Super-résolution d'imagerie de l'Anneau Z cytokinétique en utilisant des bactéries vivantes 3D structuré rapide Illumination Microscopy (F3d-SIM)

L’objectif global de cette procédure est d’observer les changements dynamiques de la protéine FTSZ pendant la division cellulaire chez les bactéries. Ceci est accompli en appliquant des cellules subtiles de bacille exprimant la fusion FTS dite GFP à la surface d’un petit coussinet aros. Le tampon est ensuite inversé et transféré dans une boîte de Pétri avec un couvercle en verre.

La deuxième étape consiste à acquérir des images en accéléré de la bactérie pendant la division cellulaire à l’aide d’une microscopie à éclairage structuré 3D ou d’un système d’imagerie SIM 3D. Ensuite, la qualité des données brutes est évaluée et les images présentant une diminution d’intensité supérieure à 30 % due au photoblanchiment sont éliminées. La dernière étape consiste à analyser quantitativement les changements dans la localisation de la protéine au cours de la division cellulaire en mesurant la distribution de l’intensité de fluorescence de la protéine F-T-S-Z-G-F-P au fil du temps.

En fin de compte, la carte SIM 3D rapide est utilisée pour montrer à quel point les protéines dione sont dynamiques lors de la division cellulaire chez les bactéries. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes comme la microscopie confocale est que nous obtenons des informations tridimensionnelles sur les changements qui se produisent dans la division cellulaire des cellules vivantes. Bien que cette méthode donne un aperçu de la cytokinèse bactérienne, elle pourrait également être appliquée à d’autres systèmes où nous voulons examiner les changements protéiques dynamiques, tels que les cellules de mammifères M.

Nous avons eu l’idée pour la première fois lorsque nous avons vu des images sim 3D traditionnelles de cellules bactériennes fixes montrer que la protéine FDZ n’était pas distribuée de manière homogène autour de l’anneau zed. Nous voulions examiner plus en détail si cette distribution était liée aux changements qui se sont produits pendant la constriction de l’anneau de Zed. En général, les personnes qui débutent dans cette technique auront des difficultés en raison de l’incapacité à faire correspondre l’indice de réfraction de leur huile à leur échantillon, ce qui conduira à des images de mauvaise qualité.

Pour préparer les cellules du bacille les plus subtiles pour l’imagerie, faites croître les cellules jusqu’au milieu de la phase exponentielle, comme détaillé dans le protocole de texte. Ensuite, fixez un cadre adhésif sur une lame de microscope en verre standard en retirant d’abord la fine feuille de polyester. Appliquez ensuite la surface adhésive exposée du cadre sur la surface de la lame de microscope pour créer efficacement un puits carré sur le dessus de la lame, laissez la feuille de polyester épaisse fixée au cadre pour éviter que la lamelle ne colle dans les étapes suivantes.

Ensuite, faites fondre une solution d’aro au micro-ondes jusqu’à ébullition de la pipette 67 microlitres d’aros fondus dans le cadre adhésif. Placez immédiatement une lamelle sur le dessus de l’aros pour créer une surface plane et laissez à température ambiante pendant cinq à 10 minutes. Retirez la lamelle pendant une à deux minutes pendant que l’échantillon est récolté.

Récoltez une aliquote d’un millilitre de l’échantillon après centrifugation à 8 000 tr/min pour les secondes décantez le surnageant, remettez en suspension la pastille dans 200 microlitres de milieu frais. Prélever 2,5 microlitres de l’échantillon concentré et pipeter sur le tampon aros pré-préparé. Répartissez l’échantillon uniformément le long de la surface plane du tampon aros.

Retirez ensuite le cadre adhésif de la lame de microscope à l’aide d’une pince à épiler sans toucher le tampon aros. Transférez le tampon aros du microscope. Glissez-le vers une boîte de Pétri de 35 millimètres de diamètre avec un couvercle en verre.

Pour l’imagerie haute résolution. Inversez le coussin aros de manière à ce que la suspension de la cellule soit en contact avec la lamelle de la boîte de Pétri. Le jour de l’expérience, allumez le système d’imagerie SIM 3D OMX au moins une heure avant l’imagerie pour permettre au système et aux lasers de se stabiliser complètement.

Allumez ensuite les différents composants répertoriés dans le protocole texte sur le poste de travail du contrôleur maître. Ouvrez le logiciel OMX en cliquant sur l’icône . Définissez le chemin d’accès au fichier pour l’enregistrement des données dans un dossier de données approprié.

Ensuite, démarrez le logiciel de travail doux. Allumez les lasers nécessaires aux expériences sur l’écran principal dans la section des paramètres de lumière. Activez la caméra FITC à partir de la sélection de canal et procédez à la vérification des paramètres répertoriés dans le protocole texte.

Appliquez une goutte d’huile sur le haut de l’objectif. Placez la boîte de Pétri contenant les cellules préparées dans l’insert de la scène et couvrez avec le couvercle chauffant circulaire. Abaissez la platine jusqu’à ce que l’huile touche le fond de la boîte de Pétri de l’échantillon.

Laissez la parabole chauffer et s’équilibrer pendant 15 minutes Dans la platine à l’aide d’un réglage d’exposition faible, concentrez-vous sur l’échantillon à l’aide des commandes de la platine de positionnement nano. Faites la mise au point de haut en bas sur l’échantillon pour déterminer si la lumière est répartie uniformément au-dessus et en dessous du plan focal de l’échantillon. Utilisez ensuite des pas de 0,5 micron et marquez le haut et le bas de la pile d’images avant de revenir au milieu de l’échantillon dans l’onglet expérience, cliquez sur le bouton obtenir l’épaisseur pour définir l’épaisseur d’acquisition de l’échantillon.

Déterminez la valeur d’intensité maximale de l’image de l’échantillon avec l’exposition actuelle et le pourcentage de lumière transmise. Cette valeur se trouve sous la fenêtre de l’image. Pour l’imagerie en accéléré, ajustez l’exposition et le pourcentage de lumière transmise pour obtenir une intensité maximale de 1100 à 1400.

Ci-dessus le contexte. Pour l’image, activez la section time lapse dans l’onglet expérience. Définissez la fréquence d’images requise et le temps total dans le fichier de données.

Entrez un nom de fichier approprié. Cliquez sur le bouton Exécuter pour commencer l’acquisition d’image au début de l’acquisition d’image. Notez la valeur d’intensité maximale de l’image au début de l’acquisition de l’image pour la première image de la série chronologique.

À la fin de l’acquisition de la première trame, vérifiez qu’il n’y a pas eu plus de 10 % de diminution de l’intensité du signal via le Zack pour cette première trame. À la fin de l’acquisition de la série chronologique, ouvrez le fichier d’image brute résultant avec un suffixe DV et déterminez la diminution de l’intensité maximale du signal entre le début de la série chronologique et l’image finale. Supprimez tous les points temporels où il y a eu plus de 30 % de blanchiment des photos dans le menu du processus, activez la fenêtre de reconstruction SI.

Utilisez les paramètres préexistants pour tous les paramètres. Activez le bouton OTF spécifique au canal utilisé et réglez-le sur le jeu de filtres standard. Activez le bouton d’angles KO spécifiques au canal utilisé et réglez-le sur le jeu de filtres standard.

Faites glisser et déposez le fichier brut dans l’espace du fichier d’entrée. Cliquez sur Faire. Examinez la distribution de FTSZ autour de l’anneau Z pour créer des graphiques d’intensité 3D.

Ouvrez ensuite un fichier image 3D. Pour afficher les tranches z individuelles. Utilisez l’outil de visualisation du volume situé sous l’onglet du menu Affichage.

Pour recadrer une région d’intérêt, entrez le numéro de fenêtre de cette image 3D dans la fenêtre de saisie et entrez un nouveau numéro de fenêtre inutilisé dans la fenêtre de sortie. Le bouton de sélection de région devient disponible pour recadrer un anneau Z individuel d’intérêt à partir du champ de vision d’origine de 40 x 40 microns. Ajustez l’axe et le degré de rotation souhaités dans l’onglet de rotation.

Cliquez sur le bouton Faire. Faites défiler le volume pour obtenir la perspective souhaitée, l’anneau Z. Utilisez l’outil d’inspection des données pour ajuster les dimensions des lignes de colonne afin de créer une nouvelle région d’intérêt autour d’un anneau Z individuel.

Cliquez au centre de l’image pour positionner cette nouvelle région d’intérêt. Les données de l’image de texte sont un tableau généré automatiquement qui affiche l’intensité de fluorescence de chaque pixel dans la région d’intérêt. Cliquez sur le bouton Graphique 3D pour afficher initialement le graphique d’intensité.

Les données de l’image de texte peuvent également être exportées en cliquant sur le bouton Enregistrer les données de la table. Dans le menu Fichier, copiez les données d’image du fichier texte enregistré dans une nouvelle feuille de calcul. Sélectionnez toutes les cellules de la feuille de calcul et créez un nouveau graphique de surface 3D.

Mettez en forme le graphique du tracé d’intensité 3D pour la publication des données time-lapse. Répétez ces étapes sur chacun des différents points temporels du fichier image 3D. Lorsqu’il est visualisé par la microscopie à fluorescence à champ large conventionnelle, l’anneau Z apparaît comme une seule bande transversale de fluorescence dans les subtils du bacille.

L’intensité de fluorescence dans toute cette bande est uniforme. Le modèle de localisation offre peu d’informations sur l’organisation structurelle et la distribution de FTS dits polymères à l’intérieur de l’anneau, ici, les mêmes cellules sont examinées. Utilisation de la méthode de simulation 3D FAST.

La rotation de l’image de la simulation 3D autour de l’axe Z permet de visualiser l’anneau Z en tant que véritable structure d’anneau dans l’espace tridimensionnel. L’amélioration de la résolution permet de visualiser la distribution hétérogène de FTSZ au sein de l’anneau. D’autres exemples d’anneaux Z de Bacillus visualisés par cette technique illustrent comment l’intensité de fluorescence autour de l’anneau Z n’est jamais la même.

De plus, des régions de très faible intensité de fluorescence ou des lacunes sont observées. Pour quantifier ces observations, des graphiques d’intensité 3D ont été créés de l’anneau Z. Les graphiques d’intensité montrent que la quantité de fluorescence peut varier jusqu’à quatre fois dans différentes régions de l’anneau Z le plus subtil du bacille.

Les graphiques d’intensité 3D montrent que les espaces lisent presque les niveaux de base de fluorescence de fond pour analyser les changements dynamiques qui se produisent dans l’anneau Z. Au fil du temps, un time-lapse sim 3D est effectué. Cette vidéo montre comment la FTSZ dans l’anneau Z subtil du bacille change constamment et est mesurée à l’aide d’un graphique d’intensité généré pour chaque image.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver et de préparer des cellules bactériennes, de leur imagerie à l’aide de la simulation 3D, de leur analyse pour obtenir des données quantitatives et, enfin, de la façon de fournir des images de qualité de présentation. Il est très important lors de l’acquisition d’images de surveiller la santé de vos cellules et également de surveiller le niveau d’expression de la protéine fluorescente lors de l’acquisition après son développement. Cette technique a ouvert la voie à d’autres personnes dans le domaine de la biologie cellulaire bactérienne pour utiliser d’autres méthodes de microscopie à super résolution et pour localiser d’autres protéines bactériennes dans différents organismes.

Suite à cette procédure, d’autres formes de microscopie à super résolution pourraient être effectuées, telles que la microscopie de localisation photoactivée pour examiner les changements dynamiques de ladite protéine FDS au fil du temps.