représentative des micro-colonies classées parmi les grandes et petites populations de granulés est présentée. La taille moyenne des granules des deux populations a été utilisée pour définir les limites du tri afin de limiter le tri des granulés de la partie chevauchante des deux distributions de taille. Les granulés de moins de 248 micromètres ont été considérés comme provenant de la population de petits granulés, tandis que les granulés de plus de 319 micromètres ont été considérés comme provenant de la population de gros granulés. L’analyse microscopique des granulés triés a confirmé leurs tailles distinctes à la suite de cette procédure.

D’autres méthodes comme le séquençage de nouvelle génération ou la protéomique peuvent être mises en œuvre pour démêler les mécanismes sous-jacents de cette hétérogénéité.