Détection de l’expression de l’enzyme cible dans les cellules bactériennes génétiquement modifiées

Commencez par des tubes contenant des cellules bactériennes génétiquement modifiées. Chaque bactérie porte des fosmides à haute capacité qui codent pour diverses enzymes.

Incubez les tubes avec des secousses pour faciliter l’expression de diverses enzymes intracellulaires.

Ajoutez un substrat spécifique à l’enzyme cible dans le tube à essai et ajoutez un volume égal de tampon au tube témoin.

Incubez avec des secousses. Le substrat pénètre dans les cellules, où les enzymes cibles le clivent, générant un produit fluorescent.

Chargez le tube de contrôle dans un cytomètre à débit précalibré.

À mesure que chaque cellule traverse un faisceau laser, elle diffuse la lumière. Générez un diagramme de points pour identifier les cellules individuelles, qui diffusent moins de lumière que les amas de particules.

Excluez les amas cellulaires et tracez le signal de fluorescence des cellules individuelles pour établir la fluorescence de base.

Placez le tube traité au substrat dans le cytomètre à flux pour mesurer le signal de fluorescence.

Un signal de fluorescence accru dans les cellules traitées par substrat par rapport aux cellules témoins confirme l’expression de l’enzyme cible.

Pour dépister les enzymes métagénomiques d’intérêt, incubez les cellules triées à 37 degrés Celsius et 200 RPM jusqu’à ce que le OD₆₀₀ atteigne 0,5. Ajoutez ensuite 1 microlitre de solution d’induction de copie pour amplifier le nombre de copies intracellulaires de fosmid.

Après trois heures à 37 degrés Celsius et 250 tr/min, combinez 0,5 millilitre des cellules avec le substrat approprié dans un tube à fond rond de 14 millilitres pour obtenir une concentration finale de 100 micromolaires. Ensuite, incubez les échantillons témoins et expérimentaux à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant encore trois heures.

Pendant que les échantillons tremblent, réglez les paramètres de la machine FACS comme cela vient de le démontrer. Ensuite, ajoutez 5 microlitres de cellules de chaque échantillon dans des tubes individuels de 5 millilitres à fond rond contenant 1 millilitre de PBS. Ensuite, chargez les cellules d’échantillonnage et réglez le taux d’événements à 1000 à 3000 événements par seconde.

Créer un diagramme de diffusion avant à échelle logarithmique versus zone de dispersion latérale à échelle logarithmique, et ajuster la grille de diffusion R1 pour englober les cellules bactériennes de l’événement singlet. Puis créez un diagramme de diffusion directe à l’échelle logarithmique versus un diagramme de dispersion FITC à échelle logarithmique et réglez une grille de tri R2 de sorte que moins de 0,1 % des cellules négatives soient détectées. Maintenant, chargez le tube d’échantillonnage et réajustez le taux d’événements à 1000 à 3000 événements par seconde, si nécessaire.