Isolement et préparation de parois cellulaires bactériennes pour l’analyse de composition par chromatographie liquide ultra-performante

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de digérer les parois cellulaires bactériennes afin de déterminer l’identité et les fractions relatives de différents neuropeptides. À l’aide de l’analyse UPLC, cela est accompli en lysant d’abord des échantillons bactériens en les faisant bouillir dans du sulfate d’écol de sodium. Après avoir lavé le SDS, la deuxième étape consiste à digérer les échantillons avec de la pronase E pour purifier la membrane externe des bactéries à Gram négatif.

Ensuite, les échantillons sont digérés avec de la méase pour solubiliser le peptidoglycane en neuropeptides individuels. La dernière étape consiste à réduire les neuropeptides et à ajuster le pH au point isoélectrique du neuropeptide. En fin de compte, l’UPLC est utilisé pour séparer les neuropeptides en fonction de leur taille et de leur hydrophobie, facilitant ainsi la quantification des caractéristiques importantes de la paroi cellulaire, telles que le degré de réticulation et la longueur moyenne des brins de glycanes.

Cette méthode peut aider à révéler les réponses à des questions clés dans le domaine de la microbiologie, telles que les relations entre la morphogenèse, l’architecture de la paroi cellulaire, l’activation du système immunitaire et la pathogenèse. Bien que cette méthode ait été développée pour purifier le peptidylglycane à Gram négatif, elle peut également être appliquée aux bactéries à Gram positif avec l’ajout de quelques enzymes et de traitements chimiques Pour faire repousser les cultures bactériennes, diluez les cultures de nuit de un à 100 dans 250 millilitres de milieu frais et atteignez la densité optique souhaitée à 600 nanomètres pendant que les cultures diluées se développent. Mettez en place un bain-marie bouillant sur une plaque chauffante dans un bécher d’un litre.

Une fois que l’eau bout, aliquote six millilitres de sulfate de dyle de sodium à 6 % ou SDS dans des tubes en polypropylène de 50 millilitres. Ajoutez un petit agitateur dans chaque tube et serrez fermement les couvercles des tubes à la main. Placez les tubes dans le bain-marie bouillant et remuez à 500 tr/min sur la plaque chauffante.

Récoltez les cultures de 250 millilitres en les faisant tourner à 5 000 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. Remettez les granulés en suspension dans trois millilitres de milieu ou une solution saline tamponnée x phosphate. Pipetez lentement les suspensions cellulaires dans les tubes de 50 millilitres avec 6 % de SDS bouillant pour époustiller les cellules pendant que les tubes sont immergés dans le bain d’eau bouillante et refermez les couvercles pour les serrer à la main.

Couvrez le bain-marie bouillant et laissez bouillir les cellules pendant trois heures, en vérifiant périodiquement le niveau d’eau et en remplissant le bain-marie si nécessaire. Au bout de trois heures, éteignez le feu de la plaque chauffante et continuez à remuer toute la nuit à 500 tr/min. Si le SDS a précipité dans les tubes de 50 millilitres pendant la nuit, réglez le bain-marie à ébullition pendant une à deux heures supplémentaires.

Voici à quoi devrait ressembler une culture normale après une lyse pendant la nuit. Dans les FDS, notez la transparence par opposition à l’opacité qui est corrélée aux précipitations. Préparez le tampon prone e et activez prone E à 60 degrés Celsius dans un bloc de chaleur pendant au moins 30 minutes.

Utilisez une ultracentrifugeuse réglée à 400 000 fois G pour faire tourner les échantillons pendant 20 minutes à température ambiante afin de granuler les grosses molécules de glycane de peptol ou de PG et ainsi les purifier des autres composants cellulaires. Retirez le surnageant avec précaution, puis remettez chaque pastille en suspension à température ambiante. Le volume de la suspension de réanimation d’eau ultrapure dépend du volume des tubes d’ultracentrifugation utilisés.

Utilisez un volume qui remplit les tubes au moins à moitié, mais ne dépasse pas le volume maximal des tubes. Répétez la centrifugation et le lavage jusqu’à ce que l’eau ne forme pas de bulles pendant la suspension de Resus, indiquant que le SDS a été complètement éliminé à ce stade. Resus suspend les échantillons dans 900 microlitres de tampon tris HCL et transfère dans des tubes de deux millilitres préalablement percés de trous dans les sommets.

À l’aide d’une petite aiguille, ajoutez 100 microlitres de pronase E activée à chaque échantillon avant de l’incuber à 60 degrés Celsius pendant deux heures. Arrêtez l’indigestion sujette en ajoutant 200 microlitres de 6 % SDS à chaque échantillon et faites bouillir les échantillons dans le bloc de chaleur à 100 degrés Celsius pendant 30 minutes. Comme précédemment, utilisez une ultracentrifugeuse réglée à 400, 000 fois G pour faire tourner les échantillons pendant 20 minutes à température ambiante et laver avec de l’eau ultrapure à température ambiante jusqu’à ce que le SDS soit complètement éliminé lors de la dernière étape de lavage par centrifugation, suspendez les échantillons dans 200 microlitres de tampon de phosphate de sodium de 50 millimolaires.

Ce volume peut être ajusté en fonction de la quantité de Pepto glycane dans l’échantillon et peut dépendre de l’espèce. Si l’échantillon contient plus de glycane pep, augmentez le volume de la suspension. Si l’échantillon contient peu de glycane peptidique.

Réduisez le volume de suspension du réus à un minimum de 50 microlitres. Transférez les échantillons dans des tubes de 1,5 millilitre et ajoutez un milligramme par millilitre de mease pour obtenir une concentration finale de 40 microgrammes par millilitre. Incuber pendant six à huit heures ou toute la nuit dans un bloc de chaleur de 37 degrés Celsius.

Pour préparer des échantillons pour l’UPLC, allumez un bloc de chaleur à 100 degrés Celsius. Faites bouillir les échantillons sans SDS pendant cinq minutes pour arrêter la digestion des échantillons de centrifugeuse pendant 10 minutes à 16 000 fois. G à température ambiante.

Les neuropeptides sont maintenant dans le surnageant. Transférez le surnageant dans des tubes de verre de 13 x 100 millimètres. Essayez de récupérer autant de surnageant que possible, en vous rapprochant très près du palais sans le déranger.

Ajustez le pH en ajoutant un tampon de borate de 500 millimolaires à l’échantillon pour une concentration finale de 100 tampons de borate millimolaire dont l’alésage de huit tampons est compatible avec l’agent réducteur. Ajoutez plusieurs grains de boro-hydrure de sodium pour réduire chaque échantillon et laissez la réaction se dérouler pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Ensuite, ajustez les échantillons au pH six mesuré avec du papier indicateur de pH avec de l’acide orthophosphorique en utilisant des incréments de 20 microlitres, l’échantillon doit bouillonner en réponse à l’ajout d’acide orthophosphorique.

L’échantillon cesse généralement de bouillonner lorsqu’un pH de six a été atteint. Continuez ensuite à ajuster les échantillons entre trois et quatre avec de l’acide orthophosphorique en utilisant deux incréments de microlitres. Filtrez l’échantillon à l’aide d’une seringue de 0,22 micron.

Filtrer directement dans le flacon A-U-P-L-C. Si un précipité s’est reformé dans les échantillons une fois transférés dans les flacons UPLC, chauffez les flacons en plusieurs passages à travers une flamme. Placez le flacon UPLC dans l’échantillonneur automatique et injectez 10 microlitres de chaque échantillon dans l’instrument A-U-P-L-C.

Equipé d’une colonne UPLC en phase inverse C 18 et d’un détecteur d’absorbance réglé pour surveiller. Des échantillons de 202 à 208 nanomètres sont injectés séquentiellement. Réglez le débit à 0,25 millilitre par minute et utilisez un gradient linéaire sur 25 minutes pour obtenir 100 % de solvant B et un E séquentiel de neuropeptides en 30 minutes.

Si la spectrométrie de masse doit être utilisée pour caractériser les neuropeptides après l’UPLC, prélever les fractions du pic d’intérêt dans un collecteur de fractions, transférer les fractions dans un tube de 1,5 millilitre, puis sécher les fractions à l’aide d’un évaporateur centrifuge, les fractions doivent être dessalées avant l’analyse MS. Dans ce résultat typique de l’UPLC. La détection par absorbance UV à 202 à 208 nanomètres en fonction du temps établit un temps de rétention particulier des neuropeptides.

Une résolution claire entre la plupart des espèces de neuropeptides et une forte intensité du signal sur l’ensemble du spectre sont observées, ce qui permet d’analyser le degré de réticulation de la longueur moyenne des brins de glycanes et l’identité des neuropeptides et leurs concentrations. Un exemple de chromatogramme reflétant la précipitation C des neuropeptides est présenté ici. Aucun pic n’a été mentionné, ce qui a entraîné l’absence de données sur la composition du PG.

L’absence de pics discernables dans l’analyse UPLC peut se produire à la suite d’une surconcentration de l’échantillon ou d’un mauvais ajustement du pH bien en dessous du point isoélectrique des neuropeptides. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours, bien que mouvementés, elle a été exécutée correctement après cette procédure. D’autres méthodes comme la spectrométrie de masse peuvent être utilisées pour identifier positivement les espèces de neuropeptides en fonction de la masse après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la microbiologie pour explorer la fonction biochimique des enzymes clés de la paroi cellulaire et le mode d’action des inhibiteurs chimiques chez une grande variété d’espèces et de mutants.