-Étape spécifique de tri Spermatides souris par cytométrie en flux

L’objectif global de cette procédure est de séparer les spermatides de souris en quatre populations distinctes, permettant l’étude moléculaire de la spermiogenèse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la reproduction miroir, telles que l’impact de la modélisation chromatique sur l’intégrité génomique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de séparer les spermatozoïdes en population de cellules pures sans contamination croisée.

Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons observé d’importantes variations de l’intensité de la coloration DN lors du remodelage de la chromatine dans les paramètres haplologiques la veille du tri cellulaire. Ajoutez un à deux millilitres de FBS inactivé par la chaleur à des tubes coniques en polypropylène de cinq millilitres à fond rond et à des tubes coniques en polypropylène de 15 et 50 millilitres. Ensuite, enduisez lentement les tubes par inversion pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur un rotateur le lendemain.

Décantez soigneusement le FBS à l’aide d’une pipette P 200 pour éliminer tout FBS résiduel des tubes de 15 et 50 millilitres et en laissant un petit volume résiduel de 100 à 200 microlitres de FBS dans les tubes de cinq millilitres pour collecter les cellules purifiées le jour de la cellule. Tri, hacher les éprouvettes encapsulées dans 500 microlitres de tampon de tri. Transférez ensuite les fragments de tissu dans un tube de 1,5 millilitre à l’aide d’une pointe de micro-pipette tronquée.

Rincer les cellules germinales des tubes séminifères à l’aide d’un pipetage doux de haut en bas, suivi d’un rinçage avec une pointe intacte. Ensuite, utilisez une crépine de 40 microns pour éliminer les débris et les amas qui collectent le filtrat dans un tube conique de 50 millilitres revêtu de FBS. Lavez le filtre une fois avec un tampon de tri jusqu’à un volume total de trois millilitres et transférez le filtrat dans un tube conique de 15 millilitres revêtu de FBS.

Ajoutez ensuite 16 microlitres d’EDTA par millilitre de suspension cellulaire dans les cellules et utilisez une pipette de 10 millilitres pour fixer lentement les cellules pendant une minute avec trois volumes de glace froide, 100 % éthanol tandis qu’en vortex à basse vitesse, la suspension deviendra laiteuse après la fixation. Incuber les cellules sur de la glace pendant 15 minutes avec une inversion occasionnelle. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire, remettez la palette en suspension dans deux millilitres de tampon de tri et colorez les cellules germinales avec quatre microlitres de DNAD cyto 16 immédiatement avant le tri.

Filtrez les cellules à travers un filtre de 50 microns dans un tube de fax revêtu de FBS et lavez soigneusement le filtre avec un à deux millilitres de tampon de tri. Chargez les cellules germinales fixes sur un trieur de cellules équipé d’un laser de 488 nanomètres. Ensuite, affichez le nombre total d’événements à l’aide d’un histogramme représentant le nombre d’événements contre la zone Alexa floor 4 88 et gate les cellules de coloration de l’ADN positives.

Affichez ensuite les cellules de cette porte dans une zone de diffusion latérale contre un tracé de zone de diffusion avant et une porte. Les cellules, comme indiqué, affichent ces cellules fermées dans une zone de diffusion vers l’avant contre une zone Alexa floor 4 88, un tracé et une porte. Les cellules affichent à nouveau ces portes dans des parcelles de zone Alexa de l’étage 4 à 88 séparées par rapport aux graphiques de zone de l’étage 4 à 88 d’Alexa.

La spermiogenèse se déroule de la première à la neuvième étape et de la 10e à la 12e étape. Les spermatides peuvent ensuite être contrôlées pour être triées afin de collecter les étapes 13 à 14 et 15 à 16. Les spermatides affichent les cellules de la première porte dans une zone de diffusion vers l’avant contre un tracé de zone EXOR 4 88 et une porte.

Les populations cellulaires indiquées sont les suivantes. Affichez ensuite ces portes dans Alexa individuelle. Étage 4 88 largeur contre Alexa étage 4 88 parcelles de zone et portail.

Les étapes 13 à 14 et 15 à 16 des spermatozoïdes pour le tri. Enfin, collectez les fractions purifiées dans 100 à 200 microlitres de FBS dans des tubes à fond rond de cinq millilitres recouverts de FBS sur de la glace. Dans ces images, des taches dappy du flux trié des populations frappées sont montrées.

Les étapes de la spermiogenèse de un à neuf spermatides présentent généralement des noyaux de forme ronde qui apparaissent de forme ovale dans la spermiogenèse. Spermatides de l’étape neuf, et qui sont observées comme des crochets allongés dans les étapes 10 à 12. Les étapes 13 à 14 et 15 à 16 des spermatides présentent des noyaux de forme similaire, mais avec une intensité de coloration de l’ADN légèrement différente, ce qui permet d’identifier ces populations distinctes lors de leur tri par cytométrie en flux.

Selon le protocole démontré, on peut s’attendre à ce que la pureté des populations individuelles de S expérimentées soit comprise entre 95 et 100 %. Si chaque étape est suivie correctement. Il ne faut pas oublier de toujours garder les cellules sur la glace tout au long de la procédure en suivant cette procédure pour obtenir des populations distinctes de spermatozoïdes, fournissant une quantité suffisante de matériel pour l’analyse moléculaire, comme la caractérisation du processus de remodelage spectaculaire ou l’étude de l’impact génétique de cette transition.