Name: Visualisation des Endosome Dynamics dans Vivre terminaisons nerveuses avec quatre dimensions dimagerie par fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Découvrez l'imagerie 4D des endosomes dans les terminaisons nerveuses vivantes de serpent. Cette méthode permet d'observer en temps réel la fusion et l'exocytose endosomale pour étudier la fonction synaptique.

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Ce travail a été soutenu par les US National Institutes of Health Grant NS-024572 (à RSW).

1. Colorer la préparation de colorants supravital <ol><li> Pour le protocole de dissection des couleuvres voir Stewart et al. 5 et Teng et al. 6 tissus reptile reste physiologique pour des durées plus longues, et à la contamination bactérienne moins, lorsqu&#39;il est conservé à basse température (voir ci-dessous). Un tissu de mammifère est généralement maintenu à la température ambiante ou plus élevée. </li><li> Pour lysosomale vital coloration de colorant, dissoudre le colorant dans reptiles 1:5000 de solution de Ringer froid (0,2 pm). Incuber à 4 ° C pendant 15 min. Lavez plusieurs fois avec Ringer froid. Image dès que possible. </li><li> Pour FM1-43 coloration à l&#39;aide de KCl stimulation, diluer le colorant en haute KCl Ringers 1:500 (7 M). Incuber à 4 ° C pendant 30 à 60 secondes maximum. Laver rapidement trois fois avec Ringer froid, ~ 1 min / rinçage. Image dès que possible. </li><li> Pour FM1-43 coloration utilisant hypertonique (saccharose) stimulation, diluer le colorant dans 0,5 M sonneries de saccharose comme ci-dessus. Incuber à 4 &amp; #176; C pendant 2-5 min. Laver comme à l&#39;étape 1.3 ci-dessus avec Ringer froid. Image dès que possible. </li><li> Pour FM1-43 coloration par stimulation électrique, voir Teng et al. 6 En bref, la préparation est placé un plat contenant du sérum physiologique et le colorant. Le nerf est stimulé par un train préprogrammée de 200 microsecondes impulsions rectangulaires (~ 7 V, 30 Hz, 18 ps). Laver comme à l&#39;étape 1.3 ci-dessus avec Ringer froid. Image dès que possible. </li></ol> 2. Configurez la préparation pour l&#39;imagerie <ol><li> Orienter la préparation de telle sorte que les structures d&#39;intérêt sont aussi proches que possible de l&#39;objectif du microscope. </li><li> Si un microscope inversé est utilisé, utiliser une chambre dont le fond contient une fine lamelle ronde. En règle générale, la chambre de formation d&#39;image doit avoir un fond en acier inoxydable mince avec un diamètre de 25 mm # 1 en verre d&#39;épaisseur lamelle au centre. Si un microscope droit est utilisée, une lamelle de fond n&#39;est pas nécessaire mais elle est utilepour permettre l&#39;imagerie de la lumière transmise (par exemple de contraste d&#39;interférence différentiel, DIC) pour orienter l&#39;échantillon et de localiser des objets d&#39;intérêt. </li><li> Choisissez un objectif approprié pour obtenir la résolution la plus élevée possible 3D. Il ya des compromis entre ouverture numérique (NA), la distance de travail, agrandissement, et le type de lentille (sec, immersion dans l&#39;huile à l&#39;eau et). Pour les préparations minces comme des cultures de tissus, les objectifs de pétrole sont les meilleurs. En utilisant un microscope droit, flotter une lamelle sur le bain aqueux, et utiliser de l&#39;huile d&#39;immersion entre le sommet de la lamelle et l&#39;objectif. </li><li> Si le logiciel de déconvolution est utilisé, le vendeur peut fournir des fonctions d&#39;étalement de point prédéterminé (PSF) de certains objectifs. Si cette information n&#39;est pas disponible, ou si un objectif pris en charge est choisie, déterminer la PSF par imagerie micro-pointes fluorescentes ou des objets de diffraction limitée similaires 7,8. </li></ol> 3. Établir la profondeur de champ désirée et le nombre de Images souhaités par Time-lapse cadre <ol><li> Sélectionnez la profondeur totale du champ de sorte que le déplacement ou l&#39;interaction des structures d&#39;intérêt ne disparaissent pas ou sortir de concentration qui se déplacent dans la direction z. Le champ de z doit légèrement dépasser la dimension verticale de la procédure de cellule ou cellule étant imagée. Pour les bornes du moteur vertébrés, 15-20 um est typique. </li><li> Calculer le pas de l&#39;axe z nécessaire pour chaque incrément de mise au point. Résolution le long de l&#39;axe des z varie en fonction des propriétés de l&#39;objectif; il est d&#39;environ un quart de la résolution du plan xy. Si l&#39;imagerie confocale ou un logiciel de déconvolution est utilisé, la résolution de l&#39;axe z est améliorée. Améliorer la résolution finale par suréchantillonnage délibéré dans la direction z 5, mais aussi voir l&#39;étape 3.3 ci-dessous. Un intervalle typique de l&#39;étape est dans la plage de 400-1,500 nm pour les objectifs de 40 100X. La lumière doit être coffré off entre chaque image z-étape. </li><li> Sélectionnez le nombre d&#39;images par z-pile, à savoir la profondeur de champ souhaitée diviséepar l&#39;intervalle de l&#39;étape. Temps requis pour remplir un z-stack typique est de 1-10 sec. Objets se déplaçant rapidement (100 nm / s) peuvent apparaître floue dans une pile d&#39;images 3D car chaque plan image correspond à un point de temps légèrement différente. En outre, chaque image supplémentaire contribue à photoblanchiment et de phototoxicité possible (voir Discussion). Si les deux cas concerne, choisir un z-étape plus grande pour recueillir moins d&#39;images par pile. Compenser plus tard en utilisant un logiciel d&#39;interpolation d&#39;image (étape 6.3 ci-dessous). </li></ol> 4. Sélectionnez le Frame Rate Time-lapse Choisissez par l&#39;expérimentation un taux qui est juste suffisant pour résoudre en douceur les changements avec le temps comme le mouvement, les interactions ou les événements de fusion 9. Sous échantillonnage peut produire des artefacts de mouvement (erreurs d&#39;échantillonnage), tandis que le suréchantillonnage augmente inutilement l&#39;exposition à la lumière. Collecte, soit une longue séquence unique ou plusieurs séquences répétées de la même préparation, chacun avec un relativement faible intervalle de temps totale ( <em&gt; par exemple 10 points de temps x 30 sec d&#39;intervalle = 5 min). Si possible, voir la préparation avec un éclairage à épifluorescence continue à estimer grossièrement les vitesses de déplacement, y compris la dérive de l&#39;ensemble de la préparation si elle est présente. 5. Remplissez tous Imaging Live pour une préparation particulière Préparations reptiles restent généralement robuste pour ~ 1-2 heures, plus si on le refroidit. 6. Analyser les données après utilisation désiré <ol><li> Conservez tous les fichiers de données brutes. Tandis que le stockage numérique n&#39;est généralement pas un problème, le temps de traitement est important, même avec des ordinateurs ou postes de travail personnels rapides. Pour cette raison, les images des cultures dans une région d&#39;intérêt [ROI]. Assurez-vous que l&#39;ensemble de la région d&#39;intérêt est dans la fenêtre recadrée au cours du temps ensemble. </li><li> Deconvolve piles d&#39;images en utilisant la fonction correcte propagation point un logiciel approprié et. Assurez-vous que la résolution est améliorée et qu&#39;aucun artefact a été générée par lealgorithme de déconvolution. Figure 3 montre des exemples d&#39;images. </li><li> Utiliser un algorithme d&#39;interpolation d&#39;étendre la résolution apparente de l&#39;axe z. Une expansion 6X à partir d&#39;un plan réel séparation d&#39;image de 1,5 um à une apparente 0,25 um séparation est suggéré. Vous pouvez également utiliser une combinaison de suréchantillonnage (étape 3.2) et l&#39;interpolation. </li><li> Effectuer le contraste, la luminosité, le filtrage de bruit, photoblanchiment et autres ajustements typiques de traitement d&#39;image, si désiré. normes de manipulation de l&#39;image dictent que pour la plupart des travaux scientifiques, il convient que les mêmes corrections être appliquées à toutes les images, à la fois dans une pile et à différents moments. La conséquence d&#39;un réglage particulier devrait être évaluée chez toutes les images 9. </li><li> Sélectionnez un mode d&#39;affichage particulier pour l&#39;exportation de données. L&#39;affichage est plus simple vidéo stéréo en utilisant soit des anaglyphes rouge-vert ou rouge-bleu (exemples de la figure 3), des paires stéréo, ou en alternance gauche / droit œil cadres avec des lunettes à obturateur. Anaglyphes sont limités à une seule couleur. Améliorer la profondeur apparente de l&#39;image si l&#39;on souhaite améliorer la résolution visuelle de l&#39;axe z. </li><li> Expérimenter diverses techniques d&#39;amélioration de filtrage et de l&#39;image. Par exemple, le filtrage de Laplace est utile pour augmenter le contraste des petites structures ci-dessus fond. La luminosité des pixels au centre de la fenêtre courante est améliorée tandis que la luminosité des zones environnantes est réduite. Notez que certaines méthodes de filtrage ne fonctionnent pas bien en combinaison. </li><li> Appliquer la correction de dérive si il ya un mouvement important de la préparation au fil du temps. Un tel mouvement est commun dans la vie muscle, même avec des médicaments ajoutés à supprimer des potentiels d&#39;action et potentiels synaptiques. Un algorithme d&#39;enregistrement de pixels (par exemple. D&#39;Imaris, Adobe After Effects, le plugin pour ImageJ TurboReg) aligne les images en accéléré et peut réduire, mais généralement pas éliminer complètement, telle motion. </li></ol>

<ol><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy-tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy-tips and tools.</a> J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+method+for+measuring+phototoxicity+of+a+live+cell+imaging+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope.</a> Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).</li>
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<li>Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroendocytosis+and+endosome+processing+in+snake+motor+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons.</a> J. Physiol. 582, 243-262 (2007).</li>
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<li>Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+near+active+zones+in+snake+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals.</a> J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).</li>
<li>Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+active+zones%3A+hot+spots+for+endocytosis+in+vertebrate+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals.</a> J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).</li>
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<li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+C.+elegans+embryos+using+an+epifluorescent+microscope+and+open+source+software%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

L&#39;aspect le plus critique de l&#39;imagerie 4D est la gestion de la durée et de l&#39;intensité de l&#39;exposition de la lumière. Photoblanchiment d&#39;image diminue le rapport signal-sur-bruit et peut être problématique ou non en fonction de divers facteurs, y compris le choix des fluorophores. Non spécifique des dommages aux tissus vivants (de phototoxicité) est liée au photoblanchiment, et peut parfois être identifiée en utilisant des sondes fluorescentes conçus à cet effet ou 2,12 par examen de la m...

Imagerie time-lapse de tissu vivant offre un accès visuel à dynamiques des relations structure-fonction qui ne peut être apprécié dans les préparations fixes ou vivant imagées en un seul point dans le temps. Souvent, cependant, l&#39;arbitrage pour l&#39;accès à l&#39;information temporelle est une diminution de la résolution optique. Ouverture numérique des objectifs élevés huile d&#39;immersion ne sont pas pratiques dans les tissus vivants en raison de leur gamme étroite de mise au point, laissant immersion dans l&#39;eau ou les objectifs secs comme les seules alternatives. En outre, la résolution accrue offerte par l&#39;optique confocale ne peut pas être utilisée dans certaines préparations de vie en raison de la phototoxicité des niveaux relativement élevés d&#39;éclairement requis de 1,2. Enfin, alors que plusieurs techniques optiques en temps réel ou en accéléré sont disponibles qui offrent résolution améliorée, leur applicabilité est limitée aux préparations où les structures d&#39;intérêt peuvent être positionnés à quelques centaines de nanomètres de l&#39;objectif 1. La méthode décriterend l&#39;utilisation de l&#39;équipement relativement peu coûteux, est polyvalent, tout en offrant une meilleure résolution par rapport aux techniques time-lapse plus couramment utilisés. Il est destiné à être utilisé dans les laboratoires individuels ainsi que des installations d&#39;imagerie. Le procédé utilise la microscopie à épifluorescence classique, combiné avec un appareil photo numérique sensible et avec du matériel destiné à acquérir rapidement des ensembles d&#39;images légèrement différentes plans focaux (z-piles). Chaque z-stack est numériquement deconvolved pour augmenter la résolution. Une caractéristique de la 3D time-lapse (4D) imagerie est suivi précis des organites ou d&#39;autres structures en mouvement. Lorsqu&#39;il est correctement mis en place, les structures imagées ne sortent pas de mise au point, et le mouvement dans les trois directions peuvent être observés et quantifiés. Ainsi, il est impossible pour une structure teinté à disparaître sur un ou plusieurs cadres time-lapse seulement par la dérive au-dessus ou en dessous d&#39;un plan focal étroit. La méthode est aussi un outil sensible pour évaluer les interactions et possible fusion de petites structures. Épifluorescence classique ou images confocales de structures proches de la limite de diffraction (quelques centaines de nm) ne confirment pas la fusion même si les images fusionnées montrent chevauchement de leurs étiquettes respectives 3. Fusion est suggéré, mais il reste possible que les objets sont séparés horizontalement et verticalement par une distance qui est inférieure à la limite de diffraction. Trois ou à quatre dimensions imagerie, en revanche, permet la visualisation des objets dans chacune des trois directions orthogonales. L&#39;apparition de la fusion dans les trois vues augmente le niveau de sécurité. Et, dans certaines préparations de vie, la direction ou le mouvement brownien des objets présumément fusionnés fournit une preuve supplémentaire lorsque les deux étiquettes se déplacent ensemble dans le temps. Bien sûr, quand près de la limite de diffraction du niveau de certitude dans les structures les plus exigeants de fond, ou montrant qu&#39;ils contiennent deux colorants (fusion), n&#39;est pas absolue. Le cas échéant, des techniques spécialisées, telles que le transfert d&#39;énergie par résonance de fluorescence (FRET)4, sont plus appropriées.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SGC5</td><td>Biotium, Hayward, CA</td><td>70057</td><td>Cône final : 10 mM</td></tr><tr><td>FM1-43FX</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>F35335</td><td>Cône final : 7 mM</td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>L7528</td><td>Cône final : 0,2 mM</td></tr><tr><td>Anneaux reptiliens pH 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>2,5 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3,6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1,8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (dibasique)</td><td></td><td></td><td>1,0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5,0 mM</td></tr><tr><td>élevé KCl Reptilien Ringers pH 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>86 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>60 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3,6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1,8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1,0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5,0 mM</td></tr><tr><td>Sonneries à haute teneur en saccharose pH 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>2,5 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3,6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1,8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (dibasique)</td><td></td><td></td><td>1,0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5,0 mM</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td></td><td>0,5 M (17,1 g/50 ml)</td></tr><tr><td>Axioplan 200 microscope inversé</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr><tr><td>N-Achroplan 63X objectif à eau ; n.a.=0,9 ; Distance de travail=2,4 mm&nbsp ;</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr><tr><td>DG4 commutateur à roue à filtres à excitation</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>Lampe à arc au xénon 175W</td><td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td></tr><tr><td>Lambda 10-2&nbsp ; commutateur à roue à filtres d’émission</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td></td><td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td></tr><tr><td>Caméra CCD Sensicam</td><td>Cooke Instruments, Tonawanda, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com</a></td></tr><tr><td>Caméra CCD Cascade 512</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td></td><<td>a href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com</a></td></tr><tr><td>Boîtes d’imagerie - faites maison - 11 cm de diamètre ; lamelle de protection #1 de 25 mm de diamètre encastrée ; broches magnétiques</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO</td><td>Deconvolution ; Correction de la dérive ; Présentation des données 3D et 4D</td><td><a href="http://www.intelligent-imaging.com/">www.intelligent-imaging.com</a></td></tr><tr><td>IMARIS 7.5.2</td><td>Bitplane, South Windsor, CT</td><td>Correction de la dérive ; présentation des données 3D et</td> <td>4D<a href="http://www.bitplane.com/">www.bitplane.com</a></td></tr><tr><td>AfterEffects CS6</td><td>Adobe, San Jose, CA</td><td>Correction</td> <td>de la dérive<a href="http://www.adobe.com/">www.adobe.com</a></td></tr><tr><td>ImageJ 1.46</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td>Plusieurs plugins disponibles ; Construction</td> d’une paire stéréo <td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>Zeiss LSM</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td> Construction d’une <td>paire stéréo</td> <td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr></tbody></table>

visualisation des endosome dynamics dans vivre terminaisons nerveuses avec quatre dimensions d&#39;imagerie par fluorescence

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Quatre dimensions (4D) Imagerie de la lumière a été utilisé pour étudier le comportement des petites structures au sein terminaisons nerveuses motrices de la transverse de l&#39;abdomen mince muscle de la couleuvre rayée. Les données brutes comprend des séquences de time-lapse de 3D z-piles. Chaque pile contient 4-20 images acquises avec une optique à épifluorescence à plans focaux séparés par 400-1,500 nm. Les étapes de l&#39;acquisition de piles d&#39;images, telles que le réglage de mise au point, la commutation de longueurs d&#39;onde d&#39;excitation, et le fonctionnement de l&#39;appareil photo numérique, sont automatisées autant que possible pour maximiser le taux d&#39;image et de minimiser les dommages aux tissus exposés à la lumière. Après l&#39;acquisition, une série de piles d&#39;images est une déconvolution pour améliorer la résolution spatiale, converties au format 3D désirée, et sert à créer un &quot;film&quot; 4D qui est appropriée pour diverses analyses sur ordinateur, en fonction des données expérimentales recherchées. Une application est l&#39;étude du comportement dynamique de deux classes de endosomes trouvés dans nerveuses bornes-macroendosomes (ME)et endosomes acides (EI)-dont la taille (200-800 nm pour les deux types) sont à ou près de la limite de diffraction. Accès à l&#39;information 3D à chaque point de temps offre plusieurs avantages par rapport à l&#39;imagerie time-lapse classique. En particulier, la taille et la vitesse de déplacement de structures peuvent être quantifiés dans le temps sans perte de netteté. Des exemples de données de l&#39;imagerie 4D montrent que les ME se rapprochent de la membrane plasmique et disparaissent, ce qui suggère qu&#39;ils sont exocytosed plutôt que de déplacer simplement verticalement à une distance à partir d&#39;un seul et même plan de mise au point. Est également révélé fusion putatif de ME et EI, par visualisation de chevauchement entre les deux structures contenant un colorant telles que vues dans chacune des trois projections orthogonales.

Les données présentées sont des terminaux serpent neuromusculaires (voir vues basses et hautes grossissement de la figure 3, le colorant d&#39;endocytose (FM1-43) adoption crée une brume qui remplit chaque bouton) et, en particulier, macroendosomes (ME) et les endosomes acides (EI) à l&#39;intérieur de ces bornes 5. ME sont créés par endocytose vrac au cours de l&#39;activité neuronale 10 et leur nombre diminue de façon exponentielle avec le temps après une activité a cessé 6....

Quatre dimensions (4D) imagerie est utilisée pour étudier le comportement et les interactions entre les deux types de endosomes dans les terminaisons nerveuses vertébrés vivant. Le mouvement de ces petites structures est caractérisé en trois dimensions, ce qui permet la confirmation des événements tels que la fusion des endosomes et l&#39;exocytose.

Visualisation des Endosome Dynamics dans Vivre terminaisons nerveuses avec quatre dimensions d&#39;imagerie par fluorescence

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une imagerie précise des endosomes dans l'espace tridimensionnel au fil du temps, ou en quatre dimensions. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant les muscles de serpent et en disposant le tissu dans la boîte de culture destinée à l'imagerie. La deuxième étape consiste à colorer le tissu avec des colorants vitaux afin de stimuler la formation d'endosomes.Ensuite, le prélèvement est imagé en quatre dimensions pour une ou plusieurs jonctions neuromusculaires. La dernière étape consiste en une analyse minutieuse des données afin de caractériser le comportement des macro-endosomes. En définitive, la présence et le déplacement des endosomes au fil du temps dans l'espace présynaptique peuvent être démontrés par une imagerie de fluorescence en quatre dimensions.L'avantage principal de cette technique est que le muscle abdominal du serpent n'a qu'une épaisseur d'une seule fibre, ce qui permet d'obtenir des images de haute qualité à l'aide d'une microscopie à fluorescence épi-fluorescente standard. Des préparations de tissus provenant du serpent de garter seront utilisées dans ce protocole. Les tissus reptiliens doivent être conserv

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Imagerie par photoactivation par fluorescence du transport des neurofilaments dans les axones de souris myélinisés 

Source : Zhilyakov, N. V. et. al., Enregistrement des transitoires calciques dans la jonction neuromusculaire de souris à haute résolution temporelle à l’aide de la microscopie confocale. J. Vis. Exp. (2021)Cette vidéo démontre la technique d’imagerie permettant d’enregistrer les transitoires calciques rapides au niveau des terminaisons nerveuses à l’aide de la microscopie confocale. En stimulant le nerf et en capturant les changements de fluorescence des colorants liant le calcium, il...

Imagerie des transitoires calciques rapides dans les terminaisons nerveuses de souris à l’aide de la microscopie confocale

Le protocole pour l'imagerie dynamique longitudinale et lésion laser sélectif de terminaisons nerveuses chez des souris transgéniques reporter est présente.

In Vivo microscopie à deux photons de terminaisons nerveuses dans la peau simples

Cet article propose une méthode pour étudier la dynamique des vésicules de neurotransmetteurs dans les cellules de neuroblastome, à l’aide d’une construction synaptobrevin2-pHluorin et de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. La stratégie développée pour le traitement d’images et l’analyse des données est également rapportée.

TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour l&#39;évaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données

L'étude du trafic membranaire est cruciale pour comprendre les fonctions neuronales. Ici, nous introduisons un procédé pour quantifier la motilité des vésicules dans les neurones. C'est une méthode pratique qui peut être adaptée à la quantification du trafic membranaire dans le système nerveux.

Quantification des molécules d&#39;endosome et de lysosome dans les neurones cultivés utilisant des sondes fluorescentes

Ce protocole décrit une nouvelle méthode permettant la visualisation quantitative de la formation d’un complexe de protéines SNARE, basée sur le transfert d’énergie Förster et durée de vie de fluorescence imaging microscopy.

Visualisation de SNARE intracellulaire traite par Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Ce protocole décrit l'analyse des compartiments intracellulaires étiquetés fluorescents dans la levure en herbe utilisant la microscopie confocale 4D multicolore (time-lapse 3D). Les paramètres d'imagerie sont choisis pour capturer des signaux adéquats tout en limitant les dégâts photo. Les plugins Custom ImageJ permettent de suivre et d'analyser quantitativement les structures étiquetées.

Microscopie 4D de levure

Les méthodes actuelles décrivent une approche non ratiométrique pour l’imagerie calcique sous-compartimentale à haute résolution in vivo chez Caenorhabditis elegans à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés facilement disponibles.

Imagerie subcellulaire de la manipulation neuronale du calcium in vivo

L’article décrit l’optimisation des paramètres d’acquisition de la microscopie à fluorescence pour visualiser le transport axonal de cargaisons endogènes marquées à une résolution de neurone unique chez un nématode vivant.

Optimisation de la visualisation du transport axonal de la cargaison endogène par microscopie à fluorescence chez Caenorhabditis elegans vivant

Découvrez l'imagerie 4D des endosomes dans les terminaisons nerveuses vivantes de serpent. Cette méthode permet d'observer en temps réel la fusion et l'exocytose endosomale pour étudier la fonction synaptique.

Visualisation des Endosome Dynamics dans Vivre terminaisons nerveuses avec quatre dimensions d'imagerie par fluorescence

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