Name: Numérisation Transmission à grande échelle Electron Microscopy (Nanotomy) de santé et de blessés Zebrafish cerveau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Découvrez la nanotomie par microscopie électronique à grande échelle pour étudier le cerveau de zebrafish sain et lésé. Cette méthode offre une résolution nanométrique pour l'analyse tissulaire complète en neurosciences.

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La majorité du travail a été effectué au UMCG Microscopy and Imaging Center (UMIC), qui est parrainé par NWO 175-010-2009-023 et ZonMW 91111006; STW &quot;Microscopie Valley 12718&quot; à BNGG. Ce travail a été financé par une subvention ZonMW VENI, une subvention d&#39;intégration professionnelle Marie Curie (sauver la mort des neurones) et une bourse Alzheimer Nederland à TJvH

Toutes les expériences avec les larves de poisson zèbre ont été approuvées par le Comité l&#39;expérimentation animale de l&#39;Université de Groningen selon les directives nationales et européennes. Préparation 1. Echantillon <ol><li> Fixation and Embedding <ol><li> Fixation <ol><li> Les larves de poissons dans tricaïne (0,003%) anesthésier ajouté au (NaCl 5 mM , KCl 0,17, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10 mM HEPES, pH 7,6) E3 de l&#39; eau du poisson zèbre et un test pour la profondeur de l&#39; anesthésie en poussant doucement avec une pointe de pipette 200 pi sous dissection microscope jusqu&#39;à ce que le mouvement ne soit plus détecté (figure 1A). </li><li> Lors du traitement des échantillons pour EM corrélative après l&#39; acquisition de données d&#39;imagerie in vivo en utilisant confocal ou d&#39; imagerie 2 photons dans 1,8% d&#39; agarose comme décrit, 5,15 fix larves d&#39; agarose en utilisant 4% de PFA dans du PBS contenant du Triton-X-100 (0,05%). </li><li> Couper les larves d&#39;agarose et le processus deEM à grande échelle 5. </li><li> Fixer des larves dans du paraformaldehyde frais à 4% dans du PBS contenant du Triton-X-100 (0,05%) pendant 2 heures à la température ambiante dans des tubes en plastique. Note: Les cellules cultivées en culture (in vitro) peut être directement fixé dans du glutaraldéhyde, comme décrit dans l&#39;étape suivante (1.1.1.5). </li><li> Enlever la solution et ajouter 100 ul de 0,5% de PFA, 2% de glutaraldéhyde (GA), et 0,1 M de cacodylate de sodium (pH 7,4). Conserver une nuit à 4 ° C. échantillons Rincer deux fois dans cacodylate de sodium 0,1 M. </li><li> Couper les têtes des larves rostrale du cerveau postérieur pour faciliter la pénétration de l&#39;osmium. Utilisez fines seringues / forceps. </li><li> Postfix larves dans 1% de tétroxyde d&#39; osmium (OSO 4) /1.5% ferrocyanure de potassium (K 4 [Fe (CN) 6]) dans 0,1 M de cacodylate de sodium sur la glace pendant 2 heures et rincer 3 x 5 min dans le double H distillée 2 O. </li><li> Déshydrater dans l&#39;éthanol par 20 min d&#39;incubation dans des concentrations croissantes d&#39;éthanol (50%, 70%, 3 fois par 100%). </li></ol></li><li>Incorporation <ol><li> Préparer une résine époxy selon les recettes standard utilisés dans les laboratoires de EM. Remarque: Nous utilisons une résine époxy comme suit: mélanger 19,8 g glycid éther 100, 9,6 g d&#39;anhydride d&#39;acide 2-dodécénylsuccinique et 11,4 g d&#39;anhydride méthylnadique utilisant un agitateur magnétique. Ajouter 0,5 g DMP-30 (tris- (diméthylaminométhyl) phénol) et mélanger à nouveau. </li><li> Incuber les larves pendant une nuit dans une résine époxy à 50% dans de l&#39;éthanol (v / v) pendant la rotation (RT). </li><li> Remplacer dilué résine époxy avec de la résine pure. Incuber pendant 30 min, ajouter résine fraîche à nouveau et incuber pendant 30 min. Encore une fois rafraîchir la résine puis incuber 3 heures à température ambiante, puis 15 min à 58 ° C et un autre 1 heure à température ambiante sous basse pression (200 mbar). </li><li> Orienter les têtes dans disponibles dans le commerce silicium plat moules d&#39;encastrement sous un microscope de dissection à l&#39;aide d&#39;une aiguille ou d&#39;un cure-dent avec la face antérieure faisant face au côté du moule, ou au besoin (Figure 1B). </li><li> Polymériser res époxydans la nuit à 58 ° C. Si la résine époxy est encore trop mou permettre un autre jour pour polymériser et durcir à 58 ° C. raideur de test en appliquant une pression en utilisant une pince. Si cela laisse facilement une indentation permettre un autre jour pour polymériser et durcir à 58 ° C. Lorsque l&#39;échantillon est entièrement durci procéder à la coupe et la coupe. </li><li> Coupez l&#39; excédent de résine des stub en utilisant des lames de rasoir (figure 1B). </li></ol></li></ol></li><li> Sectionnement, contrastante et montage <ol><li> Sectionnement <ol><li> bloc de résine Section époxy en utilisant un ultramicrotome. </li><li> Utilisez un couteau de verre ou un histoknife de diamant pour couper des sections semithin (500 nm) pour le bleu de toluidine / fuchsine basique (figure 1D) coloration pour détecter le bon positionnement. </li><li> Transfert semi-minces sections sur des lames microscopiques en les ramasser avec une pipette Pasteur en verre dont la pointe a été fermée par fusion dans une flamme. Sec sur une plaque chauffante uusqu&#39;à pas d&#39;eau est laissé. La coloration pendant 10 secondes avec 1% de bleu de toluidine dans l&#39;eau sur une plaque chaude et, après rinçage à l&#39;eau, aux taches pendant 10 s avec 0,05% de fuchsine basique dans le tétraborate de sodium à 1%. Examiner avec un microscope optique normal à 10X à 40X. </li><li> Lorsque le site / l&#39; orientation correcte dans le cerveau est atteinte, continuer sectionner le bloc de résine époxy avec un couteau de diamant pour couper des sections ultra - minces (~ 70 nm; figure 1E) </li><li> Utilisez les structures anatomiques facilement identifiables dans et autour du cerveau, y compris les fosses olfactives, les yeux, les limites de la matière grise-blanche, pour identifier la région d&#39;intérêt pendant ultraminces sectionner et d&#39;ajuster l&#39;angle de coupe lors de l&#39;échantillon est incliné. </li><li> Section mont sur ​​simple fente grilles L2 x 1 de cuivre (figure 1F), afin de permettre l&#39; acquisition non interrompu par des barres de grille. Utilisez Formvar grilles revêtues pour soutenir les sections. </li></ol></li><li> Contrastant <ol><li> coupes ultrafines Tache sur la grilles pendant 2 minutes à 2% d&#39; acétate d&#39;uranyle dans du methanol suivi par Reynolds du citrate de plomb pendant 2 min 16. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Image Acquisition <ol><li> Large Scale STEM Remarque: Nous utilisons l&#39; analyse EM avec un générateur de balayage externe capable d&#39;acquérir plusieurs grands champs de vision à haute résolution 3,5,7,17 ​​utilisant la détection de STEM. Typiquement, une image générée de cette manière est équivalente aux champs de vision de 100 ~ microscope électronique à transmission (TEM) images, ce qui réduit considérablement la quantité de couture. <ol><li> Exemple de montage dans Microscope <ol><li> Placer la grille à l&#39;article dans le porte-échantillon de grille multiples et transférer dans la chambre de la SEM. </li></ol></li><li> Alignement du détecteur STEM <ol><li> Mettez la grille avec l&#39;échantillon sous le faisceau et le déplacer jusqu&#39;à sorte qu&#39;il sera environ. 5 mm par rapport au pôle de la lentille. Acquérir une image à 20 kV en utilisantle détecteur à lentille. </li><li> Concentrez sur le bord de la grille et régler la distance de travail à 4,0 mm. </li><li> Déplacez le porte-échantillon à une position de sécurité et apporter le détecteur STEM. </li><li> Centrez le trou du détecteur STEM dans le champ de l&#39;image en tournant les ajustements vis en imagerie à vitesse maximale avec le détecteur en verre. </li><li> Ramener ensuite avec précaution en arrière le porte-échantillon qui vient se loger entre le pôle de lentille et le détecteur. </li><li> Acquérir une image avec le détecteur en verre pour être sûr d&#39;être sur la zone de section. </li><li> Passer en STEM détection (milieu de gain et de tous les quadrants fixés sur «moins») et d&#39;acquérir une image et sélectionner la zone à numériser. </li><li> Augmenter la tension d&#39;accélération de 21 kV et d&#39;attendre la stabilisation du faisceau (image stable à nouveau), puis aller à 29 kV par paliers de 2 kV. </li></ol></li><li> Acquisition d&#39; images <ol><li> Pré-irradier l&#39;échantillon (pour éviter les changements de luminosité causés par le e-beam) en zoomantde manière complète la zone à numériser est compatible avec la fenêtre d&#39;image. </li><li> Changer l&#39;ouverture à 120 um (pour garder la plage dynamique appropriée les gains de détection doivent être réduit une seule étape). </li><li> De-focus pour que l&#39;image est floue. </li><li> Faire de la zone balayée aussi serrée que possible en utilisant l&#39;option de balayage de zone réduite. </li><li> Réglez la vitesse de balayage de telle sorte qu&#39;une image est balayée env. 1 - 2 sec. Remarque: En fonction de la taille et du tissu cela prend généralement ½ h (100 x 100 um FOV) à un maximum de 3 heures (1000 x 500 um). </li><li> Zoom dans au moins 100X et balayer une petite surface pendant 10 secondes. Remarque: Lorsque cette zone ne change pas la luminosité par rapport à sa pré-irradiation environnante est suffisante. </li><li> Ramener l&#39;ouverture de 30 pm (et STEM gain sur support) </li><li> Concentrez l&#39;échantillon. </li><li> Alignez ouverture à l&#39;aide du wobbler (à ~ 40,000X grossissement). </li><li> Alors que la mise au point de sélectionner le plus léger zone / fonction, régler la vitesse de balayage de telle sorte que les détailssont visibles. </li><li> Dans le logiciel de microscope régler la luminosité et le contraste en regardant attentivement l&#39;histogramme de garder tous les pixels dans la plage dynamique. Faites de même pour les plus sombres zone / caractéristiques. </li><li> Retour à la zone lumineuse et vérifier à nouveau. Soyez sur le côté sécuritaire donc il y a un peu d&#39;espace sur les deux côtés de l&#39;histogramme. </li><li> Zoom arrière de sorte que la surface à analyser correspond à la fenêtre d&#39;imagerie, et commencer le grand programme d&#39;acquisition de la zone. </li><li> Utilisez l&#39;option de l&#39;assistant pour configurer une mosaïque en sélectionnant une zone de l&#39;écran. Utiliser la taille du pixel 2-5 nm en fonction de ce que les détails sont nécessaires. Utilisez le temps de séjour de 3 ms pour STEM. </li><li> Sélectionnez l&#39;option &quot;mise au point automatique sur la tuile précédente&quot;, utilisez la grande mise au point automatique du logiciel d&#39;acquisition à grande échelle avec les paramètres de l&#39;entreprise par défaut, la case à cocher &quot;vérifier la mise en avant l&#39;exécution&quot; et définir où enregistrer les données. </li><li> Appuyez sur &quot;optimiser&quot; pour vérifier les réglages du microscope. Remarque: Maintenant, le temps nécessaire sera shposséder. Cela pourrait être jusqu&#39;à 72 h pour 1 x 0,5 mm zones. </li><li> Dans la fenêtre de type &quot;résolution de tuiles maximale&quot; 20.000 carreaux de sorte individuels ne seront pas plus grand que 20k x 20k, ce qui empêche les effets de bord contondants. Appuyez sur &quot;exécuter&quot;. </li><li> Lorsqu&#39;on lui a demandé de vérifier focus et Luminosité / Contraste (B / C), éteindre le générateur de balayage externe et ajuster le focus et l&#39;astigmatisme dans le logiciel de microscope avec soin. Ne pas changer B / C. Remarque: L&#39;étape peut être déplacé et le grossissement changé, mais le grossissement doit être en retrait à la taille de pixel souhaitée. </li><li> Allumez le générateur de balayage externe à nouveau et appuyez sur &quot;continuer&quot;. </li></ol></li></ol></li></ol> Analyse 3. Données <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ouvrez programme de visualisation fichier EM à grande échelle et ouvrez le fichier &quot;info mosaïque&quot;. Cela permettra d&#39;ouvrir tous les fichiers TIF-carrelées. Ceci est de préférence réalisé sur un autre poste de travail pour ne pas gêner les nouvelles acquisitions. </li><li> Choisissez l&#39;option &quot;aupour assembler toute la mosaïque (paramètres chevauchent le mode sur la moitié, couture seuil de 0,90, la réduction automatique du bruit. Dans le cas des critères de couture ne peuvent pas être remplies, zoom et placez manuellement la tuile en position et cliquez sur &quot;Continuer comme cela est &#39;). </li><li> Exporter sous forme de fichier html, ou encore comme un seul TIF. Notez que pour les TIF exporter un downscaling pourrait être nécessaire. Inclure la taille de pixel finale dans le nom de fichier permettant des mesures plus tard. </li><li> Effectuer des annotations dans le fichier TIF en l&#39;ouvrant dans un programme de retouche d&#39;image. En parallèle, ouvrez le fichier html zoomable dans un navigateur web pour l&#39;observation de la résolution optimale. </li></ol>

<ol><li>Faas, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+nanoscopy%3A+generation+of+ultra-large+high+resolution+electron+microscopy+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps.</a> J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

EM permet une analyse du contexte cellulaire avec imagerie haute résolution de macromolécules dans le contexte biologique. Toutefois, cela limite généralement le champ de vision. Agrandir l&#39; échelle 3D EM est particulièrement adapté pour la connectivité cartographie neuronale en créant la résolution nanométrique 3 reconstructions tridimensionnelles, nécessitant un traitement complexe des données 10. En revanche, 2D à grande échelle EM ne nécessite qu&#39;une seule section et les coutures des données d&#39;imagerie, et l&#39;évaluation des données est possible par toute personne ayant accès à un navigateur Internet. Nous et d&#39;autres précédemment utilisé à grande échelle EM pour analyser les tissus et les animaux entiers. Comme pour la plupart des approches, TEM et couture à base de SEM ont leurs propres avantages. Ici, la transmission de balayage EM (STEM) a été utilisé qui permet la génération d&#39;un grand champ de vision à haute résolution. Typiquement, une image STEM est équivalente aux champs de vision d&#39;environ 100 images TEM, ce qui réduit considérablement la quantité de couture lors de l&#39;imagerie grand Fields de vue à haute résolution. Si une résolution plus élevée est nécessaire, MET peut être avantageuse. STEM a l&#39;avantage sur TEM que les échantillons non-contraste peuvent être utilisés avec un bon contraste ultrastructurale 6. En outre, le procédé décrit ici peut être facilement ajustée pour une utilisation avec la détection des électrons rétrodiffusés (BSD) sur des sections montées sur des plaquettes de silice, l&#39;élargissement de l&#39;utilisation de plusieurs systèmes de microscope. Tissu HTML-zoomable fichiers EM sont très utiles pour la quantification, le partage des données qui peuvent ne pas avoir été analysé à son contenu complet, combinant LM et les données EM (CLEM) 8, des fins de présentation dans la recherche scientifique, pour analyser les données du patient, et pour l&#39; éducation. En variante, dans EM à grande échelle dans un SEM, mais pas dans un TEM, des plaquettes de silice peuvent être utilisés, ce qui présente deux avantages principaux: BSD peut être utilisé, ce qui est plus généralement disponible sur les microscopes électroniques à balayage de STEM détection. Deuxièmement, le montage de grandes sections (&gt; 1 mm 2 zones deintérêt) est simple. Montage sur des grilles à fente unique est un travail intensif et techniquement difficile. Une comparaison détaillée entre TEM, SEM et STEM est détaillé ailleurs 6. Un inconvénient de l&#39;imagerie par BSD est que, par rapport à la tige, les images ont une augmentation du bruit. Cela peut en partie être compensée en augmentant le temps de séjour de pixels, ce qui entraîne de plus longues durées d&#39;acquisition. Bien que pour la préparation des échantillons de traitement relativement standard EM (fixation, intégration et sectionnant) est nécessaire 5-7, il est techniquement difficile de couper des sections ultraminces grandes complètement dépourvues d&#39;artefacts. Les articles sont très fragiles, facilement briser, plier ou sont détruits lors de l&#39;imagerie, qui prend généralement plusieurs heures par jeu de données. Toutefois, en raison du partage en ligne des données impartiales premières, il devrait être possible de comparer plus facilement les données publiées, et d&#39;utiliser ensemble de données publiées dans le domaine ouvert en tant que témoins. Actuellement, peu d&#39;appareils EM capable de laanalyse rge échelle sont en cours d&#39;utilisation, et donc l&#39;accessibilité à cette technique est quelque peu limitée, bien que la plupart des centres d&#39;imagerie accueillent les efforts de collaboration. Pour les sections à grande échelle le tissu doit être fixé correctement tout au long de l&#39;échantillon. Voilà pourquoi un mélange de fixateur rapide mais modérée PFA est utilisé en combinaison avec le fixateur lente mais forte GA. Couper et ramasser de grandes sections sans artefacts est difficile. Travailler avec des plaquettes en combinaison avec BSD est plus facile par rapport à la collecte de sections sur des grilles de trous simples. Lourd poteau de métal coloration est plus critique par rapport à EM classique. Étant donné que la section entière est imagée chaque artefact sera visible. Les utilisateurs trouvent généralement TEM, il est difficile de passer à un SEM, en raison de la différence de fonctionnement du microscope. Quantification et le partage des données - Quantification caractéristiques subcellulaires est difficile dans les images simples EM. La possibilité de zoomer dans et hors de grande échelledes images permet facilement l&#39;identification des cellules d&#39;intérêt, qui peuvent être suivies par des mesures à l&#39;échelle nanométrique à l&#39;intérieur des cellules. Ces ensembles de données indiquent que des types cellulaires spécifiques peuvent être rapidement identifiés et quantifiés de manière impartiale dans ces grandes sections de tissu, sur la base de caractéristiques détectables à différentes échelles. Par exemple microglie peuvent être identifiés en fonction de leur morphologie et le cytoplasme dense. Par la suite, lors de zoom sur les cellules individuelles, les caractéristiques nanométriques subcellulaires et moléculaires de ces cellules peuvent être mesurées dans le même ensemble de données, comme nous l&#39; avons montré précédemment pour la largeur de ER dans une grande échelle tissu EM culture ensemble de données 2. Un avantage supplémentaire de nanotomy est que l&#39;hébergement de grands ensembles de données à grande échelle en ligne va permettre à d&#39;autres d&#39;inspecter les données, peut-être pour d&#39;autres fonctions, et d&#39;en tirer leurs conclusions sur la nouvelle hypothèse. CLEM - En plus de faciliter EM quantitative, grande EM échelle facilite la corrélation microsco lumièreétiquetage de pic à EM niveau 8. Dans le présent exemple, la présence de la microglie phagocytaires dans un modèle d&#39;ablation de poisson zèbre est représenté. Une question majeure en neurosciences est ce que les fonctions et les contributions individuelles sont des microglies et d&#39;autres sources potentielles de phagocytose et les cellules immunitaires. Des études EM précoces ont montré des caractéristiques subcellulaires distinctifs de la microglie dans la maladie 18. Malheureusement, il est difficile de marquer sélectivement les microglies, en particulier dans un contexte pathologique, car ils présentent un chevauchement important avec d&#39;autres cellules immunitaires dans l&#39;expression génique, la morphologie et la fonction. Par conséquent, il est difficile de savoir si et quand microglie au niveau ultrastructural diffèrent des cellules immunitaires provenant d&#39;autres sources, y compris des monocytes dérivés infiltrant les macrophages. Comprendre s&#39;il existe des différences ultrastructurales entre ces cellules fourniront un point de départ pour l&#39;analyse des différences fonctionnelles. La combinaison de transgéniques ou d&#39;expression des marqueurs sélectifs et CLEM permet detection des caractéristiques ultrastructurales sélectives pour des populations spécifiques. Diagnostic et présentation et de l&#39; éducation - En visualisant l&#39; échelle nanométrique à MicroScale dans un seul jeu de données de données EM est grandement facilitée à un large public. Avec les possibilités accrues et des outils pour EM corrélative et à grande échelle, nous prévoyons une reprise de EM dans la recherche fondamentale et médicale. Notre méthode représentée ici est appliquée à un modèle de lésion du cerveau de poisson zèbre 5, mais a été utilisée sur les tissus humains 7, dans le cerveau de rat 3, dans un modèle de rat pour le diabète 4 et dans la culture cellulaire 2, et peut également être utilisé en combinaison avec un MET approche fondée sur 1 montrant la polyvalence de cette méthode. L&#39;opérateur de microscope est plus fortement l&#39;enregistrement sélectionné, et des images donc biaisées, mais toutes les nombreuses caractéristiques ultrastructurales sont enregistrées et ouvert pour l&#39;analyse dans le monde entier.

Des développements techniques récents ont permis d&#39;améliorer la polyvalence, l&#39;applicabilité et la nature quantitative de l&#39;EM, conduisant à une reprise de l&#39;analyse ultrastructurale. Les progrès comprennent 3D EM, à grande échelle 2D EM et des méthodes et des réactifs améliorés pour la microscopie corrélative de microscopie optique et électronique (CLEM) pour comparer d&#39; autres modes d&#39;analyse microscopique directement au niveau EM 8-10. À grande échelle 2D EM est particulièrement adapté pour quantifier ou identifier (nouveaux) caractéristiques de la maladie pour la pathologie humaine, étudier les modèles animaux pour les modèles de la maladie et de la culture de tissus. En raison de la petite généralement champ de vision, il est difficile d&#39;établir une corrélation entre les changements à fort grossissement à une large échelle de tissus, ainsi que pour analyser quantitativement et sans biais caractéristiques ultrastructurales. Pour l&#39;analyse pathologique du tissu humain ou l&#39;évaluation de la pathologie dans les modèles animaux, l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine (H &amp; E) des sections colorées de formaldéhyde paraffine (FFPE fixe embarqué) tisSue est la norme. En plus simple, coloration H &amp; E immunomarquage est également effectuée pour identifier les anomalies pathologiques. Si de tels tissus pourraient être analysés au niveau EM, des types cellulaires spécifiques, et les changements subcellulaires ont pu être identifiés. La nature impartiale de grande EM échelle permet de trouver des caractéristiques inattendues et nouvelles de la maladie. En grande échelle des zones EM jusqu&#39;à en millimètres carrés peuvent être visualisées. Nous et d&#39; autres nanotomy de rat îlots pancréatiques 4, de culture cellulaire 2, cerveau de rat 3, la peau et les muqueuses 7 et toute larves de poisson zèbre 1,5 (www.nanotomy.org) précédemment appliqué. Le poisson zèbre est très approprié pour l&#39; imagerie in vivo, en particulier pour visualiser les types de cellules qui sont difficilement accessibles dans des tissus de mammifères , y compris les cellules immunitaires du cerveau 11. Ici, la procédure de nanotomy est décrite en détail, appliqué à des coupes coronales de têtes de poisson zèbre subissant une ablation neuronale conditionnée par la conversion du métronidazole par neuronalenitroreductase exprimé (www.nanotomy.org) 5,12-14. Toutes les données brutes sont présentées sous forme de fichiers HTML zoomables, la visualisation moléculaire à des changements d&#39;échelle tissulaire. La présentation des données brutes permet des analyses impartiales sur les ensembles de données à partir d&#39;autres angles par des experts du monde entier.

<table><tbody><tr><td><fort>Chimie</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agarose à faible point de fusion</td><td>VWR</td><td>444152G</td><td></td></tr><tr><td>tricaïne</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldéhyde</td><td>Polysciences</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>cacodylate de sodium</td><td>Sigma</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>tétroxyde d’osmium</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>19114</td><td></td></tr><tr><td>ferrocyanure de potassium (K4[Fe(CN)]6)</td><td>Merck</td><td>4984</td><td></td></tr><tr><td>éthanol</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>acétate d’uranyle&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>8473</td><td></td></tr><tr><td>tétraborate de sodium</td><td>Merck</td><td>1063808</td><td></td></tr><tr><td>bleu toluidène</td><td>Merck</td><td>1273</td><td></td></tr><tr><td>basic fuchsin</td><td>BDH</td><td>340324</td><td></td></tr><tr><td>citrate de plomb</td><td>BDH</td><td>discontinué</td><td></td></tr><tr><td><fort>EPON</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-dodécénylsuccinicacide anhydride&nbsp ;</td><td>Serva</td><td>20755</td><td></td></tr><tr><td>anhydride méthylnadique</td><td>Serva</td><td>29452</td><td></td></tr><tr><td>éther glycidique 100</td><td>Serva</td><td>21045</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30&nbsp ;</td><td>Polysciences</td><td>553</td><td></td></tr><tr><td>moule d’encastrement plat standard</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>couteau diamanté</td><td>Diatome Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grilles en cuivre&nbsp ;</td>Ruban carbone double face pour les sciences <td></td><td></td>de <td>la microscopie</td></tr><tr><td>électronique&nbsp ;</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>balayage EM Zeiss Supra55</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultramicrotome Leica EM UC7</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>atlas générateur de balayage externe&nbsp ;</td><td>Fibic</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

numérisation transmission à grande échelle electron microscopy (nanotomy) de santé et de blessés zebrafish cerveau

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

La microscopie électronique à grande échelle 2D (EM), ou nanotomy, est l&#39;application de tissus à l&#39;échelle de la microscopie électronique à haute résolution à l&#39;échelle nanométrique. D&#39; autres et que nous avons déjà appliqué grande EM à grande échelle pour la peau des îlots pancréatiques humains, la culture de tissus et de larves de poisson zèbre entier 1-7. Nous décrivons ici une méthode universellement applicable pour les tissus à l&#39;échelle EM de balayage pour la détection impartiale des caractéristiques des sous-cellulaires et moléculaires. Nanotomy a été appliquée pour enquêter sur la santé et un cerveau zebrafish neurodégénérative. Notre méthode est basée sur des protocoles normalisés de préparation des échantillons EM: Fixation avec le glutaraldéhyde et l&#39;osmium, suivie par l&#39;incorporation de résine époxy, ultramince sectionner et le montage des ultraminces-sections sur les grilles d&#39;un trou, suivi par la poste coloration avec uranyle et plomb. À grande échelle des images 2D en mosaïques EM sont acquises au moyen d&#39;un balayage EM reliée à un générateur de balayage à grande surface externe à l&#39;aide EM à balayage par transmission (STEM). Grande échelle images EM sont généralement ~ 5 - 50 G pixels in taille, et la meilleure vue à l&#39;aide des fichiers HTML zoomables, qui peut être ouvert dans un navigateur web, similaire à des cartes géographiques en ligne HTML. Cette méthode peut être appliquée à un tissu (humain), les sections transversales des animaux entiers, ainsi que la culture tissulaire 1-5. Ici, les cerveaux de poisson zèbre ont été analysés dans un modèle d&#39;ablation neuronale non invasive. On visualise à l&#39;intérieur d&#39;un tissu unique jeu de données, et des changements cellulaires subcellulaires qui peuvent être quantifiés dans divers types de cellules, y compris les neurones et les microglies, les macrophages du cerveau. En outre, nanotomy facilite la corrélation entre les EM en microscopie optique (Clem) 8 sur le même tissu, comme les grandes surfaces précédemment imagées par microscopie à fluorescence, peut ensuite être soumis à une grande surface EM, ce qui entraîne le nano-anatomie (nanotomy) de tissus. En tout, nanotomy permet la détection impartiale des caractéristiques au niveau de EM de manière quantifiable les tissus à l&#39;échelle.

À grande échelle EM jeu de données de coupes coronales de la tête de 1-semaine-larves de poisson zèbre montre de nombreux tissus et fonctions cellulaires dans une seule image à grande échelle (www.nanotomy.org). Nanotomy des coupes de cerveau de contrôle révèle des caractéristiques ultrastructurales typiques du tissu neural du cerveau antérieur rostral y compris les faisceaux de fibres olfactives, des noyaux neuronaux et les sous-compartiments neuronaux dont les synapses (figure 2A, www.nanotomy.org). Les types de cellules dans la tête que l&#39;on peut distinguer notamment les chondrocytes avec de grandes vacuoles dans la mâchoire inférieure, la myéline osmiophile des cellules nerveuses olfactives, les cellules endothéliales d&#39;un petit vaisseau, les structures comprennent la méninge (la contrepartie zebrafish des méninges, la couche enveloppante membraneuse le cerveau des mammifères). structures sous-cellulaires comprennent la glycocalyx de l&#39;épiderme, différentes morphologies nucléaires et des foyers différents dans les cel<html> types et organites l y compris l&#39;appareil de Golgi, réticulum endoplasmique (RE), les mitochondries et les vésicules synaptiques et les densités post-synaptiques. De manière inattendue les noyaux des cellules qui tapissent le ventricule sont très denses aux électrons par rapport aux autres cellules dispersées plus latéralement dans le cerveau. En outre, ces noyaux présentent des foyers ventriculaires sombres qui sont absentes dans d&#39; autres cellules dans le cerveau et semblent différents en taille et la structure de l&#39;hétérochromatine, qui se trouve dans les noyaux des cellules microgliales phagocytaire (figure 2). Les cellules qui tapissent le ventricule dans le développement de zebrafish comprennent des cellules gliales essentiellement radiales et progéniteurs neuronaux, ce qui peut refléter un état de la chromatine altérée que les cellules plus différenciées. Comme les cellules souches dans les tissus sont généralement assez rares, nanotomy de corréler l&#39;étiquetage des tissus pour les marqueurs de cellules souches avec échelle tissulaire EM pourrait donc être utilisé pour identifier les caractéristiques ultrastructurales des cellules souches. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; EM à grande échelle (www.nanotomy.org) d&#39;une section coronale dans une larve zebrafish subissant l&#39;ablation neuronale révèle de nombreux tissus spécifiques et les caractéristiques cellulaires et moléculaires non trouvés chez les animaux témoins. caractéristiques cellulaires comprennent microglie phagocytaires et vacuoles la taille des cellules, représentant probablement des cellules meurent (Figure 2B, www.nanotomy.org). des études antérieures EM ont identifié microglie chez les vertébrés 18,19. les traits caractéristiques de la microglie comprennent des noyaux allongés , des touffes de la chromatine lacunaire à côté de l&#39;enveloppe nucléaire, l&#39;appareil de Golgi de premier plan, polyribosomes libres, réticulum endoplasmique granulaire (ER) avec une longue cisternes étroite cytoplasme relativement sombre / dense et de nombreuses inclusions, telles que les phagosomes, des gouttelettes lipidiques et les lysosomes. Tous ceux-ci poinçons, attribués à la microglie dans les tissus de mammifères, ont également été trouvés dans ces cellules dans le cerveau de poisson zèbre (figure 2B, www.nanotomy.org). &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig1.jpg" /> Figure 1: Flux de tissus à grande échelle Electron Microscopy sur Brains Zebrafish. (A) 7 jours-larve de poisson zèbre. (B) têtes larvaires Zebrafish embarqués côte à côte dans la résine époxy. Couteau (C) en verre pour les semi -thin sectionnant et en orientant l&#39;échantillon. (D) semithin toluidine section teinté bleu représentant montrant deux side-by-side intégré larves de poisson zèbre. couteau (E) de diamant pour couper ultrafines (70 nm) sections. (F) image modifiée en (D) de la section entière du cerveau des larves de poisson zèbre sur la grille d&#39; un trou pour indiquer le positionnement. (G) système de Microscopie utilisé à grande échelle 2D EM dans cette étude. (H) Flux de traitement d&#39;image. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig1large.jpg" target="_blank">cliquez ici</a>pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig2.jpg" /> . Figure 2: Nanotomy Résultats:. De macromolécule à Tissue (A) Nanotomy des cerveaux de 7 jours de contrôle post-fertilisation et (B) traités (ablation neuronale; Figure 1), montrant des caractéristiques spécifiques à la neuronal ablation cérébrale dégénérative (B) Ces inclure les microglies, les cellules phagocytaires sombres subissant une mort cellulaire et d&#39; aspect spongieux du tissu nerveux ((A) et (B)). Panneaux supérieurs (adapté de 5): 10X vue agrandie de la région ont indiqué dans les panneaux intermédiaires. panneaux Moyen: vue 10X agrandie de la région ont indiqué dans les panneaux inférieurs. (A, panneau du milieu) de vue à fort grossissement de neuropile montrant synapse (A, panneau inférieur), les vésicules synaptiques (SVS) etla densité post-synaptique (PD). (B, Panneau central) vue à fort grossissement de la microglie amiboïde ou peut - être un macrophage (panneau du milieu, M) montrant des caractéristiques typiques amiboïdes microgliales (panneau inférieur) , y compris l&#39; appareil de Golgi de premier plan (G), les inclusions dont vacuoles lysosomales (L). Barres d&#39;échelle: 50 um (haut), 5 um (moyenne) et 0,5 um (en bas). Ce chiffre a été modifié depuis 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure</a> , ou visiter les données en ligne complète (nanotomy.org).

La microscopie électronique (EM) 2D à grande échelle, ou nanotomie, est l’application à l’échelle tissulaire de la résolution EM à l’échelle nanométrique. Nous décrivons ici une méthode universelle de nanotomie appliquée pour étudier le cerveau des larves de poisson-zèbre en bonne santé et lors de lésions cérébrales non invasives.

Numérisation Transmission à grande échelle Electron Microscopy (Nanotomy) de santé et de blessés Zebrafish cerveau

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

L'objectif général de cette expérience de microscopie électronique à grande échelle, ou de nanotomie, est de définir des altérations allant du niveau macromoléculaire au niveau tissulaire, dans le cas présent, dans le cerveau du poisson zèbre en dégénérescence. La nanotomie peut aider à répondre à des questions clés en sciences de la vie, par exemple dans la recherche sur la neurodégénérescence et sur le diabète de type 1.Le principal avantage de la nanotomie est qu'elle permet d'acquérir des informations sans biais, allant des macromolécules aux organites, aux cellules et aux tissus. Cela permet la quantification et le partage de données en accès libre via nanotomy.org. Bien que la nanotomie offre des aperçus sur le maintien immunitaire et les microglies dans le cerveau neurodégénératif du poisson zèbre, elle est également appliquée à d'autres modèles de maladies, incluant les cultures cellulaires, la souris et même les tissus humains.En général, les scientifiques novices dans cette technique éprouvent des difficultés car la quantité de données est écrasante. Celle-ci peut être mille fois supérieure à celle obtenue avec la microscopie électronique traditionnelle. Après avoir fixé les larves de poisson zèbre selon le protocole décrit, couper les têtes des larves en avant du cervelet afin de faciliter la pénétration de l'osmium. Placer les larves dans du tétraoxyde d'osmium à 1 %, du ferrocyanure de potassium à 1,5 %, dans du cacodylate de sodium 0,1 molaire et incuber sur de la glace pendant deux heures.Ensuite, utilisez de l'eau distillée deux fois pour rincer les embryons trois fois pendant cinq minutes à chaque fois. Avant l'inclusion, les échantillons doivent être déshydratés dans une série d'éthanol. Pour inclure les embryons, après une incubation dans de la résine époxy diluée toute la nuit selon le protocole indiqué dans le texte, retirez la résine diluée et remplacez-la par de la résine pure.Incuber pendant 30 minutes, puis remplacer la résine une deuxième fois et incuber encore 30 minutes. Après avoir renouvelé la résine une troisième fois, incuber à température ambiante pendant trois heures. Ensuite, incuber à 58 degrés Celsius pendant 15 minutes.Enfin, incuber sous pression réduite à température ambiante pendant une heure. Ensuite, sous un microscope stéréo, utiliser une aiguille ou un cure-dent pour orienter les têtes dans des moules d'insertion plats en silicone disponibles dans le commerce. Puis polymériser la résine époxy à 58 degrés Celsius pendant toute la nuit.Lorsque l'échantillon est complètement durci, utilisez des lames de rasoir pour retirer la résine excédentaire du support. Pour détecter le bon positionnement, utilisez un couteau en verre ou un couteau histologique en diamant sur un ultramicrotome afin de couper des sections semithin de larves destinées à la coloration au bleu de toluidine/au fuchsine basique. Transférez les sections semithin sur des lames de microscope en les prélevant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre dont l’extrémité a été fermée par fusion dans une flamme.Sécher sur un bloc chauffant jusqu'à ce qu'il ne reste plus d'eau. Ensuite, placer les échantillons dans du bleu de méthylène 1 % dans l'eau et incuber les sections sur un bloc chauffant pendant 10 secondes pour les colorer. Puis, après avoir rincé les sections à l'eau, utiliser la fuchsine basique 0,5 % dans le tétraborate de sodium 1 % pour colorer les échantillons pendant 10 secondes supplémentaires.Avec un microscope optique classique à un grossissement de 10X à 40X, examiner les échantillons. Lorsque le site ou l’orientation appropriés sont atteints, utiliser des structures anatomiques facilement identifiables, telles que les fosses olfactives, les yeux ou les limites entre la substance grise et la substance blanche, pour identifier la région cérébrale d’intérêt lors de la microtome ultrafine et pour ajuster l’angle de coupe lorsque l’échantillon est incliné. Continuer à sectionner le bloc de résine époxy à l’aide d’un couteau en diamant afin de produire des sections ultraminces de 70 nanomètres.Montez chaque section sur une grille en cuivre codée à barres de type L2 à un seul emplacement afin de permettre l'acquisition sans interruption par les barres de la grille. Un millimètre carré peut sembler petit. Il s'insère juste dans l'ouverture.De cette manière, nous évitons que les barreaux de la grille n'obstruent notre échantillon. Tous les artefacts introduits dans notre échantillon seront enregistrés, contrairement à la microscopie électronique traditionnelle. Contrastez les échantillons avec des métaux lourds selon le protocole indiqué dans le texte et stockez-les dans une boîte à grilles. Pour monter l'échantillon dans le microscope électronique à balayage, ou MEB, placez la grille provenant de la boîte de transfert, avec la section, dans le porte-échantillon multiple pour grilles, puis transférez-la dans la chambre du MEB.Après avoir aligné le détecteur conformément au protocole décrit, pré-irradiez l'échantillon en effectuant un zoom arrière afin que toute la zone à analyser tienne dans la fenêtre d'image. Une fois l'ouverture réglée à 120 micromètres et l'image défocalisée, utilisez l'option de balayage de zone réduite pour rendre la zone balayée aussi restreinte que possible. Ensuite, réglez la fréquence d'images afin de balayer l'image en environ une à deux secondes.Ensuite, zoomez d’au moins 100X et balayez une petite zone pendant 10 secondes. Si la luminosité dans cette zone continue de changer, poursuivez la pré-irradiation. Lorsque la luminosité de cette zone ne change plus par rapport à son environnement, la pré-irradiation est suffisante.Lorsque l'objet est en focus, sélectionnez la zone ou la structure la plus claire et réglez la vitesse de balayage de manière à ce que les détails soient visibles. Dans le logiciel du microscope, ajustez la luminosité et le contraste en surveillant attentivement l'histogramme afin de maintenir tous les pixels dans la plage dynamique. Procédez de la même manière pour les zones et structures les plus sombres.Retournez dans la zone lumineuse et vérifiez à nouveau afin qu'il y ait un espace de chaque côté de l'histogramme. Pour les étapes quatre six à quatre huit, le réglage de la luminosité et du contraste doit être effectué avec beaucoup de soin afin que toute la zone se situe dans la plage dynamique. Dézoomez pour que la zone complète à analyser tienne dans la fenêtre d'imagerie, puis démarrez le programme d'acquisition sur grande surface.Ensuite, utilisez l'option de l'assistant pour configurer une mosaïque en sélectionnant une zone à partir de l'écran. Utilisez une taille de pixel comprise entre deux et cinq nanomètres, selon les détails nécessaires, et réglez un temps de séjour de trois microsecondes pour la microscopie électronique en transmission balayée, ou METB. Appuyez sur optimiser pour vérifier les paramètres du microscope et le temps nécessaire sera affiché.Ensuite, réenclenchez le générateur de balayage externe et appuyez sur continuer. Pour analyser les données STEM, ouvrez un logiciel de visualisation de fichiers de microscopie électronique à grande échelle et ouvrez le fichier appelé mosaic info, qui permettra d'ouvrir les fichiers tif en mosaïque. Sélectionnez l'option Assemblage automatique de toute la mosaïque et choisissez les paramètres suivants : mode de recouvrement égal à la moitié, seuil d'assemblage égal à 0,90 et réduction du bruit égale à automatique.Si les critères de juxtaposition ne peuvent pas être satisfaits, effectuez un zoom avant et placez manuellement la vignette à la position souhaitée, puis cliquez sur Continuer tel quel. Exportez les données sous forme de fichier HTML ou de fichier tif unique. Incluez la taille finale du pixel et le nom du fichier afin de permettre des mesures ultérieures, puis analysez les données conformément au protocole écrit. Comme illustré ici, la nanotomie de sections cérébrales témoins révèle les caractéristiques ultrastructurales typiques du tissu nerveux du prosencéphale rostral, incluant des faisceaux de fibres olfactives, des noyaux neuronaux et des sous-compartiments neuronaux incluant des synapses.Ici, les structures subcellulaires comprennent différentes morphologies nucléaires et des foyers présents dans divers types cellulaires et organites, notamment l'appareil de Golgi, le réticulum endoplasmique, les mitochondries, les vésicules synaptiques et les densités post-synaptiques. De façon inattendue, les noyaux des cellules bordant le ventricule sont très denses en électrons par rapport aux autres cellules dispersées plus latéralement dans le cerveau. Chez les microglies, les noyaux présentent également des foyers sombres, probablement de l'hétérochromatine, qui sont absents dans les autres cellules du cerveau.Cette image provenant d'un microscope électronique à grande échelle d'une section coronale d'une larve de poisson zèbre subissant une ablation neuronale révèle des microglies phagocytaires. Des caractéristiques propres aux microglies des cellules de mammifères ont également été observées dans ces cellules, notamment un appareil de Golgi bien développé et de nombreuses inclusions telles que des lysosomes. Une fois maîtrisée, l'acquisition peut être réalisée en une journée, alors que le microscope électronique traditionnel prendra au minimum une semaine.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important qu'un opérateur de microscope joue un rôle crucial dans l'obtention d'images de haute qualité. Il ne s'agit pas simplement d'une technique où l'on appuie sur un bouton. Nous avons désormais appliqué la nanotomie non seulement au modèle de dégénérescence neuronale du poisson zèbre, mais aussi au marquage immunologique des cellules et à l'étude de tissus de mouches, de tissus humains et d'autres encore.Cette technique ouvre la voie à tous les chercheurs, quel que soit leur domaine. Ils peuvent consulter à nouveau les jeux de données en ligne sur nanotomy.org. Ensuite, ils peuvent explorer les altérations présumées, allant de l'échelle du nanomètre à celle du millimètre, ainsi que tous les modèles étudiés.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'appliquer la nanotomie à votre question de recherche et au système cellulaire ou tissulaire que vous étudiez. N'oubliez pas que la préparation des échantillons doit être réalisée uniquement par un professionnel en raison de l'utilisation de réactifs toxiques et des considérations éthiques, mais tout le monde peut essayer le site web nanotomy.org chez soi.

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In vivo Imagerie du cerveau entier de larves de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie à fluorescence tridimensionnelle

Découvrez la nanotomie par microscopie électronique à grande échelle pour étudier le cerveau de zebrafish sain et lésé. Cette méthode offre une résolution nanométrique pour l'analyse tissulaire complète en neurosciences.

Numérisation Transmission à grande échelle Electron Microscopy (Nanotomy) de santé et de blessés Zebrafish cerveau

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