Numérisation Transmission à grande échelle Electron Microscopy (Nanotomy) de santé et de blessés Zebrafish cerveau

L’objectif global de cette expérience de microscopie électronique à grande échelle ou de nanotomie est de définir les alternances du niveau macromoléculaire au niveau tissulaire, dans le cas d’aujourd’hui, dans le cerveau du poisson-zèbre en dégénérescence. La nanotomie peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des sciences de la vie. Par exemple, dans la neurodégénérescence et dans la recherche sur le diabète de type 1.

Le principal avantage de la nanotomie est qu’elle permet d’acquérir des informations non biaisées, allant des macromolécules, des organites, des cellules aux tissus. Cela permet la quantification et le partage des données en libre accès via nanotomy.org. Bien que la nanotomie donne un aperçu du maintien immunitaire et de la microglie dans le cerveau neurodégénératif du poisson-zèbre, elle est également appliquée à d’autres modèles de maladies, notamment la culture cellulaire, la souris et même les tissus humains.

En général, les scientifiques qui découvrent cette technique ont du mal car la quantité de données est écrasante. Cela peut être mille fois plus que ce que l’on obtient avec la MÉ traditionnelle. Après avoir fixé les larves de poisson-zèbre selon le protocole de texte, coupez les têtes larvaires rostralement au cerveau postérieur pour faciliter la pénétration de l’osmium. Placez les larves dans du tétroxyde d’osmium à 1 %, du ferrocyanure de potassium à 1,5 %, dans du cacodylate de sodium à 0,1 molaire et incuber sur de la glace pendant deux heures.

Ensuite, utilisez de l’eau distillée double pour rincer les embryons trois fois pendant cinq minutes à chaque fois. Avant l’intégration, les échantillons doivent être déshydratés dans une série d’éthanol. Pour enrober les embryons, après une nuit d’incubation dans de la résine époxy diluée selon le protocole de texte, retirez la résine diluée et utilisez de la résine pure pour la remplacer.

Incuber pendant 30 minutes, puis remplacer la résine une deuxième fois et incuber encore 30 minutes. Après avoir rafraîchi la résine une troisième fois, incuber à température ambiante pendant trois heures. Ensuite, incubez à 58 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Enfin, incubez à basse pression à température ambiante pendant une heure. Ensuite, sous un microscope de dissection, utilisez une aiguille ou un cure-dent pour orienter les têtes dans des moules d’enrobage plats en silicone disponibles dans le commerce. Ensuite, polymérisez la résine époxy à 58 degrés Celsius pendant la nuit.

Lorsque l’échantillon est complètement durci, utilisez des lames de rasoir pour enlever l’excès de résine du talon. Pour détecter le bon positionnement, utilisez un couteau en verre ou un histoknife en diamant sur un ultramicrotome pour couper des sections de larves semi-minces pour le bleu toluidine/fuchsine basique. Transférez les lames semi-fines sur des lames microscopiques en les prélevant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre dont l’extrémité a été fermée en la faisant fondre à la flamme.

Sécher sur une plaque chauffante jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’eau. Ensuite, placez les échantillons dans du bleu de toluidine à 1 % dans de l’eau et incubez les sections sur une plaque chauffante pendant 10 secondes pour les colorer. Ensuite, après avoir utilisé de l’eau pour rincer les sections, utilisez du fuchsin basique à 05 % dans du tétraborate de sodium à 1 % pour colorer les échantillons pendant 10 secondes supplémentaires.

Avec un microscope optique normal de 10X à 40X, examinez les échantillons. Lorsque le site ou l’orientation appropriés sont atteints, utilisez des structures anatomiques facilement identifiables, y compris les fosses olfactives, les yeux ou les limites de la matière grise-blanche, pour identifier la région cérébrale d’intérêt lors de la section ultramince et pour ajuster l’angle de section lorsque l’échantillon est incliné. Continuez à sectionner le bloc de résine époxy avec un couteau diamanté pour couper des sections ultrafines de 70 nanomètres.

Montez chaque section sur une grille en cuivre à code-barres L2 par 1 à fente unique pour permettre une acquisition ininterrompue par des barres de grille. Un millimètre carré peut sembler petit. Il rentrera juste dans l’ouverture.

De cette façon, nous évitons que les barres de la grille bloquent notre échantillon. Réalisez que chaque artefact introduit dans notre échantillon sera enregistré par rapport à l’EM traditionnel. Comparez les échantillons avec des métaux lourds selon le protocole textuel et stockez-les dans une boîte de grille. Pour monter l’échantillon dans le microscope électronique à balayage, ou MEB, placez la grille de la boîte de transfert avec la section dans le porte-échantillon à grilles multiples et transférez-la dans la chambre du MEB.

Après avoir aligné le détecteur selon le protocole de texte, pré-irradiez l’échantillon en effectuant un zoom arrière afin que la zone complète à scanner s’adapte à la fenêtre de l’image. Une fois que l’ouverture a été modifiée à 120 micromètres et que l’image a été défocalisée, utilisez l’option de balayage de zone réduite pour rendre la zone numérisée aussi étroite que possible. Ensuite, réglez la fréquence d’images pour numériser le cadre en une à deux secondes environ.

Ensuite, zoomez au moins 100X et scannez une petite zone pendant 10 secondes. Si la luminosité de la zone change toujours, continuez la pré-irradiation. Lorsque cette zone ne change pas de luminosité par rapport à son environnement, la pré-irradiation est suffisante.

Lorsque vous effectuez la mise au point, sélectionnez la zone ou l’entité la plus claire et réglez la vitesse de numérisation de manière à ce que les détails soient visibles. Dans le logiciel du microscope, ajustez la luminosité et le contraste en regardant attentivement l’histogramme pour garder tous les pixels dans la plage dynamique. Faites de même pour les zones et les fonctionnalités les plus sombres.

Revenez à la zone claire et vérifiez à nouveau qu’il y a de l’espace des deux côtés de l’histogramme. Pour les étapes quatre, six à quatre, huit, le réglage de la luminosité et du contraste doit être effectué avec beaucoup de soin afin que toute la zone soit dans la plage dynamique. Faites un zoom arrière pour que la zone complète à scanner s’adapte à la fenêtre d’imagerie et lancez le programme d’acquisition de grandes surfaces.

Utilisez ensuite l’option de l’assistant pour configurer une mosaïque en sélectionnant une zone à l’écran. Utilisez une taille de pixel de deux à cinq nanomètres, en fonction des détails nécessaires, et réglez un temps de séjour de trois microsecondes pour la microscopie électronique à transmission à balayage, ou STEM. Appuyez sur optimiser pour vérifier les paramètres du microscope et le temps nécessaire s’affichera.

Ensuite, allumez à nouveau le générateur de balayage externe et appuyez sur continuer. Pour analyser les données STEM, ouvrez un programme de visualisation de fichiers EM à grande échelle et ouvrez le fichier appelé mosaic info, qui ouvrira les fichiers tif en mosaïque. Choisissez l’option Assembler automatiquement toute la mosaïque et choisissez les paramètres suivants :le mode de chevauchement est égal à la moitié, le seuil d’assemblage est égal à 0,90 et la réduction du bruit est égale à automatique.

Si les critères d’assemblage ne peuvent pas être remplis, zoomez et placez manuellement la tuile en position, puis cliquez sur Continuer en l’état.Exportez les données sous forme de fichier HTML ou de tif unique. Incluez la taille finale des pixels et le nom du fichier pour activer les mesures ultérieurement, puis analysez les données selon le protocole texte. Comme le montre ici, la nanotomie des sections du cerveau de contrôle révèle des caractéristiques ultrastructurales typiques du tissu neural du cerveau antérieur rostral, y compris les faisceaux de fibres olfactives, les noyaux neuronaux et les sous-compartiments neuronaux, y compris les synapses.

Ici, les structures subcellulaires comprennent différentes morphologies nucléaires et foyers dans différents types de cellules et d’organites, notamment l’appareil de Golgi, le réticulum endoplasmique, les mitochondries, les vésicules synaptiques et les densités post-synaptiques. De manière inattendue, les noyaux des cellules qui tapissent le ventricule sont très denses en électrons par rapport aux autres cellules dispersées plus latéralement dans le cerveau. Dans la microglie, les noyaux présentent également des foyers sombres, peut-être de l’hétérochromatine, qui sont absents dans d’autres cellules du cerveau.

Cette image d’une EM à grande échelle d’une coupe coronale chez une larve de poisson-zèbre subissant une ablation neuronale révèle une microglie phagocytaire. Des caractéristiques caractéristiques de la microglie dans les cellules de mammifères ont également été trouvées dans ces cellules, y compris un appareil de Golgi proéminent et de nombreuses inclusions telles que les lysosomes. Une fois maîtrisée, l’acquisition peut se faire en une journée, là où la MÉ traditionnelle vous coûtera au moins une semaine.

Lors de cette procédure, il est important qu’un opérateur de microscope joue un rôle crucial dans l’obtention d’images de haute qualité. Il ne s’agit pas seulement d’une technique d’appui sur un bouton. Nous avons maintenant appliqué la nanotomie non seulement au modèle de dégénérescence neuronale du poisson-zèbre, mais nous l’avons également utilisée pour l’immunomarquage des cellules et pour étudier les tissus des mouches, les tissus humains, etc.

Cette technique ouvre la voie à tous les chercheurs dans n’importe quel domaine. Ils peuvent consulter les ensembles de données en ligne sur nanotomy.org. Ils peuvent ensuite explorer des altérations présumées, allant de l’échelle nanométrique à l’échelle millimétrique et tous les modèles étudiés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’appliquer la nanotomie à votre question de recherche et au système cellulaire ou tissulaire que vous étudiez. N’oubliez pas que seul un professionnel devrait faire la préparation des échantillons en raison des réactifs toxiques et des considérations éthiques, mais tout le monde peut essayer le site Web nanotomie. org à la maison.