Multi-enzyme préalable au moyen d'un système de criblage enzymatique génétique à haut débit

L’objectif global de cette méthodologie est d’évaluer plusieurs enzymes à l’aide d’un seul système de criblage à haut débit. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des micro-organismes et de la bio-ingénierie sur le criblage métagénomique et l’ingénierie enzymatique. Nous avons mis au point un système de criblage enzymatique génétique composé du composé de phénylène répondant au mutant MPL et de son rapporteur GFP en aval.

Une fois qu’un gène métagénomique montre l’activité enzymatique qui nous intéresse en réagissant avec le substrat fourni, un composé phénylène du produit de réaction active le mutant Dmp et déclenche l’expression du rapporteur GFP qui peut facilement être capturé par un compteur de fluorescence. Le principal avantage de cette technique est que, contrairement aux techniques de criblage conventionnelles, cette méthode unique est applicable au criblage de plusieurs types d’enzymes différentes en utilisant le substrat approprié. La démonstration de cette procédure sera faite par Kil Koang Kwon, un étudiant diplômé de notre laboratoire.

Après avoir construit une banque métagénomique chez E. Coli avec un vecteur fosmide à l’aide d’un kit de production de banque de fosmides, transportez l’ADN pGESS(E135K) dans les cellules de la bibliothèque métagénomique. Stockez ensuite les cellules de bibliothèque transformées à moins 70 degrés Celsius et à 20 aliquotes de microlitres. Pour éliminer les faux positifs, décongelez d’abord une aliquote de cellule de banque métagénomique sur de la glace.

Ensuite, inoculez dix microlitres de cellules décongelées dans deux millilitres de bouillon de lysogénate contenant de l’ampicilline et du chloramphénicol dans un tube à fond rond de 14 millilitres à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant quatre heures. Pendant ce temps, définissez les paramètres appropriés sur la machine FACS pour la lecture des cellules de la bibliothèque métagénomique dans le logiciel FACS par défaut. À la fin de l’incubation, transférez cinq microlitres de cellules dans un millilitre de PBS dans un tube à fond rond de cinq millilitres.

Ensuite, chargez l’échantillon de bibliothèque dilué et ajustez le taux d’événements à 1000 à 1500 événements par seconde. Pour générer un nuage de points vers l’avant à l’échelle logarithmique par rapport à un nuage de points latéral à l’échelle logarithmique sur une feuille de calcul globale, créez un diagramme à points et tracez une porte polygonale autour des événements singulet contenant la population bactérienne. Pour tracer un histogramme du nombre de cellules par rapport à l’histogramme de la zone FITC à l’échelle loglogarithmique, ouvrez un histogramme et ajustez la tension FITC de sorte que le pic de la distribution en forme de cloche soit inférieur à dix puissance deux de la zone FITC.

Ensuite, ouvrez un autre graphique à points pour créer une zone de diffusion directe à l’échelle logarithmique par rapport à un graphique de zone FITC logarithmique et définissez une porte de tri R2 entre plus cinq et moins cinq pour cent des cellules à partir du centre de la distribution. Lorsque toutes les portes ont été réglées, placez un tube de prélèvement contenant 1,2 millilitre de bouillon de lysogénate supplémenté en antibiotiques à la sortie de l’instrument FACS et triez une fois dix à la sixième des cellules fermées dans le bouillon. À la fin du tri, bouchez le tube de collecte et tourbillonnez doucement les cellules.

Pour cribler les enzymes métagénomiques d’intérêt, incubez les cellules triées à 37 degrés Celsius et 200 tr/min jusqu’à ce que la DO 600 atteigne 0,5, puis ajoutez un microlitre de solution d’induction de copie pour amplifier le nombre de copies de fosmide intracellulaires. Après trois heures à 37 degrés Celsius et 250 tr/min, combinez 0,5 millilitre de cellules avec le substrat approprié dans un tube à fond rond de 14 millilitres jusqu’à une concentration finale de 100 micromolaires. Ensuite, incubez les échantillons de contrôle et expérimentaux à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant trois heures supplémentaires.

Pendant que les échantillons agitent, réglez les paramètres de la machine FACS comme nous venons de le démontrer. Ensuite, ajoutez cinq microlitres de cellules de chaque échantillon dans des tubes à fond rond individuels de cinq millilitres contenant un millilitre de PBS. Ensuite, chargez les cellules d’échantillonnage et définissez le taux d’événements sur 1000 à 3000 événements par seconde.

Créez un graphique de dispersion vers l’avant à l’échelle logarithmique par rapport à une zone de diffusion latérale à l’échelle logarithmique et ajustez la porte de diffusion R1 pour englober les cellules bactériennes de l’événement singulet. Créez ensuite un nuage de points de la zone FITC à l’échelle logarithmique et définissez une porte de tri R2 de sorte que moins de 0,1 % des cellules négatives soient détectées. Maintenant, chargez le tube d’échantillon et réajustez le taux d’événements à 1000 à 3000 événements par seconde, si nécessaire.

Placez ensuite un tube de prélèvement contenant 0,5 millilitre de bouillon de lysogénate à la sortie de l’instrument FACS et recueillez une fois dix fois à la quatrième des cellules à l’intérieur des portes R1 et R2. Lorsque toutes les cellules ont été isolées, fermez le tube de prélèvement et vortex doucement les cellules. Ensuite, étalez 0,5 millilitre des échantillons collectés sur deux plaques de gélose de 90 millimètres contenant du bouillon de lysogénate complété par des antibiotiques, puis incubez les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Dans cette figure, le protocole de dépistage démontré est illustré, y compris l’élimination des faux positifs par tri négatif et la sélection des résultats positifs à l’aide des portes de tri R1 et R2. Les résultats peuvent ensuite être évalués en comparant la florescence de l’échantillon avec et sans le substrat. Dans ce criblage représentatif médié par l’acétate p-nitrophique, la florescence des cellules traitées au substrat était supérieure à celle des cellules témoins, confirmant cinq candidats lipases dans cette expérience.

Malgré les larges distributions de ces trois celluloses candidates, des différences nettes sont observées dans l’intensité moyenne de la FITC des populations. Ces quatre candidats phosphatases présentent également des niveaux de florescence élevés par rapport aux cellules témoins. De plus, l’activité de la phosphatase alcaline des vecteurs insérés dans l’orf peut être confirmée par cytométrie en flux avec un signal de fluorescence plus fort observé pour l’enzyme touchée que pour les cellules portant le plasmide vide.

Il est important de se rappeler que cette technique peut être appliquée au criblage d’un large éventail d’enzymes en choisissant un substrat et une concentration de ration appropriés. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme le séquençage de nouvelle génération, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’identification et la caractérisation de l’enzyme candidate à haut débit. Après son développement, cette technique de criblage enzymatique à haut débit a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’ingénierie enzymatique pour explorer diverses enzymes métagénomiques sans avoir besoin d’une spécificité enzymatique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le système de criblage à haut débit basé sur un circuit métogène avec une large gamme de cibles enzymatiques.