Visualisation des Endosome Dynamics dans Vivre terminaisons nerveuses avec quatre dimensions d'imagerie par fluorescence

L’objectif global de cette procédure est d’imager avec précision les endosomes dans un espace tridimensionnel au fil du temps ou en quatre dimensions. Ceci est accompli en disséquant d’abord les muscles du serpent et en disposant le tissu dans la boîte d’imagerie. La deuxième étape consiste à colorer le tissu avec des colorants vitaux pour stimuler la formation d’endosomes.

Ensuite, la préparation est imagée en quatre dimensions pour une ou plusieurs jonctions neuromusculaires. La dernière étape consiste en une analyse minutieuse des données pour caractériser le comportement des macro-endosomes. En fin de compte, la présence et le mouvement des endosomes au fil du temps dans l’espace présynaptique peuvent être démontrés par l’imagerie de fluorescence en quatre dimensions.

Le principal avantage de cette technique est que le muscle abdominal du serpent n’a qu’une seule fibre d’épaisseur, ce qui permet de générer des images de haute qualité à l’aide de la microscopie à fluorescence épi standard. Le tissu reptilien doit être conservé à basse température, afin qu’il reste physiologique plus longtemps et avec moins de contamination bactérienne. Pour la coloration lysosomale du colorant vital, le colorant est dissous de un à 5 000 dans une solution froide de sonneries reptiliennes.

Pour obtenir une concentration finale de 0,2 micromolaire, ajoutez le colorant au tissu et incubez à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 15 minutes, lavez le mouchoir plusieurs fois avec des sonnettes froides pour toutes les taches FM 1 43. Pré-montez l’échantillon dans une boîte d’imagerie avec des broches magnétiques avant la coloration.

Pour les besoins de cette vidéo, seule la coloration FM 1 43 par stimulation au chlorure de potassium sera démontrée. Le colorant dilué de un à 500 dans des bagues à haute teneur en chlorure de potassium pour obtenir une concentration finale de sept micromolaires est ajouté au tissu, puis le tissu est incubé à quatre degrés Celsius pendant un maximum de 30 à 60 secondes. Par la suite, lavé rapidement trois fois avec des sonneries froides pendant environ une minute par rinçage.

Tous les tissus doivent être imagés dès que possible après avoir été colorés et lavés avec une solution de sonnerie froide. Si un microscope inversé est utilisé, utilisez une chambre d’imagerie dont le fond contient une mince lamelle ronde. En règle générale, la chambre d’imagerie doit avoir un fond mince en acier inoxydable d’un diamètre de 25 millimètres.

Couvercle en verre d’épaisseur numéro un au centre pour configurer la préparation à l’imagerie. Orientez-le à l’aide de broches magnétiques de manière à ce que le muscle soit centré le mieux possible dans la boîte d’imagerie et posé aussi à plat que possible. Recouvrez la préparation d’un petit volume de solution de sonnerie.

Montez le plat en le plaçant le plus près possible du centre de la scène. Choisissez un objectif approprié pour obtenir la résolution 3D la plus élevée possible. Un objectif d’eau 63x sera utilisé pour toutes les expériences de cette démonstration.

Pour commencer cette procédure, ouvrez la fenêtre d’imagerie dans le livre de diapositives 5.0. Plusieurs menus sont contenus ici dans des onglets. Choisissez l’objectif d’eau 63 x à l’aide du deuxième onglet Z.Définissez l’intervalle de pile Z.

Dans cet exemple, un pas Z de 1,5 micron est utilisé pour l’imagerie en direct. Sélectionnez la fréquence d’images time-lapse. Un taux optimal est celui qui est juste suffisant pour résoudre en douceur les changements avec le temps, tels que les interactions de mouvement ou les événements de fusion.

Par exemple, 10 points temporels à des intervalles de 32 pour un intervalle de temps total de cinq minutes. Ensuite, sélectionnez la profondeur de champ totale tout en affichant le focus manuel en direct du terminal en haut du foyer d’intérêt, puis allez un peu au-dessus. Sélectionnez le décodeur.

Concentrez-vous lentement sur l’échantillon jusqu’à ce que tout soit flou. Encore une fois, le nombre d’avions et les valeurs de course totale affichées indiqueront la profondeur de champ sélectionnée dans la fenêtre de capture. Sélectionnez les cases d’option utilisées en haut et en bas pour transférer les paramètres qui viennent d’être sélectionnés. Pour la capture d’image, démarrez l’acquisition d’image.

Réalisez toutes les images en direct pour une préparation particulière. Conservez tous les fichiers de données brutes tandis que le stockage numérique n’est généralement pas un problème. Le temps de traitement est important, même avec des ordinateurs personnels ou des postes de travail rapides.

Pour cette raison, le recadrage des images dans une zone d’intérêt garantit que toute la région d’intérêt se trouve dans la fenêtre recadrée pendant toute la durée de l’opération. Le cours D peut impliquer des piles d’images à l’aide d’un logiciel approprié et de la fonction d’étalement de points correcte, confirmer que la résolution est améliorée et qu’aucun artefact n’a été généré par l’algorithme de déconvolution. Utilisez un algorithme d’interpolation pour développer l’axe Z.

La résolution apparente, une expansion de six fois d’une séparation réelle du plan d’image de 1,5 micron à une séparation apparente de 0,25 micron est suggérée. Effectuez la luminosité du contraste, le filtrage du bruit, le blanchiment des photos et d’autres réglages typiques du traitement d’image. Si vous le souhaitez.

Les normes de manipulation d’images dictent que pour la plupart des travaux scientifiques, il est approprié que les mêmes corrections soient appliquées à toutes les images à la fois au sein d’une pile et à différents moments temporels. La conséquence d’un ajustement particulier doit être évaluée parmi toutes les images. Expérimentez diverses techniques de filtrage et d’amélioration de l’image.

Par exemple, les lelos et le filtrage sont utiles pour augmenter le contraste des petites structures au-dessus de l’arrière-plan. La luminosité des pixels au centre d’une fenêtre en cours d’exécution est augmentée tandis que la luminosité des zones environnantes est réduite. Notez que certaines méthodes de filtrage ne fonctionnent pas bien en combinaison.

Appliquez une correction de dérive s’il y a un mouvement important de la préparation au fil du temps. Un tel mouvement est courant dans les muscles vivants, même avec des médicaments ajoutés pour supprimer les potentiels d’action et les potentiels synaptiques. Un algorithme de recalage de pixels aligne les images en accéléré et peut réduire, mais généralement pas éliminer complètement, ce mouvement.

Dans cette étude, quatre images en direct D des terminaisons neuromusculaires du serpent ont été utilisées pour déterminer si les macro-endosomes ou moi se déplaçaient vers la membrane plasmique et disparaissaient rapidement, suggérant que leur nombre diminue parce que certains d’entre eux accèdent au cyto. Les données sont affichées sous forme de vues volumiques 3D à six points temporels avec un intervalle d’image de 60 secondes. Pour illustrer la profondeur Z d’un seul buton, on peut observer un moi s’éloigner de l’axe Y indiqué par la ligne pointillée rouge sur plusieurs images avant de disparaître entre les points temporels cinq et six, que le temps nécessaire à la disparition était inférieur à l’intervalle de l’image est compatible avec l’exocytose juste avant la disparition.

Le ME semble être situé au niveau de la membrane plasmique des bâtons. Le même jeu de données brutes est affiché ensuite sous la forme d’un film à un grossissement inférieur. La séquence est brièvement interrompue au début de chaque 24 étapes de rotation 3D autour de l’axe Y pour attirer l’attention sur le moi qui va bientôt disparaître, indiqué par la flèche rouge.

Notons que le ME est visible, s’approche, le bord du buton disparaît et ne revient pas dans toutes les perspectives de vision. En raison de la résolution de l’axe Z inférieure à celle de la résolution XY, la forme du ME semble s’allonger et se raccourcir en fonction de la perspective de visualisation. Des études de microscopie électronique ont montré que les endosomes dans les bornes motrices sont de petite taille près de la limite de diffraction de la lumière.

Par conséquent, la fusion de ces endosomes ne peut pas être absolument distinguée d’une association spatiale étroite au niveau de la lumière. Dans cette étude, les Mees ont été marqués avec le FM 1 43 indiqué dans le vert et les endosomes acides ou les EA ont été marqués avec un lysosomal. Le colorant vital indiqué en rouge dans les données d’un point temporel d’un film quatre D est affiché sous forme de vues volumiques 3D dans trois orientations.

Les panneaux supérieurs, un à trois, montrent la vue conventionnelle d’au-dessus du plan XY. Les panneaux du milieu, de quatre à six, montrent une vue perpendiculaire au plan XY et dans la direction de la grande flèche rouge. Les panneaux inférieurs sept à neuf montrent une vue mutuellement perpendiculaire aux deux vues ci-dessus dans la direction de la grande flèche bleue.

Un moi est marqué d’une flèche verte et deux AE sont marqués de flèches rouges. Des structures fluorescentes dans les deux couleurs apparaissant jaunes ont parfois été notées dans quatre enregistrements d’images D. Dans cet exemple, un endosome contenant les deux colorants est marqué d’une flèche jaune dans les panneaux trois, six et neuf.

Le chevauchement du rouge et du vert est également complet dans les trois projections orthogonales, indiquant un em me ae putatif fusionné. Cette vidéo montre le même jeu de données configuré pour pivoter sur l’axe Y à raison d’une image par seconde. Le MEAE fusionné présumé reste jaune sous tous les angles.

La déconvolution numérique est un outil utile pour améliorer la résolution des images 3D ainsi que des images quatre D. Une comparaison entre les données brutes et les données décentralisées est présentée ici. Pour une terminaison nerveuse de serpent typique colorée lors d’une stimulation avec FM 1 43 Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 à 60 minutes si elle est correctement exécutée.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunohistochimie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la colocalisation des macro-endosomes avec des marqueurs présynaptiques.