Détection de l’expression de l’enzyme cible dans les cellules bactériennes génétiquement modifiées

Commencez par des tubes contenant des cellules bactériennes génétiquement modifiées. Chaque bactérie porte des fosmides à haute capacité qui codent pour diverses enzymes.

Incubez les tubes avec des secousses pour faciliter l’expression de diverses enzymes intracellulaires.

Ajoutez un substrat spécifique à l’enzyme cible dans le tube à essai et ajoutez un volume égal de tampon au tube témoin.

Incubez avec des secousses. Le substrat pénètre dans les cellules, où les enzymes cibles le clivent, générant un produit fluorescent.

Chargez le tube de contrôle dans un cytomètre à débit précalibré.

À mesure que chaque cellule traverse un faisceau laser, elle diffuse la lumière. Générez un diagramme de points pour identifier les cellules individuelles, qui diffusent moins de lumière que les amas de particules.

Excluez les amas cellulaires et tracez le signal de fluorescence des cellules individuelles pour établir la fluorescence de base.

Placez le tube traité au substrat dans le cytomètre à flux pour mesurer le signal de fluorescence.

Un signal de fluorescence accru dans les cellules traitées par substrat par rapport aux cellules témoins confirme l’expression de l’enzyme cible.

Pour dépister les enzyme