Tri des

L'objectif général de cette procédure est de trier les pelotons mycéliens formés par les streptomyces filamenteux selon leur taille, à l'aide d'un cytomètre en flux COPA pour particules de grande taille. Cela est réalisé dans un premier temps par la culture puis l'échantillonnage de la souche bactérienne souhaitée. Dans une deuxième étape, la souche échantillonnée est mesurée par COPA.

Les données sont ensuite analysées in silico et les pellets mycéliens sont triés selon des paramètres définis par l'utilisateur. En fin de compte, ces analyses peuvent être utilisées pour caractériser davantage l'hétérogénéité de la taille des pellets. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour Streptomyces, elle peut également s'appliquer à d'autres organismes tels que les champignons filamenteux, ce qui démontre que cette procédure sera réalisée par MaRous Petrus, un étudiant au doctorat de notre laboratoire.

Tout d'abord, faire croître les cultures en ajoutant 100 millilitres de milieu extrait de levure, extrait de malt et 0,2 millilitre de chlorure de magnésium 2,5 M à un flacon Erlenmeyer stérile de 250 millilitres, équipé de ressorts métalliques enroulés, pour chaque échantillon bactérien. Ensuite, ensemencer chaque flacon avec 1 × 10⁸ spores de Streptomyces afin d'obtenir une concentration de spores de 1 × 10⁶ spores par millilitre, puis faire croître les bactéries à 30 °C sous agitation à 180 tr/min. Après deux jours, utiliser une pipette stérile de 5 millilitres pour prélever un échantillon de 5 millilitres de chaque culture, tout en agitant doucement le flacon afin de répartir uniformément les cellules.

Ensuite, répartir chaque échantillon dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres. Pour évaluer les échantillons par analyse en cytométrie en flux, s'assurer que l'ordinateur de la cytomètre à flux et le laser à argon de 488 nanomètres sont allumés, puis ouvrir le logiciel de cytométrie. Vérifier que la bouteille de fluide de gainage est pleine et que la bouteille de déchets est vide, puis cliquer sur démarrer et exécuter.

Pour passer le laser argon de 488 nanomètres de la mise en veille à l'état activé, attendez environ 60 secondes, puis le laser sera prêt. Cliquez sur « fait », puis vérifiez les manomètres. Cochez la case située à côté de la pression.

OK, puis une fois que le système a amorcé la cellule d'écoulement, vérifiez que le réglage de délai est à 11 et que la largeur est à sept. Réglez les seuils à 50 pour le signal et à 40 pour le temps de vol minimum. Ensuite, retirez l'eau résiduelle du récipient d'échantillon.

Ajoutez environ 50 millilitres de PBS, puis ajoutez 0,1 millilitre de l'un des échantillons de strep demy dans le récipient. Assurez-vous que le récipient est bien fermé, puis cliquez sur acquérir pour commencer la collecte de données. Régulez la vitesse de flux afin d'obtenir entre 30 et 50 événements par seconde lorsque au moins 2 500 événements ont été collectés.

Cliquez, arrêtez, puis stockez pour enregistrer les données destinées à une analyse statistique ultérieure afin de trier les pastilles bactériennes pour chaque échantillon. Définissez d'abord les limites de tri et saisissez les détails concernant les valeurs minimales et maximales du temps de vol. Sinon, sélectionnez des régions, puis définissez la région de la fenêtre pour créer une zone permettant de sélectionner les pastilles ayant les dimensions et propriétés souhaitées.

Placez un tube de 50 millilitres pour recueillir les pastilles qui répondent aux paramètres de tri. Réglez ensuite le nombre de pastilles à trier et cliquez sur « trier manuellement » pour effectuer le tri selon les paramètres sélectionnés. Après le tri, retirez l'échantillon restant et rincez deux fois le godet d'échantillonnage à l'eau.

Avant d’éteindre le copus, nettoyez la cuve à échantillons avec de l’éthanol à 70 %. Faites maintenant fonctionner le système deux fois : une fois avec de l’eau chlorée et une fois avec de l’eau ordinaire, puis videz le récipient de trop-plein. Après le nettoyage, cliquez sur arrêt pour relâcher la pression du système.

Lorsque le moteur s'arrête, fermez le programme et cliquez sur arrêter sans purger. Ensuite, éteignez l'ordinateur, le copa, le laser et la pompe streptomyces form. Des pellets mycéliens et des cultures liquides qui présentent une large gamme de tailles.

Pour analyser la distribution de la taille des granulés, une culture de streptomyces cila color cultivée en milieu liquide depuis deux jours a été soumise à une cytométrie en flux pour particules de grande taille à l’aide d’un analyseur Copus Plus équipé d’un embout de un millimètre. Voici un graphique de dispersion typique obtenu avec le Copus. L’axe des abscisses représente le temps de vol.

Plus l'objet est grand, plus il met de temps à traverser le faisceau laser. L'axe des Y indique l'extinction, qui représente la densité optique de l'objet ; chaque point du graphique correspond à un granule unique traversant le faisceau laser. Le tracé des points de données sous forme d'histogramme a montré que les tailles de cet échantillon représentatif n'étaient pas distribuées normalement.

La distribution semblait être asymétrique à droite sur une échelle logarithmique. La transformation du jeu de données n’a pas non plus conduit à une distribution normale. Afin d’évaluer si la distribution des tailles pouvait s’expliquer par un mélange de deux distributions normales, les données ont été modélisées mathématiquement. La modélisation a effectivement révélé une population de petits granulés, représentant 92 % de l’ensemble des granulés, avec une taille moyenne de 248 micromètres, et une population de granulés plus gros, composant 8 % de tous les granulés, avec une taille moyenne de 319 micromètres.

Ici, une analyse représentative de micro-colonies triées à partir des populations de pellet de grande et de petite taille est présentée. Les tailles moyennes des pellets des deux populations ont été utilisées pour définir les limites de tri, afin de limiter le tri des pellets issus de la zone de chevauchement entre les deux distributions de taille : les pellets de moins de 248 micromètres ont été considérés comme appartenant à la population de petits pellets, tandis que ceux de plus de 319 micromètres ont été considérés comme provenant de la population de grands pellets. L'analyse microscopique des pellets triés a confirmé leurs tailles distinctes suite à cette procédure.

D'autres méthodes, telles que le séquençage de nouvelle génération ou la protéomique, peuvent être réalisées afin de comprendre les mécanismes sous-jacents à cette hétérogénéité.