Name: Tri des Streptomyces culots cellulaires à laide dun objet complexe paramétrique Analyzer et trieuse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Découvrez le tri des culots cellulaires de Streptomyces par cytométrie en flux COPA. Cette méthode permet d'analyser l'hétérogénéité de taille des pellets mycéliens et d'identifier deux populations distinctes pour la biotechnologie.

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La procédure pour analyser et trier Streptomyces pastilles d&#39;une culture de liquide augmenté de deux jours-vieux est représentée schématiquement à la figure 1. Détails de la méthode sont donnés ci-dessous. Une. Croissance (y compris la préparation des médias et de la zone tampon) <ol><li> Préparer 1 litre de 10x tampon phosphate salin (PBS, 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 dans 1 litre d&#39;eau distillée ajustée à pH 7,4). Au moment de l&#39;utilisation, ajouter 100 ml de 10x PBS à 900 ml d&#39;eau distillée pour obtenir 1 litre de PBS. </li><li> Préparer 1 litre de milieu YEME (3 g extrait de levure Difco, 5 g de Bacto peptone, 3 g Oxoid extrait de malt, 10 g de glucose, 340 g de saccharose, de l&#39;eau distillée jusqu&#39;à 1 L) et 100 ml de 2,5 M de MgCl2. Stériliser les deux solutions à l&#39;autoclave. Notez que d&#39;autres médias Streptomyces peuvent être utilisés 4,14. </li><li> Ajouter 100 ml de milieu YEME et 0,2 ml de 2,5 M de MgCl2 à unestérile Erlenmeyer de 250 ml équipé avec des ressorts métalliques enroulés. Préparer autant de ballons que les échantillons bactériens à étudier. </li><li> Inoculer chaque flacon avec 10 8 spores de Streptomyces pour obtenir une concentration de spores de 10 6 spores / ml. Cultiver les bactéries pendant 2 jours à 30 ° C tout en agitant à 180 rpm. </li></ol> 2. Échantillonnage <ol><li> Transférer un échantillon de 5 ml de chaque culture dans un tube Falcon de 15 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette stérile 5 ml. Secouez la culture en prenant l&#39;échantillon afin de s&#39;assurer que l&#39;échantillon est représentatif de l&#39;ensemble de la culture. </li><li> Lorsque les échantillons sont analysés immédiatement avec COPAS aucun étapes de préparation des échantillons sont nécessaires. Conserver l&#39;échantillon sur la glace et passez à l&#39;étape 3.1 de ce protocole. Lorsque les échantillons sont analysés à un point de temps plus tard, fixer les pastilles comme décrit dans les étapes 2.3 à 2.5 de ce protocole. A noter que la fixation empêche également la croissance des bactéries dans le système de tuyauterie lorsqu&#39;il n&#39;est pas correctement nettoyé après analyses. Veiller à ce que la fixation avec le formaldéhyde n&#39;est pas une entrave analyses en aval. Par exemple, l&#39;ARN n&#39;a pas pu être isolé à partir de pastilles fongiques après la fixation au formaldéhyde. Par contraste, l&#39;ARN a été isolé avec succès, après fixation à l&#39;éthanol 70% 12. </li><li> Ajouter 600 pi de 37% de formaldéhyde à 5 ml d&#39;échantillon et mélanger en inversant le tube 3x. Fixer les échantillons sur la glace pendant 30 min. </li><li> Centrifuger les échantillons à 2500 x g dans un rotor fixé à 4 ° C pendant 10 min. Retirez délicatement le surnageant et laver les pastilles avec 5 ml de PBS. </li><li> Répéter l&#39;étape 2.4 de sorte que les pastilles sont lavées avec du PBS 2x. Les échantillons peuvent être conservés dans du PBS à 4 ° C pendant plusieurs semaines. </li></ol> 3. Analyse COPAS <ol><li> Assurez-vous que la COPAS De plus, la pompe, l&#39;ordinateur et le 488 nm laser à l&#39;argon sont sous tension et lancer le logiciel Biosort. Bien allumé, le laser sera toujours en mode veille. </li><li> Vérifier si la bouteille de liquide de gaine est pleine et l&#39;bouteille de déchets est vide. </li><li> Cliquez sur «Démarrer» puis sur «RUN» pour passer le 488 nm laser à l&#39;argon en mode veille pour le. Après environ 60 secondes, lorsque le laser est activé, cliquez sur «Terminé». </li><li> Vérifiez les manomètres. Les pressions en faveur de «gaine», «échantillon», «trieur» et «Clean» doivent lire environ 4,0, 0,5, 2,7, et 10,9 respectivement. </li><li> Cochez la case à côté de «pression OK &#39;. Le système amorce alors la cellule d&#39;écoulement et est prêt à l&#39;emploi. </li><li> Réglages standard sont supposés avec «Retard» à 11 et «largeur» 7. Les seuils sont fixés à 50 pour &quot;signal&quot; et 40 pour &quot;TOF minimum», avec TOF représentant le temps de vol. (Pour être complet: tous les «gains» sont fixés à 1, le déclenchement est réglé à EXT (Extinction) et dans l&#39;onglet &quot;Configuration&quot; sous &quot;Sélectionnez la vitesse de balayage &#39;de 2,50 MHz est choisi coïncidence est réglé sur« amélioré ».). </li><li> Enlever l&#39;eau les restes de l&#39;un échantillon de tassed ajouter 0,1 ml d&#39;échantillon Streptomyces de l&#39;étape 2.2 ou 2.5 dans la tasse avec du PBS (environ 50 ml). Assurez-vous que la coupelle d&#39;échantillon est correctement fermé. </li><li> Cliquez sur «Acquire» pour commencer la collecte de données. Gérer la vitesse d&#39;écoulement d&#39;obtenir entre 30-50 événements par seconde. Si le débit est trop élevé, ajouter du PBS à la coupelle d&#39;échantillon. Si la vitesse d&#39;écoulement est trop faible, ajouter plus de l&#39;échantillon. </li><li> Lorsque au moins 2.500 événements sont collectés, cliquez sur &#39;STOP&#39;. Pour enregistrer toutes les données, cliquez sur &quot;Store&quot; et enregistrer votre fichier pour l&#39;analyse statistique ultérieure. Le logiciel Biosort enregistre les données dans quatre dossiers, dont seul le fichier txt. Sera utilisé pour l&#39;analyse ultérieure. </li><li> Nettoyer la coupelle d&#39;échantillon en retirant l&#39;échantillon avec une seringue de 50 ml et on lave 2x avec de l&#39;eau. </li><li> Répétez les étapes 03.07 à 03.10 jusqu&#39;à ce que tous les échantillons sont analysés. </li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> Ouvrez le fichier txt. Et jetez données avec un EXT inférieur à 25 (en utilisant par exemple MS Excel). Cecorrespond aux débris et fragments mycéliens vrac (pour Aspergillus Niger toutes les données avec un EXT inférieur à 150 sont rejetées) 4,12. Ensuite, enregistrez tous TOFs dans une colonne dans une plaine fichier (par de nombreux fichiers de données ce qui peut être automatisé dans le langage de programmation R, disponible à partir de: «txt». <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> Assurez-vous que SciLab (version 5.3.2 ou plus récent de http://www.scilab.org/) est installé avec la bibliothèque «fittools», qui est disponible, avec le manuel, à partir de: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li> Lancer SciLab et exécuter les fonctions nécessaires de la bibliothèque fittools pour modéliser les données. En bref: Installez la bibliothèque de fittools comme indiqué dans le manuel (nécessaire seulement une fois). <ol><li> Charger la bibliothèque de fittools. </li><li> Lire les données («txt». Fichiers) dans SciLab. </li><li>Connectez-vous transformer les données (logarithme naturel est la fonction de journal par défaut). </li><li> Ajuster le modèle de deux populations aux données. </li><li> Tracer un graphique avec l&#39;histogramme et modèle (en option). </li><li> Amorcer les données (1000 répétitions). </li><li> Ajuster le modèle pour les jeux de données bootstrap. </li><li> Obtenez le intervalles de confiance des estimations des 5 paramètres. Ceci fournira des informations sur la fraction de la participation (p) des populations, leurs moyens (2 μ 1 et μ 2) et les écarts-types d&#39;accompagnement (α 1 et α 2). En outre, les intervalles de confiance à 95% sont déterminées par remontage avec le modèle après l&#39;amorçage (1000 répétitions) 12,13,15. Lorsque les intervalles de confiance de la moyen ne se chevauchent pas et l&#39;intervalle de confiance de p est compris entre 0,025 à 0,975 le jeu de données peut être expliqué comme une combinaison des deux populations de distributions normales. (Remarque èmeà la fraction de la participation des petites boulettes est p, tandis que la participation des grandes boulettes est 1 - p.) La relation entre TOF et le diamètre d&#39;une pastille Streptomyces est égal à 0,57 × 159 um TOF + 4. </li></ol></li><li> Dans le cas de deux populations se trouvent l&#39;utilisation des moyens de TOFs comme paramètres de tri dans la COPAS que la partie supérieure et limite inférieure de trier les petites et grandes pastilles suite. A noter que d&#39;autres paramètres de tri peuvent être sélectionnés en fonction des exigences de l&#39;utilisateur. </li></ol> 5. Pellet Tri <ol><li> Chargez l&#39;échantillon Streptomyces qui doit être trié comme décrit dans l&#39;étape 3.7. </li><li> Set &#39;Tri limites »et fournir des détails sur le minimum (Lo) et maximale (Salut) valeurs TOF. Vous pouvez également définir une zone en sélectionnant «Régions», puis «Définir porte Région» pour sélectionner les pastilles avec les dimensions ou propriétés désirées. </li><li> Placer un tube de 50 ml àregrouper plusieurs pastilles qui répondent aux paramètres de tri. En variante, une plaque de microtitration peut être utilisé pour trier les pastilles individuelles. Pastilles multiples (10 4 -10 5) sont nécessaires pour l&#39;ADN et l&#39;extraction des protéines. Une seule pastille est suffisante pour l&#39;analyse par qPCR de l&#39;expression génique, mais plusieurs pastilles sont nécessaires pour réaliser le séquençage de l&#39;ARN. </li><li> Décider et fixer le nombre de pastilles qui doivent être triés et cliquez sur «Trier manuellement» pour trier les paramètres sélectionnés. Lorsque le montant fixé de pellets est atteint, le tri se termine automatiquement. </li><li> Retirer à gauche sur l&#39;échantillon avec une seringue de 50 ml de l&#39;échantillon tasse et laver la tasse avec de l&#39;eau 2x. Répéter les étapes 5.1 à 5.5 si d&#39;autres échantillons doivent être triés. </li><li> Avant d&#39;arrêter les COPAS rincer l&#39;échantillon tasse avec de l&#39;eau pour enlever les pastilles restantes et nettoyer la coupelle d&#39;échantillon avec 70% EtOH et / ou 2% d&#39;hypochlorite dans l&#39;eau. Exécuter un échantillon de l&#39;eau chlorée pour nettoyer l&#39;ensemble du système et répéter ce avec de l&#39;eau. Vide til déborde récipient et nettoyez ou remplacez le filtre qui se trouve dans ce conteneur. </li><li> Lorsque vous avez terminé, cliquez sur &#39;STOP&#39; pour libérer la pression du système. Quand le moteur s&#39;arrête fermer le programme et cliquez sur «arrêt sans purge. Ensuite, éteignez l&#39;ordinateur, la COPAS, le laser, et la pompe. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La cytométrie en flux a permis l&#39;analyse à haut débit d&#39;un grand nombre de cellules individuelles, ce qui a contribué à notre compréhension de l&#39;hétérogénéité des populations clonales 6. Cytométrie en flux régulier n&#39;est pas possible pour l&#39;analyse des pastilles de mycélium multicellulaires Streptomycetes et les champignons. Nos travaux ont montré que l&#39;analyse à haut débit de pellets Streptomyces est réalisable à l&#39;aide COPAS. La procédure décrite ici est simple, rapide, et très reproductible. Le paramètre essentiel de garder à l&#39;esprit pendant le fonctionnement de l&#39;instrument est la vitesse d&#39;écoulement, ce qui ne devrait pas dépasser 100 événements / sec (étape 3.8 de ce protocole). Si la concentration de la pastille, et donc également la vitesse d&#39;écoulement, devient trop élevée, les valeurs de TOF seront mal calculé parce que l&#39;instrument ne parvient pas à détecter pastilles individuelles. Diluer suffisamment l&#39;échantillon par l&#39;addition de PBS permet de surmonter ce problème. Limites De plus l&#39;utilisation COPAS<html> d ici a un diamètre de buse de 1 mm, ce qui est adapté à la mesure des particules ayant une taille allant de 30 à 700 um. Cette buse permet donc de mesurer les pastilles formées par les streptomycètes. Dans le cas des champignons filamenteux les micro-colonies peuvent être plus grands, ce qui limite l&#39;applicabilité générale de la COPAS Plus. La COPAS XL peut mesurer des particules jusqu&#39;à 1500 um en taille, mais sa sensibilité dans la gamme inférieure de diamètre est inférieur par rapport à celui de la COPAS Plus. Tant la COPAS Plus et la COPAS XL ne peuvent pas analyser les particules inférieures à 30 um. Cela implique que les spores ou les cellules microbiennes individuelles ne peuvent pas être analysés. En outre, la COPAS peut ne pas analyser avec précision les petits agrégats de cellules ou de spores et les très petits micro-colonies. A cet effet, les analyseurs de cellules régulières doivent être utilisés. Cette limitation est vaincue par la Biosorter de Union Biometrica, qui peut analyser des particules dans la gamme de 1-1,500 um. Le prix d&#39;achat est toutefois plus élevé. t &quot;&gt; Dépannage La COPAS est un instrument robuste qui est facile à utiliser. Cependant, parfois, pastilles ne sont pas détectés après le chargement d&#39;un échantillon dans le gobelet et de commencer la mesure. La cause est généralement un tube d&#39;entrée bouché, qui peut être facilement résolu en appuyant sur la commande «propre». Cela va forcer les pastilles de retour provenant du système de tuyau dans le récipient d&#39;échantillon. Une alternative raison pourrait être que le couvercle n&#39;est pas correctement placé sur la coupelle d&#39;échantillon. Cela conduit à la perte de pression et l&#39;insuffisance concomitante de détecter des pastilles. Importance et orientations futures Nous ici concentrés sur l&#39;analyse de la taille des granulés, mais la configuration de la COPAS est également capable d&#39;analyser et de trier en fonction de la fluorescence et de la densité. détection de fluorescence nous permet d&#39;analyser l&#39;expression des gènes en fonction des journalistes tels que la GFP. En outre, la composition de cellules peut être évalué. Encore plus puissante est la possibilité de séparer des pastilles selon ces paramètretres. Présentation pastilles peuvent être utilisées pour des analyses en aval, y compris les études d&#39;ensemble omique. En effet, nous l&#39;avons déjà trié 60 000 grandes et 200 000 petites pastilles, et démontré que le protéome est significativement différente entre les grandes et les petites pastilles 4. Cette technologie offre donc de nouvelles pistes pour améliorer Streptomycetes comme usines cellulaires. Le principal avantage de la technologie COPAS est temps. Des études précédentes sur les culots de cellules ont été réalisées en utilisant un microscope, ce qui limite le nombre de pastilles qui peuvent être analysés jusqu&#39;à plusieurs centaines 16. études de microscopie déjà suggéré l&#39;existence de deux populations de granules dans liquide grandi cultures de Streptomyces 16. En effet, les deux populations de pastilles ont été détectés, indépendamment des conditions de culture dans un grand nombre de différents streptomycètes 4. Cette hétérogénéité de taille n&#39;est pas limitée aux streptomycètes filamenteux, mais a également été observée chez les champignons filamenteux 12 &lt;/ Sup&gt;. Dans tous les cas, les mécanismes sous-jacents de l&#39;hétérogénéité ne sont pas encore connus. La possibilité de trier pastilles selon la taille et la fluorescence nous permet de démêler ces mécanismes.

Streptomycetes sont des bactéries filamenteuses du sol qui sont bien connus pour leur aptitude à rendre des antibiotiques, ainsi que des composés qui peuvent être utilisés comme immunosuppresseurs ou à lutter contre les infections fongiques ou d&#39;un cancer 1,2. En outre, ces micro-organismes produisent des enzymes qui sont d&#39;intérêt pour une large gamme d&#39;applications industrielles 3. La plupart de ces composés commercialement intéressantes sont produites dans des bioréacteurs. La croissance dans des bioréacteurs de streptomycètes est caractérisée par la formation de structures complexes des hyphes interconnectés, appelés blocs ou de pastilles. Ces structures multicellulaires sont très hétérogènes quant à la taille 4 et peuvent atteindre des tailles qui sont plus d&#39;un million de fois plus grande que la bactérie unicellulaire tels que Escherichia coli ou Bacillus subtilis. Bien que l&#39;hétérogénéité est considérée comme une caractéristique avantageuse dans des systèmes biologiques naturels 5, il est considéré comme un piège de production dans l&#39;industrie. Biocultures du réacteur doivent être reproductible et contrôlable pour obtenir les rendements les plus élevés possibles. Une compréhension détaillée du rôle de chacun des types de granulés dans un bioréacteur est donc crucial d&#39;améliorer Streptomycetes comme usine cellulaire. La cytométrie en flux est couramment utilisé pour analyser des cellules individuelles dans une population 6. cytomètres de flux peuvent acquérir des informations multiparamétrique par les caractéristiques des cellules (comme la taille, la densité et la fluorescence multicolore) mesurer simultanément. De cette façon, les propriétés des cellules peuvent être corrélées contribuant ainsi à notre compréhension de l&#39;hétérogénéité au sein d&#39;une culture et de l&#39;existence de populations distinctes de cellules 6. Plus instruments spécialisés ont permis de trier les cellules en fonction de paramètres définis par l&#39;utilisateur. Par exemple, les mutants peuvent être criblés. Après le tri, les cellules mutantes peuvent être cultivées pour une caractérisation plus poussée. Cela a déjà prouvé être utile, entre autres,pour améliorer la productivité des souches 7,8. Les buses de cytomètres de flux permettent typiquement pour le passage des cellules d&#39;un diamètre maximal d&#39;environ 10 um. Par conséquent, des pastilles de Streptomycetes ne peuvent pas être analysés avec cytometers réguliers des débits. Cependant, ils peuvent être analysés avec l&#39;objet complexe paramétrique Analyzer et trieuse (COPAS). Comme cytometers réguliers des débits, COPAS peut acquérir des données multiparamétriques de particules de manière à haut débit. Selon le type de COPAS 10-1,500 um de taille des particules peuvent être analysées. En outre, il permet de classer des particules individuelles qui peuvent être utilisés pour la culture ou les analyses en aval, telles que l&#39;isolement de l&#39;ADN, de l&#39;ARN ou des protéines. COPAS a été initialement conçu pour l&#39;analyse et le tri des petits organismes multicellulaires, comme les nématodes Caenorhabditis elegans 9 et embryons de drosophile et les larves 10. Les instruments ont également été utilisés pour 11 un poisson zèbree pour champignons filamenteux 12,13. Les derniers organismes forment également des pastilles de mycélium qui sont encore plus grands que ceux formés par des bactéries filamenteuses. Nous avons récemment démontré que l&#39;utilisation de COPAS est également possible pour les streptomycètes 4. Nous décrivons ici la procédure expérimentale pour l&#39;utilisation des COPAS pour évaluer culot hétérogénéité dans Streptomyces coelicolor, y compris des détails sur la méthodologie de trier pastilles selon la taille. S&#39;il vous plaît noter, toutefois, que ce procédé peut également être utilisé pour l&#39;analyse d&#39;autres streptomycètes formation de pastilles.

<table><tbody><tr><td>COPAS Plus</td><td>Union Biometrica</td><td>PLUS</td><td>Cytomètre en flux de grandes particules avec lasers et logiciel</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>Composant PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>Composant PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td>Composant PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td>Composant PBS</td></tr><tr><td>Extrait de levure Difco BD</td><td>Biosciences</td><td>210933</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>Oxoid Malt Extract</td><td>Fisher Scientific</td><td>OXLP0039B</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td>Média composant</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>MgCl2&bull ; Composants multimédias 6H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td>. Ajouter après l’autoclavage.</td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>Fixation des granulés Solution d’hypochlorite</td></tr><tr><td>de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71696</td><td>Pour le nettoyage de l’instrument</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>VWR</td><td>20816.367</td><td>Pour le nettoyage de l’instrument</td></tr><tr><td>Erlenmeyer Flask (250 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>214-1132</td><td>Fiole de culture pour la culture de Streptomyces</td></tr><tr><td>Springs</td><td>Verenfabriek De Spiraal</td><td>Custom-Made</td><td>Utilisé dans la fiole de culture. RVS1.4401/Longueur 210 mm/Diamètre 17 mm/Pas 5 mm</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger stérile (15 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Seringues (50 ml)</td><td>Sigma</td><td>Z683698</td><td></td></tr></tbody></table>

tri des<em&gt; streptomyces</em&gt; culots cellulaires à l&#39;aide d&#39;un objet complexe paramétrique analyzer et trieuse

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Streptomycetes sont des bactéries filamenteuses du sol qui sont utilisés dans l&#39;industrie pour la production d&#39;enzymes et les antibiotiques. Lorsqu&#39;il est cultivé dans des bioréacteurs, ces organismes forment des réseaux de hyphes interconnecté, connue sous forme de pastilles, qui sont hétérogènes en taille. Nous décrivons ici une méthode d&#39;analyse et de boulettes sorte de mycélium à l&#39;aide d&#39;un objet complexe paramétrique Analyzer et trieuse (COPAS). Les instructions détaillées sont données pour l&#39;utilisation de l&#39;instrument et l&#39;analyse statistique des données de base. Nous décrivons en outre comment pastilles peuvent être triés en fonction des paramètres définis par l&#39;utilisateur, ce qui permet le traitement en aval tels que l&#39;analyse de l&#39;ARN ou la teneur en protéines. En utilisant cette méthodologie, le mécanisme sous-jacent de croissance hétérogène peut être abordée. Cela jouera un rôle pour améliorer Streptomycetes comme usine cellulaire, compte tenu du fait que la productivité est corrélée avec la taille de culot.

Mesures COPAS de pellets Streptomyces Streptomycetes former des pastilles de mycélium dans des cultures liquides qui ont une large gamme de tailles. Pour analyser la distribution de taille de granulés, d&#39;un liquide vieux de 2 jours cultivés Streptomyces coelicolor culture a été soumise à l&#39;écoulement des particules de grande cytométrie en utilisant un profileur COPAS plus équipé d&#39;une buse de 1 mm. Une sortie COPAS typique est un nuage de points, comme visualisé dans la figure 2A. L&#39;axe des abscisses représente le temps de vol (TOF), qui est en corrélation avec la taille de pastille (c&#39;est à dire qu&#39;il faut plus de temps pour les grandes pastilles pour passer le faisceau laser). L&#39;axe des ordonnées représente l&#39;extinction, qui représente la densité optique de l&#39;objet. Chaque point du nuage de points correspond à une épreuve individuelle, c&#39;est à dire une seule pastille passer le faisceau laser. Il est important, lorsque l&#39;échantillon est trop concentré (c&#39;est à dire lorsque le laser détecte plus de 100 événements / sec), la COPAS échoue souvent à détecter p individuellets. Cela conduit à des valeurs de TOF fausses qui sont trop élevés. Dilution de l&#39;échantillon réduit les valeurs moyennes de TOF, jusqu&#39;à un certain point où en outre la dilution fait aucun impact plus TOF. Ce point est atteint lorsque environ 100 pastilles / s ont été analysés. Tracer les points de données dans un histogramme indique que les tailles ne sont pas distribuées normalement (figure 2B). La distribution semble être biaisée vers la droite. Connectez-vous transformer l&#39;ensemble de données n&#39;a pas non plus conduire à une distribution normale (figure 2C). Afin de déterminer si la distribution de la taille peut s&#39;expliquer par l&#39;hypothèse d&#39;un mélange de deux distributions normales des données a été modélisée mathématiquement 12,15. Modélisation en effet indiqué que la distribution de taille peut être expliquée en supposant l&#39;existence de deux populations distinctes de pastilles. La population de petites pastilles composée de 92% de toutes les pastilles ayant une taille moyenne de 248 um, alors que la population de grande pelpermet (8% de l&#39;ensemble des pastilles) avait une taille moyenne de 319 um (à noter que deux populations sont supposées exister lorsque la fraction de participation est comprise entre 2,5 à 97,5%). Tri des pastilles Streptomyces fonction de la taille Micro-colonies des populations de grands et de petits granules ont été triés. A cet effet, la taille des granulés moyennes des deux populations ont été utilisés pour définir les limites pour le tri. Pellets de taille inférieure à 248 um ont été considérées comme de la petite population de granulés, alors que des pastilles de plus de 319 um ont été considérées comme de la grande population de pastilles (figure 3), de manière à limiter le tri de pastilles à partir de la partie de chevauchement des deux tailles distributions. L&#39;analyse microscopique de granulés triés montré leurs tailles différentes (figure 3). Les boulettes recueillies peuvent être en outre utilisées pour l&#39;ADN, l&#39;ARN, ou des isolements de protéines. &lt;img alt = &quot;Figure 1&quot; fo: contenu width = &quot;5 po&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt; Figure 1. Représentation schématique du dispositif expérimental pour mesurer et analyser pastilles Streptomyces utilisant COPAS. Pour plus de détails, voir les procédures expérimentales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> Figure 2. Taille de Pellet hétérogénéité liquides cultivés cultures de Streptomyces. Analyse COPAS d&#39;un S. 2-day-old culture coelicolor YEME (A) indique que la taille des granulés (indiqués comme valeurs de temps de vol) ne sont normalement pas distribuerd (B), et ni le devenir quand transformées en log (C). Au lieu de cela, deux populations de pastilles qui diffèrent par TOF (et donc la taille) ont été détectés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> Figure 3. Fractionnement des pastilles Streptomyces selon la taille. Pellets avec une taille inférieure à 248 um (indiqué en rose) ont été considérés comme de petites pastilles, alors que des pastilles avec une taille supérieure à 319 um (indiqué en bleu) ont été considérées comme des grands granulés. L&#39;analyse microscopique a confirmé la différence de taille. Notez que ces formats ont été calculées à partir des données de log-transformées en utilisant la relation décrite entre TOF et le diameter d&#39;une pastille Streptomyces, ce qui équivaut à 0,57 × 159 + TOF um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a>

Cultures de Streptomyces liquides cultivés sont caractérisés par des pastilles de mycélium qui sont de taille hétérogène. Nous décrivons ici une méthode pour analyser et trier ces pastilles de manière à haut débit. Ces pastilles peuvent être utilisées pour d&#39;autres analyses, qui fourniront conduit à comprendre et à contrôler l&#39;hétérogénéité de croissance.

Tri des<em&gt; Streptomyces</em&gt; culots cellulaires à l&#39;aide d&#39;un objet complexe paramétrique Analyzer et trieuse

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

L'objectif général de cette procédure est de trier les pelotons mycéliens formés par les streptomyces filamenteux selon leur taille, à l'aide d'un cytomètre en flux COPA pour particules de grande taille. Cela est réalisé dans un premier temps par la culture puis l'échantillonnage de la souche bactérienne souhaitée. Dans une deuxième étape, la souche échantillonnée est mesurée par COPA.Les données sont ensuite analysées in silico et les pellets mycéliens sont triés selon des paramètres définis par l'utilisateur. En fin de compte, ces analyses peuvent être utilisées pour caractériser davantage l'hétérogénéité de la taille des pellets. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour Streptomyces, elle peut également s'appliquer à d'autres organismes tels que les champignons filamenteux, ce qui démontre que cette procédure sera réalisée par MaRous Petrus, un étudiant au doctorat de notre laboratoire.Tout d'abord, faire croître les cultures en ajoutant 100 millilitres de milieu extrait de levure, extrait de malt et 0,2 millilitre de chlorure de magnésium 2,5 M à un flacon Erlenmeyer stérile de 250 millilitres, équipé de ressorts métalliques enroulés, pour chaque échantillon bactérien. Ensuite, ensemencer chaque flacon avec 1 × 10⁸ spores de Streptomyces afin d'obtenir une concentration de spores de 1 × 10⁶ spores par millilitre, puis faire croître les bactéries à 30 °C sous agitation à 180 tr/min. Après deux jours, utiliser une pipette stérile de 5 millilitres pour prélever un échantillon de 5 millilitres de chaque culture, tout en agitant doucement le flacon afin de répartir uniformément les cellules.Ensuite, répartir chaque échantillon dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres. Pour évaluer les échantillons par analyse en cytométrie en flux, s'assurer que l'ordinateur de la cytomètre à flux et le laser à argon de 488 nanomètres sont allumés, puis ouvrir le logiciel de cytométrie. Vérifier que la bouteille de fluide de gainage est pleine et que la bouteille de déchets est vide, puis cliquer sur démarrer et exécuter.Pour passer le laser argon de 488 nanomètres de la mise en veille à l'état activé, attendez environ 60 secondes, puis le laser sera prêt. Cliquez sur « fait », puis vérifiez les manomètres. Cochez la case située à côté de la pression.OK, puis une fois que le système a amorcé la cellule d'écoulement, vérifiez que le réglage de délai est à 11 et que la largeur est à sept. Réglez les seuils à 50 pour le signal et à 40 pour le temps de vol minimum. Ensuite, retirez l'eau résiduelle du récipient d'échantillon.Ajoutez environ 50 millilitres de PBS, puis ajoutez 0,1 millilitre de l'un des échantillons de strep demy dans le récipient. Assurez-vous que le récipient est bien fermé, puis cliquez sur acquérir pour commencer la collecte de données. Régulez la vitesse de flux afin d'obtenir entre 30 et 50 événements par seconde lorsque au moins 2 500 événements ont été collectés.Cliquez, arrêtez, puis stockez pour enregistrer les données destinées à une analyse statistique ultérieure afin de trier les pastilles bactériennes pour chaque échantillon. Définissez d'abord les limites de tri et saisissez les détails concernant les valeurs minimales et maximales du temps de vol. Sinon, sélectionnez des régions, puis définissez la région de la fenêtre pour créer une zone permettant de sélectionner les pastilles ayant les dimensions et propriétés souhaitées.Placez un tube de 50 millilitres pour recueillir les pastilles qui répondent aux paramètres de tri. Réglez ensuite le nombre de pastilles à trier et cliquez sur « trier manuellement » pour effectuer le tri selon les paramètres sélectionnés. Après le tri, retirez l'échantillon restant et rincez deux fois le godet d'échantillonnage à l'eau.Avant d’éteindre le copus, nettoyez la cuve à échantillons avec de l’éthanol à 70 %. Faites maintenant fonctionner le système deux fois : une fois avec de l’eau chlorée et une fois avec de l’eau ordinaire, puis videz le récipient de trop-plein. Après le nettoyage, cliquez sur arrêt pour relâcher la pression du système.Lorsque le moteur s'arrête, fermez le programme et cliquez sur arrêter sans purger. Ensuite, éteignez l'ordinateur, le copa, le laser et la pompe streptomyces form. Des pellets mycéliens et des cultures liquides qui présentent une large gamme de tailles.Pour analyser la distribution de la taille des granulés, une culture de streptomyces cila color cultivée en milieu liquide depuis deux jours a été soumise à une cytométrie en flux pour particules de grande taille à l’aide d’un analyseur Copus Plus équipé d’un embout de un millimètre. Voici un graphique de dispersion typique obtenu avec le Copus. L’axe des abscisses représente le temps de vol.Plus l'objet est grand, plus il met de temps à traverser le faisceau laser. L'axe des Y indique l'extinction, qui représente la densité optique de l'objet ; chaque point du graphique correspond à un granule unique traversant le faisceau laser. Le tracé des points de données sous forme d'histogramme a montré que les tailles de cet échantillon représentatif n'étaient pas distribuées normalement.La distribution semblait être asymétrique à droite sur une échelle logarithmique. La transformation du jeu de données n’a pas non plus conduit à une distribution normale. Afin d’évaluer si la distribution des tailles pouvait s’expliquer par un mélange de deux distributions normales, les données ont été modélisées mathématiquement. La modélisation a effectivement révélé une population de petits granulés, représentant 92 % de l’ensemble des granulés, avec une taille moyenne de 248 micromètres, et une population de granulés plus gros, composant 8 % de tous les granulés, avec une taille moyenne de 319 micromètres.Ici, une analyse représentative de micro-colonies triées à partir des populations de pellet de grande et de petite taille est présentée. Les tailles moyennes des pellets des deux populations ont été utilisées pour définir les limites de tri, afin de limiter le tri des pellets issus de la zone de chevauchement entre les deux distributions de taille : les pellets de moins de 248 micromètres ont été considérés comme appartenant à la population de petits pellets, tandis que ceux de plus de 319 micromètres ont été considérés comme provenant de la population de grands pellets. L'analyse microscopique des pellets triés a confirmé leurs tailles distinctes suite à cette procédure.D'autres méthodes, telles que le séquençage de nouvelle génération ou la protéomique, peuvent être réalisées afin de comprendre les mécanismes sous-jacents à cette hétérogénéité.

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