Name: Mesure des changements de sensibilité tactile dans la patte postérieure de souris à l’aide d’un appareil électronique de von Frey (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Apprenez à mesurer la sensibilité tactile dans la patte postérieure de souris à l'aide d'un appareil électronique de von Frey. Cette méthode permet une évaluation rapide et précise des seuils de retrait mécanique dans les modèles inflammatoires.

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NIH R15 NS067536-01A1 (à DC) et le Macalester College Wallace Research Fund (à DC) ont soutenu ces études. La bibliothèque du Macalester College a soutenu la publication en libre accès de cet article. De plus, nous remercions les membres actuels et anciens du laboratoire Chatterjea pour leur soutien.

Le comité institutionnel de soin et d'utilisation des animaux (IACUC) du Macalester College a approuvé tous les protocoles. Des souris suisses ND4 mâles âgées de 8 à 12 semaines ont été utilisées pour ces expériences.
1. Préparation et injection de venin de Bothrops jararaca
<ol>
	<li>ATTENTION : Le venin de B. jararaca est toxique. Portez des gants, un masque et des lunettes de protection lors de la manipulation de la poudre et de la préparation des solutions.</li>
	<li>Administrer 45 μg/kg de venin de B. jararaca (schéma déterminé par des expériences dose-réponse antérieures) ou 0,9 % de sérum physiologique (10 μl) par injection intraplantaire dans les deux pattes arrière à l’aide de seringues à insuline de 3/10 ml avec des aiguilles de 29 g x 1/2 po. Remarque : Selon la conception de l’expérience, les solutions de traitement et de contrôle peuvent être injectées séparément dans chaque patte arrière respectivement pour fournir des contrôles internes chez chaque sujet.</li>
</ol>
2. Configuration et fonctionnement de l’appareil électronique de von Frey
<ol>
	<li>Placez l’unité électronique von Frey sur le support de la sonde. Assurez-vous que la sonde et le câble sont correctement connectés à l’unité d’affichage et allumez l’instrument. Réglez la lecture à zéro (0,00 g) en mode de configuration et placez délicatement le poids de contrôle fourni (5,00 g) sur le cône de la sonde von Frey.</li>
	<li>Enregistrez la lecture dans un cahier de laboratoire et répétez cette procédure à la fin de la session de test. S’il y a un écart supérieur à 0,20 g entre les lectures de votre poids d’essai avant et après la séance d’essai, ou si l’affichage fluctue une fois que le poids d’essai est appliqué, un réétalonnage de l’appareil (par le fabricant) peut être nécessaire.</li>
	<li>Pour évaluer le seuil de retrait de la patte arrière de la souris, utilisez l’embout en polypropylène approprié parmi ceux fournis avec la sonde. Le choix de l’embout dépend du tissu sondé. Les pointes rigides fonctionnent bien pour les tissus de la patte arrière moins sensibles et plus coriaces, tandis que les pointes semi-flexibles peuvent être un meilleur choix pour une zone plus sensible comme la crête ano-génitale (Chatterjea, non publié). Montez délicatement l’embout rigide sur le cône de la sonde.</li>
	<li>Pour enregistrer la pression maximale appliquée, basculez le mode de fonctionnement de la configuration au fonctionnement de sorte que la pression maximale appliquée soit enregistrée sur l’écran. Dans ce mode, la lecture de la pression maximale appliquée sera enregistrée sur l’écran d’affichage lorsque la sonde est rétractée.</li>
</ol>
3. Considérations générales pour l’évaluation du seuil de retrait de la patte arrière
<ol>
	<li>Idéalement, deux enquêteurs sont nécessaires pour mesurer le seuil de retrait de la patte arrière (sensibilité mécanique) à l’aide d’un appareil EvF - un pour faire fonctionner l’appareil et effectuer les mesures, et un autre pour transcrire les mesures enregistrées et manipuler les souris.</li>
	<li>Afin de réduire le biais, l’investigateur qui utilise l’appareil doit être aveugle aux traitements et aux valeurs seuils de sevrage enregistrées. De plus, pour assurer l’uniformité entre les mesures, la même personne devrait évaluer tous les seuils de sevrage de base et expérimentaux.</li>
	<li>Effectuez toutes les mesures dans une pièce calme et à température contrôlée, et à la même heure du jour14.</li>
	<li>L’expérimentateur qui enregistre les mesures doit placer chaque souris dans des chambres individuelles de boîtier multi-unités en polyméthacrylate de méthyle (PMMA) fixé sur un support de sol grillagé. Couvrez les chambres avec des couvercles en PMMA perforés et placez un objet lourd sur le dessus, pour empêcher les souris de s’échapper. Placez un matériau absorbant sous le support pour absorber/collecter les déchets excrétés. Laisser les souris s’acclimater pendant 15 minutes dans des chambres avant l’évaluation initiale ou expérimentale du seuil de sevrage 6,7,10.</li>
	<li>Les pattes arrière des souris doivent être facilement accessibles à travers les ouvertures du sol en treillis ; par conséquent, placez le support de sol en maille à une hauteur confortable sur un chariot avec freins, ou sur un plan de travail stable accessible de tous les côtés.</li>
	<li>Pendant les mesures, les souris peuvent devoir être distraites par une pastille de nourriture15 placée juste à l’extérieur de la chambre de mesure ou par un très léger bruit produit en tapotant ou en faisant passer un stylo le long du grillage du sol de la chambre avant, mais pas pendant, la mesure. Cela incite la souris à rester immobile, ce qui permet à l’expérimentateur de commencer à prendre des mesures plus facilement.</li>
</ol>
4. Évaluation de base du seuil de retrait de la patte postérieure
<ol>
	<li>La première série de mesures de base doit être effectuée 48 heures avant l’administration du traitement. Mettez la sonde à zéro lors du montage de la pointe rigide. À l’aide des deux mains, soulevez lentement la sonde pour stimuler le milieu (zone du coussinet) de la patte arrière gauche ou droite (si les deux pattes ont reçu le même traitement).</li>
	<li>Augmentez progressivement la pression jusqu’à ce que des comportements de réponse nociceptive définis tels que la rétraction de la patte arrière, le léchage de la patte arrière ou le saut à quatre pattes6,10 soient observés. Demandez à l’autre enquêteur de transcrire la pression qui a provoqué le comportement observé.</li>
	<li>Mesurez le seuil de retrait de la souris située dans la chambre adjacente. Continuez jusqu’à ce que vous ayez évalué une fois les seuils de retrait de chaque souris. Répétez l’opération quatre fois de plus, de sorte que chaque souris soit mesurée 5 fois, comme décrit précédemment10.</li>
	<li>Pour chaque souris, calculez la valeur médiane des 5 mesures, puis calculez dans quelle mesure chaque valeur s’écarte de la médiane. Sélectionnez 3 valeurs qui s’écartent le moins et faites-en la moyenne pour obtenir un seuil de retrait de référence tel que décrit précédemment10. Dans cette démonstration, la mesure a été normalisée en utilisant 3 valeurs sur 5 ; Bien que le nombre spécifique de mesures puisse varier selon la conception expérimentale, il est important de s’assurer que toutes les souris sont piquées un nombre égal de fois pour évaluer les lignes de base.</li>
	<li>Répétez les mesures de base 24 heures plus tard. Prenez 5 mesures par souris et faites la moyenne des 3 qui sont les plus proches de la médiane pour obtenir un seuil de retrait de référence.</li>
	<li>Pour calculer le seuil de sevrage de base moyen d’une souris, faites la moyenne de ses seuils de sevrage de base pris à 48 et 24 heures avant le traitement. Si le seuil de retrait moyen de base est inférieur à 3,50 g, ou si les deux seuils de base diffèrent de 2,00 g ou plus, excluez la souris de l’expérience. Ces critères garantissent que toutes les souris de l’expérience ont des réponses de base cohérentes et des seuils de sevrage de base suffisamment élevés pour permettre d’observer des seuils plus bas après le traitement.</li>
	<li>Remarque : Le seuil d’exclusion dépendra du tissu sondé, de la souche des animaux étudiés et du type d’embout utilisé. Par exemple, nous avons constaté que 3,5 g est un point de référence utile pour le tissu ND4 de la patte arrière, mais les zones plus sensibles telles que la crête ano-génitale nécessitent un seuil d’exclusion plus bas (Chatterjea, non publié).</li>
	<li>Répartissez les souris dans des groupes de traitement de manière à ce que la base de référence moyenne du sevrage des groupes expérimentaux soit aussi similaire que possible avant l’administration des traitements.</li>
</ol>
Remarque : Les mesures de base peuvent être effectuées avant 48 heures avant une expérience. Cependant, au moins 2 séries de mesures de référence à intervalles réguliers avant le début des traitements doivent être effectuées.
5. Évaluation expérimentale du seuil de retrait de la patte postérieure
<ol>
	<li>Évaluer le seuil de retrait de la patte arrière (sensibilité mécanique) après le traitement à des moments appropriés déterminés par le plan de l’expérience. Renvoyez les souris dans leurs cages avec accès à la nourriture et à l’eau rapidement après la fin des mesures.</li>
	<li>Suivez les étapes décrites ci-dessus ; prenez 3 mesures au lieu de 5 pour diminuer la possibilité de surstimuler le tissu de la patte arrière (traité), surtout si la sensibilité doit être évaluée à plusieurs moments de temps. Si deux mesures sur les trois prises diffèrent de plus de 2,00 g, prenez une quatrième mesure.</li>
	<li>Calculez la moyenne de 3 mesures pour obtenir le seuil de sevrage expérimental pour chaque souris. Pour toutes les souris pour lesquelles 4 mesures ont été prises, calculez la moyenne des trois qui s’écartent le moins de la médiane, afin d’obtenir un seuil de retrait expérimental.</li>
	<li>Pour obtenir le seuil de retrait delta pour chaque souris à un moment donné, soustrayez la ligne de base du seuil de retrait expérimental. Répétez l’opération pour toutes les souris et tous les points de temps expérimentaux9.</li>
	<li>Effectuer une analyse statistique appropriée sur les données recueillies. Ici, nous avons utilisé JMP 9.0 (SAS, Cary, NC) pour effectuer une analyse ANOVA à un facteur et une analyse post-hoc HSD de Tukey.</li>
</ol>

<ol><li>Meetoo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+diseases%3A+the+silent+global+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nurs%22%5BJournal%5D)">Chronic diseases: the silent global epidemic.</a> Br J Nurs. (21), 17-21 (2008).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent à divulguer.

La mesure des changements dans les réponses de sevrage est un outil important utilisé pour évaluer les changements dans la sensibilité tactile dans des modèles de douleur et d’inflammation chez les rongeurs. Nous démontrons ici l’utilité d’un appareil électronique de von Frey pour effectuer cette évaluation. Cette technique présente plusieurs avantages : i) nous pouvons évaluer rapidement les réponses de sevrage à la pression appliquée pour plusieurs souris à plusieurs points de temps assez proches les uns des autres, ii) nous pouvons utiliser une seule pointe pour appliquer une pression continue et spécifique sur une petite zone de tissu, iii) nous pouvons mesurer avec précision la pression précise appliquée pour obtenir une réponse de retrait, et iv) nous pouvons facilement mettre en œuvre des seuils de référence robustes, des critères d’exclusion et des contrôles internes pour garantir que les évaluations comportementales sont aussi précises et objectives que possible.
Les étapes essentielles pour garantir les meilleurs résultats pour un test EvF sont l’étalonnage préalable de l’instrument et des pratiques de mesure cohérentes. Comme détaillé dans la section protocole, l’instrument doit être manipulé avec soin et un étalonnage approprié doit être assuré avant et pendant l’utilisation. Avant d’effectuer des mesures, les valeurs de mesure doivent être confirmées afin d’assurer un fonctionnement optimal de la machine. Si les lectures fluctuent considérablement ou si les lectures du poids d’essai ne sont pas exactes, le fabricant doit être contacté rapidement pour étalonner l’appareil. Dans cette optique, il est conseillé, si possible, de disposer d’un appareil électronique de von Frey de secours, afin de ne pas compromettre les expériences sensibles au temps en raison d’un besoin inattendu d’étalonnage de l’instrument. De plus, un seul chercheur bien formé devrait prendre toutes les mesures de base et expérimentales pour une étude ou une série d’expériences donnée tout en restant à l’insu des groupes de traitement. Les souris doivent être évaluées dans une pièce calme, maintenues à une température constante, acclimatées aux chambres EvF pendant au moins 15 minutes, mais pas retenues dans la chambre plus longtemps que nécessaire (surtout si plusieurs mesures sont prises au cours d’une seule journée) afin de minimiser le stress et les variations comportementales induites par l’inconfort.
Les mesures EvF offrent des améliorations significatives par rapport aux techniques CvF existantes. Les chercheurs peuvent appliquer une pression continue et n’ont pas à passer d’une pointe de poids à l’autre comme c’est le cas dans les expériences de filament CvF6. Cela conduit à moins de piqûres sur les tissus, ce qui est particulièrement pertinent dans le cas de tissus enflammés ou blessés. La pression précise à laquelle le retrait se produit peut être mesurée par rapport à l’utilisation de mesures de retrait de 50 % qui sont également limitées par les poids de filament disponibles utilisés dans les mesures CvF13. Parce que des critères d’exclusion rationnels et uniformes peuvent être mis en œuvre (comme nous l’avons vu ci-dessus), les souris peuvent être affectées à des groupes expérimentaux de sorte que tous les groupes aient des lignes de base moyennes similaires au début de l’expérience. Les mesures EvF évaluent les changements dans la réponse comportementale à un stimulus donné, et non les réponses absolues elles-mêmes. Par conséquent, le changement de réponse nociceptive de chaque souris est mesuré comme la différence entre ses retraits expérimentaux et de base individuels, fournissant ainsi des contrôles internes pour chaque mesure prise.
La limitation la plus importante de l’EvF est peut-être que, comme son homologue manuel, le même chercheur doit prendre toutes les mesures pour une série particulière de mesures de référence et expérimentales. Cela rend la mise à l’échelle de la technique difficile du point de vue du temps, du personnel et de l’équipement. Nous constatons que ~20 souris à la fois (selon la configuration des chambres de test) peuvent être mesurées en 30-45 minutes ou moins à plusieurs points temporels, à condition qu’il y ait au moins 45 minutes entre les mesures. Une considération connexe à cet égard est la courbe d’apprentissage des expérimentateurs individuels. Une cohérence interne doit être établie avant qu’un chercheur puisse se lancer dans une expérience à grande échelle, ce qui nécessite de nombreuses heures de pratique dédiée impliquant des mesures répétées de la réponse de base jusqu’à ce que la cohérence souhaitée soit atteinte. De plus, l’utilisation de seuils de base implique que toutes les souris de base pour une expérience ne peuvent pas être incluses ; Nous constatons que 25 à 30 % des souris de base par expérience sont généralement exclues.
En termes de modifications et d’applications futures, les mesures comportementales de l’EvF ajoutent une dimension puissante à un large éventail de modèles d’inflammation pour analyser les douleurs aiguës et/ou chroniques concomitantes qui peuvent être à l’origine de pathologies inflammatoires. Dans l’envenimation, nous avons constaté que des changements prononcés et rapides de la sensibilité tactile accompagnaient les résultats attendus de gonflement des tissus, de recrutement de leucocytes et de dégranulation des mastocytes dans les pattes arrière des souris mâles ND4. Ces résultats corroborent les observations précédentes sur les contributions des médiateurs des mastocytes à la sensibilité thermique chez les rats20 et la sensibilité mécanique induite par le venin de B. jararaca chez les souris suisses ND4 mesurées à l’aide de CvF21. Le protocole EvF peut facilement être modifié pour être utilisé sur des tissus autres que la patte arrière , par exemple l’abdomen7 et la crête ano-génitale8 où CvF est actuellement utilisé. Les modèles d’allergies, de cicatrisation des plaies, de neuropathies et d’autres pathologies chez les rongeurs peuvent être facilement adaptés pour inclure des mesures de sensibilité mécanique dans les tissus, y compris et au-delà de la patte arrière.
En résumé, l’EvF est une technique utile et efficace qui met à jour une approche classique de mesure de la nociception chez les rongeurs et constitue un nouvel outil important pour sonder les mécanismes sous-jacents complexes de la douleur dans un large éventail de modèles de maladies.

Les maladies chroniques non transmissibles sont responsables d’une part disproportionnée du fardeau humain de la mortalité et de la morbidité1. La douleur chronique est de plus en plus reconnue comme une composante importante du fardeau mondial de la maladie2. Cela a donné un grand élan aux innovations dans la prévention, la gestion et le traitement de la douleur. Dans le même temps, il existe de nombreuses preuves que la biologie sous-jacente de la douleur est complexe3. Les mécanismes sous-jacents à la douleur protectrice ainsi qu’à la douleur inadaptée et chronique indiquent une interaction complexe entre les systèmes immunitaire et nerveux3,4. L’élucidation de ces mécanismes exige des approches expérimentales quantitatives rigoureuses et reproductibles, de la dissection moléculaire à l’analyse comportementale.
Les modèles de rongeurs ont été inestimables dans la caractérisation des acteurs moléculaires de la douleur inflammatoire et neuropathique5. La réduction du temps et de l’intensité des réponses précédemment spécifiées aux stimuli nocifs est utilisée pour mesurer les états de douleur chez ces animaux, car les sujets rongeurs ne sont pas autrement en mesure de signaler une sensation de douleur6. Les réponses modifiées à la température et à la pression sont couramment utilisées comme mesures de la sensibilité tissulaire dans les modèles de rongeurs de nociception inflammatoire pouvant être causée par une infection7,8, une exposition à des produits chimiques6, 9,10, une incision chirurgicale11, ainsi que des douleurs neuropathiques causées par la ligature nerveuse12.
La sensibilité mécanique, ou réponse aux stimuli de pression, est souvent mesurée à l’aide de filaments de von Frey classiques (CvF) - une série (par exemple 0,4-15 g13) d’embouts pondérés appliqués manuellement pour tester les tissus par incréments en série jusqu’à ce que des comportements douloureux soient induits chez les témoins par rapport aux sujets expérimentaux. Il existe différentes méthodes pour utiliser ces pointes ou poils afin d’évaluer la sensibilité mécanique6,13 ; La méthode la plus fréquemment utilisée est la suivante. Un pourboire avec une certaine pression (au sein de la série ; par exemple, 2 g13) est sélectionné comme point de départ, et le seuil de retrait de 50 % d'un rat ou d'une souris (l'intensité du stimulus nécessaire pour produire une réponse 50 % des fois où la pointe est appliquée sur le tissu) est déterminé en augmentant et en diminuant le poids de la pointe en fonction de l'affichage des comportements de réponse précédemment spécifiés13. Les seuils de sevrage absolus de 50 % pour les groupes de traitement sont ensuite comparés entre les points temporels de référence et post-traitement. Cette technique manuelle prend beaucoup de temps. En plus de l’augmentation du temps passé par chaque sujet confiné dans une chambre de von Frey, cela augmente également le nombre de fois où des pointes de test de différents poids sont appliquées sur des tissus enflammés, causant une plus grande gêne aux rongeurs de l’étude. De plus, des seuils de retrait de 50 % sont calculés et comparés entre groupes de rongeurs ; Les réponses individuelles des sujets expérimentaux ne sont généralement pas normalisées par rapport à leurs réponses individuelles de base non traitées, à notre connaissance, à une exception6. Par conséquent, les sujets rongeurs ne sont généralement pas signalés comme étant assignés aux groupes de traitement sur la base de réponses de base cohérentes dans une plage préalablement déterminée, et les sujets individuels ne sont pas non plus évalués sur la base d’un ensemble de critères d’exclusion appliqués de manière cohérente qui permettent de normaliser les réponses de base pour un ensemble particulier d’études et de tests.
Ici, nous présentons une méthode alternative pour mesurer la sensibilité tactile de la patte arrière de la souris après une exposition au venin de Bothrops jararaca à l’aide d’un appareil électronique de von Frey (EvF). Cunha et ses collèguesont été les pionniers de l’utilisation des techniques EvF chez les rongeurs et ont systématiquement comparé l’efficacité de CvF et d’EvF pour démontrer que EvF fournit une mesure « plus sensible, objective et quantitative » de la sensibilité tactile dans les modèles de rongeurs de douleur inflammatoire. En bref, dans les mesures EvF, une pointe en polypropylène von Frey non hygroscopique de diamètre uniforme (0,8 mm) de rigidité appropriée pour le tissu testé est fixée à une sonde électronique et à un affichage qui affiche la force/le poids auquel le rongeur se rétracte de la pointe. Il existe plusieurs différences importantes entre les mesures CvF et EvF. Tout d’abord, le processus de mesure des réponses de base et expérimentales à l’aide de l’EvF est considérablement rationalisé, car la pression sur la patte arrière peut être appliquée avec une force croissante jusqu’à ce qu’il y ait une réponse et qu’il ne soit pas nécessaire de changer d’embouts comme dans le CvF ; Les animaux passent moins de temps confinés dans les chambres d’essai et sont donc moins stressés et plus à l’aise pendant une expérience. Deuxièmement, l’EvF permet une relative facilité de mise en œuvre de critères d’exclusion rationnels pour les sujets de l’étude sous la forme de plages de seuils de référence acceptables. Cela permet de normaliser les réponses de base au sein des groupes de traitement et entre eux. Troisièmement, la réponse d'un sujet à la suite d'un traitement expérimental est toujours comparée à sa propre réponse de base individuelle, ce qui crée d'importants contrôles internes pour les mesures. Quatrièmement, la précision des seuils de retrait est enregistrée à un niveau de résolution plus élevé, car la pression peut être appliquée en continu plutôt que par incréments disponibles sous la forme de poids de filaments manuels. Comme pour les tests CvF bien conçus, des expériences basées sur l’EvF sont également menées avec le même investigateur (aveugle au traitement) appliquant la force et enregistrant les comportements de réponse. Il est important de noter que cette technique exige du temps et des efforts de la part des chercheurs pour établir l’uniformité interne des mesures et exige que les expériences soient planifiées de manière à tenir compte des souris qui pourraient devoir être exclues en raison de réponses de base incohérentes.
Une évaluation facile à mettre en œuvre, efficace et bien contrôlée de la sensibilité mécanique facilite l’ajout de l’évaluation comportementale aux modèles d’événements inflammatoires tels que l’envenimation - l’exemple que nous avons utilisé ici pour illustrer les capacités et la puissance des mesures de la Fve dans la mesure des changements de sensibilité tactile. Nous avons constaté que les souris suisses ND4 mâles présentaient une sensibilité mécanique accrue après l’injection de venin dérivé de la vipère d’Amérique du Sud Bothrops jararaca dans la patte arrière. Les réponses comportementales étaient accompagnées d’œdème, d’un afflux de neutrophiles et d’une dégranulation des mastocytes dans les tissus affectés.

<table><tbody><tr><td>ND4 Souris mâles suisses</td><td>Harlan</td><td>0-32</td> Les <td>souris utilisées ici étaient âgées de 8 à 12 semaines et ont été hébergées et utilisées conformément aux directives de l’IACUC du Macaleter College.</td></tr><tr><td>Seringue à insuline de 3 ml/100 avec aiguille BD de 29 g 1/2 po</td><td></td><td>BD309301</td><td>Jeter après chaque utilisation dans le contenant approprié.</td></tr><tr><td>B. jararaca venin</td><td>Sigma</td><td>V5625</td><td>ATTENTION : Substance toxique. Portez des lunettes de protection et une protection cutanée. Dissoudre dans une solution saline stérile à 0,9 %.</td></tr><tr><td>Appareil électronique de von Frey ; sonde = portée de 90 g</td><td>IITC</td><td>2394</td><td>Déplacez-vous doucement et assurez-vous qu’il est toujours horizontal. Pour mettre la sonde à zéro, appuyez sur « Program » et « Clear ». Pour passer du mode de configuration au mode de fonctionnement, appuyez sur « Fonction » (pour l’affichage « MH ») ou « MAX ».</td></tr><tr><td>Support en maille + chambres PMMA IITC</td><td></td><td>410</td><td>Placez-le sur un plan de travail stable ou un chariot à quatre roues afin d’accéder à tous les côtés.</td></tr><tr><td>Embouts rigides électroniques von Frey uniquement, gamme 90 g</td><td>IITC</td><td>2390</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

mesure des changements de sensibilité tactile dans la patte postérieure de souris à l’aide d’un appareil électronique de von frey

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

La mesure des changements induits par l’inflammation dans les seuils de retrait de la patte arrière sous l’effet de la pression mécanique est une technique utile pour évaluer les changements dans la perception de la douleur chez les rongeurs. Les seuils de sevrage peuvent être mesurés d’abord au départ, puis après l’apparition d’un médicament, d’un venin, d’une blessure, d’un allergène ou d’une autre inflammation évoquée en appliquant une force précise sur des zones très spécifiques de la peau. Un appareil électronique de von Frey permet d’évaluer avec précision les seuils de retrait de la patte arrière de la souris qui ne sont pas limités par la taille des filaments disponibles, contrairement aux mesures classiques de von Frey. La facilité et la rapidité des mesures permettent d’intégrer l’évaluation des résultats de la sensibilité tactile dans divers modèles de douleur inflammatoire et neuropathique d’apparition rapide, car plusieurs mesures peuvent être prises dans un court laps de temps. Les mesures expérimentales pour des rongeurs individuels peuvent être contrôlées en interne par rapport aux réponses de base individuelles et des critères d’exclusion facilement établis pour normaliser les réponses de base au sein des groupes expérimentaux et entre eux. Ainsi, les mesures à l’aide d’un appareil électronique de von Frey représentent une modification utile des tests classiques bien établis à base de filaments de von Frey pour l’allodynie mécanique des rongeurs qui peuvent également être appliqués à d’autres modèles de mammifères non humains.

L'administration locale du venin de B. jararaca provoque des modifications de la sensibilité tactile de la patte postérieure et un œdème tissulaire chez les souris mâles ND4 Swiss.
1,5 heure après l'administration de 5 µg/kg de venin de B. jararaca, des souris mâles ND4 Swiss retiraient leurs pattes postérieures à une pression inférieure de 3,0 g par rapport à la valeur de base (Figure 1A). La réponse de retrait de base pour tous les groupes se produisait à environ 4,5 g de pression appliquée ; après traitement au venin, les souris expérimentales retiraient leurs pattes postérieures à une pression de 1 à 1,5 g (données non montrées). Les souris contrôles traitées au sérum physiologique présentaient une réduction minime, voire nulle, de leur réponse à la pression par rapport à la valeur de base à tous les points temporels testés. Les seuils de réponse diminués chez les souris traitées étaient clairement maintenus à 3 et 6 heures après l'envenimation (Figure 1A) et devenaient indistinguables de ceux des témoins à 24 heures (données non montrées). Les pattes postérieures des souris envenimées présentaient un œdème tissulaire caractéristique de l'inflammation. À 1,5 heure après l'administration du venin, les pattes postérieures traitées, mesurées comme décrit précédemment10, étaient 1,5 mm plus épaisses qu'au départ ; l'œdème persistait à 3 et 6 heures (Figure 1B). En revanche, les pattes traitées au sérum physiologique ne présentaient aucun gonflement ni changement d'épaisseur durant toute la période expérimentale. Pour l'expérience représentative présentée ici, un total de 21 souris a été utilisé pour les mesures de base et 14 ont été sélectionnées pour être incluses dans l'expérience. Elles ont été réparties en groupes de traitement de sorte que les réponses moyennes de retrait au départ soient d'environ 4,5 g pour chaque groupe pris dans son ensemble.
Les modifications induites par le venin de B. jararaca dans la sensibilité tactile s'accompagnent d'une dégranulation des mastocytes et d'un afflux de neutrophiles dans les pattes postérieures de souris mâles ND4 Swiss.
Outre une sensibilité tactile accrue et un œdème tissulaire, nous avons également évalué l'afflux de neutrophiles (Figures 2A-B) et la dégranulation des mastocytes (Figures 2C-D) dans les pattes postérieures de souris inoculées avec du venin par rapport à celles traitées par solution saline. Les neutrophiles sont les premières cellules inflammatoires recrutées depuis la circulation vers une lésion et sont connus pour médier les réponses inflammatoires nociceptives10,16,17. Les mastocytes sont des cellules sentinelles résidentes dans les tissus18, et leur dégranulation a été associée à des réponses nociceptives dans la patte postérieure de la souris10 ainsi que dans la dure-mère du rat19.
Ici, nous avons constaté que l'afflux de neutrophiles dans les pattes postérieures inoculées avec du venin était augmenté d'environ 1 000 fois par rapport aux pattes postérieures traitées au sérum physiologique (Figure 3A), évalué par comptage de coupes tissulaires plantaires sagittales incluses en paraffine de 4 µm, colorées à l'hématoxyline-éosine10, prélevées 1,5 heure après l'administration du venin chez des souris euthanasiées.
Dans les pattes traitées au sérum physiologique, les mastocytes plantaires du tissu de la patte postérieure étaient largement intacts ou présentaient une dégranulation légère (Figure 3B). En revanche, les pattes postérieures inoculées avec du venin montraient 15 à 20 % de dégranulation modérée et étendue des mastocytes (Figure 3B). Les coupes tissulaires décrites ci-dessus ont été colorées au bleu de toluidine, et le nombre de granules visibles a été compté par mastocyte observé afin de déterminer l'état de dégranulation, comme décrit précédemment10.
<img alt="B. jararaca venom effect graphs: A) Mechanical threshold, B) Paw width over time. Statistical data.
" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1. Local B. jararaca l'administration de venin provoque des modifications de la sensibilité mécanique de la patte postérieure et un œdème tissulaire chez des souris mâles ND4 de souche suisse. Les seuils de retrait de base et la largeur de la patte de base ont été évalués respectivement 48 et 24 heures avant l'injection intra-plantaire. B. jararaca venin (Bjv ; 45 µg/kg) ou traitement par le véhicule (soluté salin) (10 µl). Les seuils de retrait ont été évalués à 1,5, 3 et 6 heures après le traitement (A). Alargeur moyenne de la patte (largeur moyenne de la patte gauche et droite d'une souris) au niveau de la région médio-plantaire a été évalué à l'aide d'un pied à coulisse numérique au moment du départ, puis 1,5, 3 et 6 heures après le traitement, afin de déterminer l'œdème tissulaire comme décrit précédemment10 (B). Les significations sont comparées aux souris traitées au Sal (* = p &lt; 0,05, ** = p &lt; 0,01, *** = p &lt; 0,001 respectivement). n = 10-11 souris par groupe de traitement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle</a>.
<img alt="Histological comparison of saline and B. jararaca effects, under 400x and 1000x magnification." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2. B. jararaca la sensibilité mécanique induite par le venin s'accompagne d'une dégranulation des mastocytes et d'un afflux de neutrophiles dans les pattes postérieures de souris mâles ND4 de souche suisse. 3 souris par traitement ont été euthanasiées au CO2 1,5 h après le traitement et leurs pattes postérieures ont été excisées, conservées dans du formol à 10 % pendant 24 heures, transférées dans de l'éthanol à 70 %, décalcifiées pendant 1 à 2 semaines dans du EDTA à 15 %, puis incluses dans la paraffine. 4 µm des coupes sagittales ont été colorées à l'hématoxyline-éosine (A-B) et bleu de toluidine (C-D) pour la visualisation des neutrophiles (A-B) et mastocytes (C-D), respectivement. Les images ont été acquises à 400X et 1 000X, comme indiqué. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour visualiser l'image en taille agrandie</a>. 
<img alt="Neutrophils and degranulation by B. jararaca venom; bar graph; venom impact analysis." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. B. jararaca La sensibilité mécanique induite par le venin s'accompagne d'augmentations significatives des taux de dégranulation des mastocytes et de l'afflux de neutrophiles dans les pattes postérieures de souris mâles ND4 Swiss. Les neutrophiles et les mastocytes présents sur les coupes tissulaires colorées ont été dénombrés à l'aide d'un microscope Olympus CX21LED. Les neutrophiles ont été comptés dans 3 pattes postérieures par traitement, de la région du talon jusqu'aux orteils, sur des champs adjacents observés à un grossissement de 400X. (A). Les mastocytes ont été comptés dans 3 coussinets plantaires par traitement et leur état de dégranulation a été évalué en fonction du nombre de granules visibles à l'extérieur de la limite cellulaire : intact (0), léger (0-10), modéré (10-20), important (21+), comme décrit précédemment.10 (B).  Pour éviter de compter deux fois les mêmes cellules, les investigateurs évaluant le nombre de neutrophiles et le degré de dégranulation des mastocytes dans les sections de la patte postérieure ont utilisé une grille inscrite dans le réticule de l'oculaire. Les investigateurs étaient aveugles quant au traitement.s. Les significations sont comparées aux souris traitées au Sal (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001). &lt; 0,05, ** = p &lt; 0,01, *** = p &lt; 0,001 respectivement). n = 3 souris par groupe de traitement.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour visualiser l'image en taille agrandie</a>.

Les mesures électroniques de von Frey constituent une alternative efficace et améliorée aux filaments de von Frey classiques, car elles permettent de mesurer rapidement et précisément les changements des seuils de retrait mécanique des rongeurs aux stimuli de pression appliqués en continu avant et après un événement inflammatoire.

Mesure des changements de sensibilité tactile dans la patte postérieure de souris à l’aide d’un appareil électronique de von Frey

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer l'absence de réponses de sensibilité à la pression mécanique sur la patte arrière de souris. Pour ce faire, les animaux sont d'abord placés sur un plancher en treillis métallique et laissés s'habituer jusqu'à ce qu'ils soient prêts. Une pointe en polypropylène est appliquée sur la face inférieure de la patte arrière, et la pression est progressivement augmentée.Lorsque la réponse comportementale appropriée est observée, le stimulus est retiré. Une fois les valeurs de base recueillies, les animaux reçoivent une intervention expérimentale avant de subir d'autres tests. En fin de compte, les variations des seuils de retrait de la patte postérieure sont comparées entre les groupes de traitement afin de déterminer l'effet d'un traitement particulier sur les modifications de la sensibilité tactile à la pression.La douleur est un élément cardinal de l'inflammation. Il est important de mesurer et de caractériser la douleur dans différents contextes. Cette méthode relativement simple d'évaluation de la douleur peut être appliquée à de nombreux modèles d'inflammation différents.La procédure sera démontrée par Tiana ov, une technicienne de recherche de mon laboratoire, Madison Mack, qui a participé à ce travail en tant qu'étudiante de premier cycle, et Akila Sykes, actuellement étudiante de premier cycle dans mon laboratoire. Nous commençons par installer l'appareil d'essai afin d'avoir un accès facile aux pattes postérieures.Placer chaque chambre individuellement sur un plancher en treillis. Le plancher en treillis doit être à une hauteur confortable et posé sur une surface stable. Ensuite, placer l'appareil électronique de Von Frey sur le plan de travail.Veillez à ce que la sonde et le câble soient correctement connectés à l'unité d'affichage, puis allumez l'appareil en mode configuration. Réglez l'affichage sur zéro et placez délicatement la masse témoin fournie sur le cône de la sonde Von Frey. Notez la valeur affichée et répétez cette procédure à la fin des tests. S'il existe un écart entre les deux valeurs, l'appareil pourrait nécessiter un recalibrage.Sélectionnez une pointe en polypropylène de la taille appropriée pour le tissu à tester. Les pointes rigides conviennent bien aux tissus plus résistants et moins sensibles, comme ceux de la patte postérieure. Fixez délicatement la pointe sur le cône de la sonde.Passer ensuite du mode de configuration au mode de fonctionnement. Cela affichera la pression maximale appliquée lorsque la sonde est rétractée. Deux investigateurs sont nécessaires pour mesurer les seuils de retrait de la patte postérieure.Une personne doit manipuler l'appareil et effectuer les mesures, tandis qu'une autre doit enregistrer ces mesures afin de réduire les biais. L'investigateur manipulant l'anesthesi TER doit être aveugle aux traitements ainsi qu'aux valeurs enregistrées du seuil de retrait. En outre, afin d'assurer une cohérence entre les mesures, la même personne doit enregistrer toutes les valeurs de seuil de base et de seuil de retrait.48 heures avant le traitement, le premier ensemble de mesures de base est enregistré. Placer un matériau absorbant sous le support pour recueillir les déchets excrétés. Après avoir fixé la pointe et mis à zéro la sonde, l'expérimentateur qui enregistre les mesures doit placer les souris dans des chambres individuelles.Couvrez les chambres avec des couvercles perforés et placez un objet lourd par-dessus. Pour empêcher les souris de s'échapper, laissez-les s'acclimater à la chambre pendant 15 minutes avant de poursuivre. En général, les personnes novices dans cette technique éprouvent des difficultés à appliquer progressivement une pression accrue et à établir une cohérence interne avec leurs propres mesures ; la pratique est donc essentielle pour obtenir des résultats reproductibles.Lorsque vous êtes prêt, utilisez les deux mains pour soulever lentement la sonde et stimuler la plante du pied de la patte postérieure gauche ou droite. Augmentez progressivement la pression jusqu'à l'observation d'un comportement nociceptif. Ceux-ci se manifestent par un retrait de la patte postérieure, un léchage de la patte postérieure ou un saut de la patte.Demander à l'autre chercheur d'enregistrer la pression ayant provoqué le comportement observé. Pendant la mesure, il peut être utile d'encourager la souris à rester immobile en plaçant une friandise juste à l'extérieur de la chambre ou en produisant un léger bruit, comme une tape douce, avant de prendre la mesure. Passer à la souris suivante jusqu'à ce que chacune ait été testée une fois, puis répéter cette procédure quatre fois supplémentaires.Après avoir recueilli cinq valeurs de base, calculez une moyenne pour chaque souris. Répétez les mesures de base 24 heures plus tard et utilisez ces valeurs pour calculer une autre moyenne. Afin de garantir que toutes les souris présentent des réponses de base cohérentes, excluez les animaux dont la seuil moyen de retrait est inférieur à 3,5 grammes ou dont les seuils de base diffèrent de deux grammes ou plus.Enfin, répartir les souris en groupes de traitement distincts de manière à ce que la moyenne des seuils de retrait de base de chaque groupe soit aussi similaire que possible. Ici, les seuils de retrait ont été mesurés après l'administration du venin dans la patte postérieure, ROS raca. Le groupe témoin traité au sérum physiologique a montré peu de changement par rapport à la ligne de base à tous les temps.Les réponses nociceptives aux points testés chez les souris traitées ont été clairement maintenues jusqu'à six heures. En outre, un œdème tissulaire, caractéristique de l'inflammation, était évident dans les pattes arrière traitées au venin, mais pas dans celles traitées au sérum physiologique. Les modifications induites par le venin dans la sensibilité tactile étaient accompagnées d'un afflux de neutrophiles d'environ 1000 fois supérieur.Par rapport aux coussinets postérieurs traités au sérum physiologique, les mastocytes plantaires dans le tissu du coussinet postérieur étaient largement intacts ou présentaient une dégranulation légère. En revanche, chez les animaux accouplés, on observait une dégranulation modérée à importante des mastocytes chez 15 à 20 % des coussinets postérieurs. Cette technique peut être adaptée pour évaluer la sensibilité mécanique ou tactile dans une grande variété de tissus autres que le coussinet postérieur.Par conséquent, cette technique peut être intégrée à de nombreux modèles différents de rongeurs d'inflammation et de douleur.

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Mesurer les changements de sensibilité tactile dans la patte postérieure des souris à l'aide d'un appareil électronique von Frey

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Mesure des changements de sensibilité tactile dans la patte postérieure de souris à l’aide d’un appareil électronique de von Frey (Vidéo) | JoVE Journal

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