Spinal Cord Injury complète et cerveau Protocole Dissection pour Wholemount suite In Situ Hybridation dans des larves de la lamproie marine

Les lamproies récupérer locomotion après une lésion complète de la moelle épinière. Cependant, certains neurones spinaux en saillie sont de bons régénérateurs et d'autres non. Cet article illustre les techniques de larves logements de la lamproie marine (et les adultes récemment transformées), la production complètes transections de la moelle épinière et le cerveau wholemount préparation et la moelle épinière pour l'hybridation in situ.

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une section complète de la moelle épinière, une transsection et une dissection cérébrale pour l’étude du guidage axonal après une blessure. Ceci est accompli en transectant d’abord une moelle épinière de lampre au niveau de la cinquième branchie. Ensuite, le cerveau est disséqué et épinglé à la protection du syl.

Après avoir fixé le cerveau, il peut être stocké dans du méthanol ou immédiatement utilisé pour l’hybridation in situ et finalement modifier l’expression de l’axonal. Les récepteurs de guidage peuvent être observés dans une vertèbre en régénération après une lésion de la moelle épinière. L’avantage de la technique que nous allons démontrer aujourd’hui par rapport à la section plus conventionnelle en paraffine ou à la section cryostat, c’est qu’elle permet de voir l’ensemble du cerveau, y compris les neurones qui se projettent vers la moelle épinière et qui sont gros et identifiés.

La démonstration de la procédure est assurée par le Dr Kathy Zang, chercheuse scientifique dans notre laboratoire, des ruisseaux alimentant les affluents du lac Michigan à la rivière Delaware en Pennsylvanie, ou des ruisseaux du Maine. Larve de lamelle marine de type sauvage de l’espèce. Des animaux de compagnie sur Marus ont été obtenus.

larves de quatre à 7 ans mesurent de 10 à 14 centimètres de long et sont assez grandes pour être blessées et dissectionnées. Entretenez-les par groupes de 52, une centaine. Dans des réservoirs d’eau douce de 50 gallons à 16 degrés Celsius.

Le réservoir nécessite un substrat de gravier d’un pouce pour que la lamproie puisse emprunter Toute l’eau ajoutée au réservoir doit être conditionnée avec un filtrage au charbon de bois et une aération pendant au moins 48 heures avant d’être ajoutée au réservoir. À condition que les animaux soient utilisés dans un délai d’un an, il n’est pas nécessaire de les nourrir pour cette procédure. Ayez une solution de sonnerie fraîchement préparée à portée de main.

Transférez d’abord une lampe dans une solution aqueuse saturée de benzocaïne. Une fois anesthésié, transférez-le dans un plat à moitié rempli de sil guard. Mettez le plat sur de la glace et complétez le plat avec de la glace.

Sonneries froides. Fixez l’animal à l’aide de trois épingles à insectes de 0,15 diamètre, une au museau et deux à la cinquième branchie. Ensuite, positionnez-le sous un stéréomicroscope pour l’opération.

Commencez par utiliser un scalpel numéro 11 pour faire une incision longitudinale le long de la ligne médiane dorsale au niveau de la cinquième branchie. Cela révélera la moelle épinière lors de cette incision. Utilisez deux crochets fabriqués à partir d’épingles à insectes pour fixer les parois du corps à l’aide de ciseaux Castro reveal numéro huit.

Faites une coupe perpendiculaire à travers la moelle épinière exposée. Inspectez les extrémités coupées de la moelle épinière pour vous assurer que la section est terminée. Ensuite, à l’aide d’une pince, réalignez les extrémités coupées et fermez la plaie.

Transférez la lave de la lamandre sur un morceau de papier filtre imbibé de solution de résonance. Déplacez la préparation sur un lit de glace pendant une heure afin que la plaie puisse sécher au bout d’une heure. Transférez la lave dans son propre petit réservoir d’eau glacée.

Laissez-le y guérir pendant 24 heures. Après 24 heures, vérifiez qu’il n’y a pas de mouvement dans le câble. S’il y a des mouvements, la section était incomplète.

S’il n’y en a pas, le transect était bon et l’animal peut être déplacé dans un réservoir à température ambiante pour être récupéré pendant que l’animal se rétablit. Changez l’eau tous les deux à trois jours. Une fois que l’animal transecté est suffisamment rétabli, anesthésiez-le et préparez-le pour la dissection comme décrit précédemment.

Pour disséquer le cerveau, commencez par une incision transversale entre la narine et l’organe pinéal. Ensuite, avec le veau Castro, des ciseaux coupent le tissu entourant le cerveau tout en fixant l’animal. Avec des pinces.

Les structures ovales blanches de chaque côté du tronc cérébral sont les capsules otiques. Une fois le cerveau exposé, utilisez des pinces pour enlever le plexus choroïde. Ensuite, utilisez les crochets à goupilles modifiés pour écarter la tête de l’animal et exposer les nerfs crâniens.

Ensuite, coupez la moelle épinière transversalement avec les ciseaux tout en fixant la moelle épinière avec des pinces. Coupez les nerfs crâniens pour disséquer le cerveau. Transférez ensuite le cerveau sur un petit morceau de silicone et fixez-le là.

À l’aide d’une épingle à insectes dans la moelle épinière et d’une épingle à travers l’un des bulbes olfactifs. Ensuite, à l’aide des ciseaux, coupez la commissure du bulbe inter-olfactif, la commissure protectrice cérébrale et l’oex du tronc cérébral le long de la ligne médiane dorsale. Une fois les commissures et l’oex coupés, déviez les plaques A LR latéralement et épinglez-les à plat sur le silicone avec un total de sept épingles à insectes, deux dans les bulbes olfactifs, deux dans les bords de la coupe, commissure protectrice cérébrale, deux dans l’oex étendu et une dans la ligne médiane de la moelle épinière.

Maintenant, à l’aide de réactifs sans ARN, fixez la préparation dans du paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante pendant trois heures avec une agitation douce. Les cerveaux peuvent ensuite être analysés par hybridation in situ deux en utilisant la méthode décrite l’expression du néogène dans les transcrits a été identifiée dans la moelle épinière, projetant des neurones de contrôle, chez les animaux et chez les animaux. Deux semaines après la lésion, on voit ici un témoin représentatif non blessé.

Après la transsection complète de la moelle épinière, il y a eu des changements dans l’expression du récepteur néogène. Après deux semaines, le récepteur néogénique dans le non-contrôle a été exprimé préférentiellement dans les mauvais régénérateurs comme les neurones M1 I un I deux I quatre, ou les neurones MTH. Le développement de cette technique a ouvert la voie à notre capacité à explorer l’expression des récepteurs de guidage, des récepteurs du sulfate de chondroïtine, du protio, des glycanes et de l’activation des bases coulées dans le même cerveau.